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1 トリ白血病ウイルスの精度の高い 清浄化システムの開発 担当機関名株式会社後藤孵卵場 研究期間平成 14 年度 ~16 年度 Ⅰ.3 ヶ年の研究成果の要約 1. 技術開発課題の目的 トリ白血病ウイルス [ALV] は白血病 産卵低下 免疫抑制などをもたらす病原体で 種鶏を清浄化することによって養鶏場での被害をなくすことができる ( 生産性の向上 ) また 国産育種鶏を清浄化することができれば外国鶏との競争力も増大し 低迷する国産鶏のシェアが回復する ( 自給率の増加 ) さらに 国内各地で維持されている稀少種日本鶏の清浄化 ( 遺伝資源の保存 ) にも役立つ 本研究では 1 育種鶏の清浄化に利用可能な 精度の高い清浄化システムの開発と 2 清浄確認検査に利用可能な 特異性の高い抗体検査法 (ELISA) の開発を行う 2. 担当者 所属及び役職株式会社後藤孵卵場研究開発本部 本部長株式会社後藤孵卵場研究開発本部育種部 技術顧問株式会社後藤孵卵場研究開発本部育種部 課長株式会社後藤孵卵場研究開発本部育種部 部員株式会社後藤孵卵場研究開発本部業務部 課長株式会社後藤孵卵場研究開発本部品質管理部 技術顧問株式会社後藤孵卵場研究開発本部品質管理部病理診断室 室長株式会社後藤孵卵場研究開発本部品質管理部病理診断室 室員 氏名望月完二長谷部誠鈴木真也西松賢吾堤俊雄垣田慎一郎津久美清村田昌紀 3. 研究の実施場所 [ 本研究開発実施者 ] 株式会社後藤孵卵場中央研究所 姫研究所岐阜県各務原市那加柄山町 154 可児市下切

2 [ 委託研究機関 ] 独立行政法人農業 生物系特定産業技術研究機構動物衛生研究所感染病研究部病原ウイルス研究室茨城県つくば市観音台 岐阜養鶏農業協同組合種鶏部岐阜県各務原市須衛町 [ 共同研究機関 ] 独立行政法人家畜改良センター岡崎牧場愛知県岡崎市大柳町栗沢 1 岐阜県畜産研究所養鶏研究部岐阜県関市迫間 要約 トリ白血病ウイルス [ALV] の清浄化は 感染親鶏からの介卵性の垂直伝播及び育成段階での水平伝播を両面的に阻止することで達成可能である しかし ALV の垂直伝播動態 精度の高い摘発手法及び水平伝播阻止の要件等に関する充分な研究がなされていない 本研究では実用鶏に対する ALV 清浄化システムを開発することを目的として 平成 14 年度から 15 年度にかけて上記の課題に取り組みながら 併せて平成 15 年度から 16 年度には試作した清浄化システムを国産育種鶏群に適用し その有効性を検証した また全期間を通して ALV の亜群特異的な抗体を検出することのできる ELISA の開発を動物衛生研究所に委託した ALV 感染雌鶏の卵管内へのウイルス排泄推移を調べた結果 大部分のケースでは恒常的にウイルスを排泄しており 卵管内から採取した試料の検査で充分に摘発できることが明らかになった ただし 一部の感染雌鶏ではウイルス排泄が不安定 不規則であることを示唆する成績も得られたことから 感染雌鶏の完璧な摘発を目指すことは実用的ではないとの結論に至った 一方 感染母鶏の摘発漏れが発生した場合でも 幼雛時に糞便のウイルス検査を実施すれば 垂直感染雛を完全に摘発できることが証明された この際 通常の飼育ケージを細分化した分離飼育システムを用いて育成すれば 垂直感染ひなによる水平伝播を最小限に食い止めることができることも明らかとなった 本研究成果に基づいて構築した清浄化システムは 3 世代にわたる試験的なシステム導入の結果 90% 以上あった ALV 抗体陽性率をゼロにすることができた 最終的に確立された清浄化システムは 1 世代で ALV を清浄化できる可能性が非常に高いと考えられる 委託研究の ELISA 開発については 遺伝子組換え手法を用いた亜群特異的抗原の量産化が困難を極めるなど最終的には実用化の道は開かれなかったが PCR 及びフォーカス抑制中和試験等の手法を駆使してウイルス及び抗体の亜群型別を可能にした 2

3 Ⅱ.3 カ年の研究成果の本文 1. 技術開発課題の目的 トリ白血病ウイルス [ALV] は鶏に白血病 産卵低下 発育不良 免疫抑制を引き起こす病原体で 古くから広く鶏群を汚染している 本ウイルスは持続感染するレトロウイルスで 病原性のある外来性ウイルス (A,B,J 亜群 ) と 非病原性の内在性ウイルス (E 亜群 ) に分けられている 本病にワクチンはなく 対策の基本は 外来性ウイルスの清浄化 である 本ウイルスは 母鶏から雛へ垂直伝播する また 垂直感染した雛から同居雛へ水平伝播する この水平伝播は同居させなければ起こらない そこで 垂直伝播を起こさない親鶏を選抜することによって垂直感染を断ち 非感染雛を汚染雛と分けて飼育することによって水平伝播を絶つことができれば 種雛は清浄化される 一旦清浄化されれば 本病は完全になくなる 本研究では 多品 種 多羽数からなる鶏を清浄化するために 1 採取法 採取器具の開発 2ウイルス増殖の変動の解明 3 伝播鶏の摘発効率の分析 4 分離飼育システムの確立 5 清浄化の難易度分析を行い 最終的に 垂直伝播阻止何をどう採材すればいいのか? 雌親 雄親 1 採取法 採取器具の開発汎用性はあるのか? いつ採材してもいいのか? 5 清浄化の難易度分析 水感染ひな平完全なプログラムを目指して 3 伝播鶏の摘発効率の分析伝6 実用原々種鶏の播清浄化同居ひな阻ケージ間での伝播は起こらない? 止4 分離飼育システムの確立 2 ウイルス増殖の変動の解明 ニワトリの系統 ALV 汚染度 いつ採材すればいいのか? 図 1 システム構築のための解明すべき課題 は 6 実用原々種鶏の清浄化システムの開発を目的にしている [ 図 1] 2. 技術開発課題の内容 (1) 技術開発の実施に必要な事業ア. 基礎となる試験研究の概要及び技術開発の目的 後藤孵卵場は動物衛生研究所と共同で トリ白血病ウイルスを垂直伝播する母鶏を摘発する方法に関する研究において 平成 13 年からウイルス検査法の技術移 3

4 転と清浄化計画のすり合わせを済ませ 卵管のウイルス検査による伝播鶏の摘発効率の検討を開始している 後藤孵卵場では 1960 年頃から国産鶏を改良作出し 生産販売している また 各都道府県では 地場産業育成事業として おいしい地鶏 の開発を進めており その候補鶏は 50 種にのぼる これらの国産鶏 地鶏における ALV の汚染状況は不明であるが 清浄化の取り組みがされていないことから 汚染の程度は高いと考えられ 薩摩地鶏などのように本病で大きな被害を受けたものもある また 近年 国産肉用鶏において J 亜群のウイルスによる白血病が大きな問題となっている ところが 海外で清浄化に使われている方法は ELISA を用いた卵白や総排泄孔の拭い液 ( クロアカスワブ ) のウイルス抗原検査である この方法は簡単な反面 特異性と感度が低く より信頼性が高く短期間に清浄化できる技術の開発が強く求められている 本研究では 鶏一般に利用可能な精度の高い清浄化技術と 簡易な汚染調査法及びモニタリング法を開発することによって 鶏白血病問題を根本から解決する基盤を確立することを目的とする イ. 技術開発の内容 イ-1 伝播鶏の摘発効率の分析 ALV 抗体陽性のウイルス排泄及び非排泄鶏 及び SPF 鶏 ( 日生研 ; ライン M;C/O) の 5 日齢種卵に動物衛生研究所より分与された A 亜群ウイルス標準株 [RAV-1] を約 virion 卵黄嚢内接種した 各群にウイルス無接種卵を用意し対照群とした 孵卵 15 日目に漿尿液を採取しウイルス分離を行った また 孵化後は群別に隔離飼育し 2 4 及び 8 週齢時にクロアカスワブを採取してウイルス分離を実施した イ-2 ウイルス増殖の変動の解明卵管拭い液 ( 膣スワブ ) で ALV が分離された個体 ( ウイルス排泄鶏群 ) 及び分離されなかった個体 ( ウイルス非排泄鶏群 ) 各 23 羽の雌成鶏を対象にして 連続 15 週間にわたって卵管液のウイルス分離を実施した また 鶏への強いストレスがウイルスの体内変動を誘発するかどうかを調べるため 養鶏場で産卵性回復のために常用される絶食操作 ( 強制換羽 ) を試験期間途中に行った イ-3 採取法 採取器具の開発 ALV 排泄鶏を対象にして 1 膣部の綿棒による拭き取り ( 膣スワブ ) 2 子宮部の綿棒による拭き取り ( 子宮スワブ ) 及び3 卵管貯留液の 3 種類の検体を採取した [ 図 2] 検体は 4000rpm 5 分間の冷却遠心処理後 その上清をウイルス培養に供した ウイルスの培養及び ELISA 検査に関する方法は 塚本の研究報告に従って実 4

5 施した ELISA 判定はマイクロプレートリーダーを使用し 490 及び 620nm の二波長で吸光度を測定した 卵巣 3cm 卵子 ロート部 7cm 卵子補足 3 卵管貯留液 イ-4 分離飼育システムの確立イ-4-1 試験鶏 :1SPF 鶏 ( 日生研 ; ライン M;C/O) 及び2ALV 移行抗体 (+) 鶏イ-4-2 ウイルス接種 :ALV-A 亜群 RAV-1 株および J 亜群 RAV-103 株を培養細胞で増殖させたものを約 / 個に調製し 5 日齢発育鶏卵の卵黄嚢内に接種した イ-4-3 分離飼育 :90cm(W) 50cm(D) 40cm(H) の飼育ケージを金網で 3 分割したものを試験群の 1 単位と して各区画にそれぞれ 7 羽の試験鶏を収容した 各区画の中央にウイルス接種鶏をその右側に SPF 鶏 左側に移行抗体 (+) 鶏を配置した [ 図 3] 一部の試験群では 金網の 膨大部 35cm 卵白 峡部 10cm 卵殻膜 子宮部 10cm 卵殻 膣部 10cm 表皮 クロアカ 図 2 生殖器模式図と採材方法 2 子宮スワブ 1 膣スワブ 抗体 + 接種 SPF 抗体 + 接種 SPF (3:1:3) (3:1:3) 通常の飼育ケージ仕切り板設置 抗体 + 接種 SPF 抗体 + 接種 SPF 図 3 分離飼育システム試験鶏群の収容配置 括弧内の数字は収容羽数を示す 下部にプラスチック製の仕切り板を設置した イ-4-4 試験群 :1ウイルス株 A 及び J 亜群 (2 群 ) 2ウイルス接種羽数 1 羽および7 羽 (2 群 ) 3 仕切り板の有無 (2 群 ) をそれぞれ組み合わせた計 8 種類の試験群を設けた 初生ヒナより定期的に個体毎のウイルスおよび抗体検査を行い ケージ間の水平伝播の有無を 12 週齢まで調べた イ-5 清浄化の難易度分析上記イ-1 から 4 で得られた成果を元にして 以下のような清浄化システムを立案し ALV 汚染度の異なる自社保有原々種鶏の 3 鶏種を対象にして試験的に運用した 1) 垂直伝播を阻止するために 種卵採取前の親鶏のウイルス検査を 1~2 回実施し ウイルスが分離された個体は淘汰し交配には使用しない 2) 水平伝播を阻止するために 幼雛期にウイルス検査を 1~2 回実施し ウイルスが分離された個体を含む同一ケージ内の鶏をすべて淘汰する 清浄化システム運用前後の抗体陽性率を比較することにより 本システムが ALV 汚染度及び鶏種を問わず有効に機能するかどうかを検証した 5

6 イ-6 実用原々種鶏の清浄化これまでに得られた本事業の成果に基づき清浄化システムを構築し 平成 16 年から 17 年にわたって白色レグホーン系原々種鶏に対して清浄化を 2 回実施した イ-6-1 対象鶏 : 平成 16 年及び 17 年春餌付の白色レグホーン系実用原々種鶏イ-6-2 導入した清浄化システム ⅰ) 親鶏の ALV 検査 : 交配予定の雌雄を各 1~2 回検査した 雌は膣スワブを 雄は精液またはクロアカスワブを採取してウイルス分離に供した ALV 陽性の個体は交配には使用せず淘汰した ⅱ) 育成鶏の ALV 検査 :ALV が分離されなかった雌雄親鶏を交配して得られた種卵から発生した個体は 幼雛時に糞便プール試料を用いてウイルス検査を 1~2 回実施した プール試料で ALV 陽性であった場合は 同一ケージ内で育成されていた鶏をすべて淘汰した ⅲ) 育成鶏の ALV 抗体検査 : 清浄化の確認のため 100~120 日齢で残存個体すべての血清を採取し ELISA による抗体検査を実施した なお 抗体が陽性であったサンプルはフォーカス抑制中和試験を行った イ-7 清浄化技術の確立実用原々種鶏の清浄化を実施した結果から 必要最小限の作業プログラムに絞った効率的で精度の高い清浄化システムの確立を目指した イ-8 血清亜群型別法の開発 [ 委託研究 ] イ-8-1 ALV 亜群特異的領域の遺伝子単離と組換え蛋白質の発現亜群特異的領域と その領域を含む外皮蛋白質である gp85 蛋白全体をそれぞれ単離し Bac to Bac 及び Bac N Blue バキュロウイルス発現システムにより組み換え抗原の発現を試みた イ-8-2 ウイルス型別法の開発 i) 外来性 ALV-A 及び B 亜群の亜群特異的なペプチド領域を選定し 常法によりウサギに免疫しペプチド抗体を得た ii) ALV 精製抗原に対するモノクローナル抗体を作製し 反応性を調べて亜群特異的なモノクローナル抗体を選定した iii) モノクローナル抗体と精製 ALV ウサギ IgG 及びペプチド抗体を用いて ALV 亜群型別法の開発を行った iv) ALV 亜群型別プライマーの設計を行った 6

7 イ-8-3 抗体型別法の開発 i) イ-8-2 で選定したペプチド抗原 ペプチド抗体及びモノクローナル抗体を用いた抗体型別法の開発を行った ii) 従来法であるフォーカス抑制中和試験の調整を行った ウ. 技術開発の実施結果 ウ-1 伝播鶏の摘発効率の分析垂直感染した雛の摘発法を確立するために 種卵にウイルスを接種し孵卵中及び孵化後に経時的にウイルス分離を行い その摘発効率を調べた [ 表 1] その結果 SPF 種卵にウイ ルスを接種した群では 孵卵 15 日目の漿尿液の分離率は 66.7% であったが 2 週齢以降のクロアカスワブの分離率は 100% であった ウイルス排泄及び非排泄 表 1 垂直伝播鶏の摘発効率の分析 種卵 + SPF - 抗体 (+) + 排泄 (+) - 抗体 (+) + 排泄 ( - ) - 孵卵 15 日目ウイルス漿尿液接種陽性率陽性数 (%) 12/ /18 8/16 5 1/ /10 3 0/10 2 週齢 4 週齢 8 週齢 クロアカスワブ クロアカスワブ クロアカスワブ 陽性数 陽性率陽性率陽性率陽性数陽性数 (%) (%) (%) 17/ / / /18 1/ /18 6/ / / / / / / / / /8 0/8 0/8 鶏の分離率が SPF 鶏のそれと比べて低かったが このことは接種したウイルスの生存 増殖に対して ALV の移行抗体が影響したものと推察された 本試験の結果から 親鶏のウイルス検査で摘発漏れが発生した場合でも 2 週齢以降の育成鶏のクロアカスワブを検査することで 垂直感染鶏を摘発できると考えられた ウ-2 ウイルス増殖の変動の解明ウイルス排泄鶏群の卵管液からのウイルス分離を 15 週間行った結果 強制換羽期間を除いて ウイルス分離率は平均 80% 以上と高率であった [ 図 4] 一方 ウイルス非排泄鶏群では 全個体とも強制換羽期間を含めた全期間を通じてウイルスはまったく分離されなかった 以上の結果から ウイルス排 2.0 分離率 (%) OD 平均値強制換羽 分離率 (%) ( 週 ) 図 4 ウイルス増殖の変動の解明 ( ウイルス排泄鶏群 ) OD 値 7

8 泄鶏の大部分は比較的安定して卵管内にウイルスを排泄しており その逆に膣スワブのウイルス検査が陰性であれば 垂直伝播を起こす可能性は低いことが示唆された また 鶏に強いストレスを加えるとウイルスの体内増殖が誘発されることを想定していたが 強制換羽期間中は期間前後と比較してウイルス分離率が低かった これは絶食操作による卵管の萎縮が卵管液の減少をもたらし このことがウイルス分離率を低下させたものと推察される ウ-3 採取法 採取器具の開発ウイルス培養用検体の採取方法による検出感度を比較した その結果 膣スワブ及び子宮スワブと比較して 卵管貯留液のウイルスの検出率及び ELISA の OD 値が有意に高かった [ 表 2] このことから卵管貯留液がウイルス培養用検体として最適であると思われたが 卵管貯留液は表 2 採取法 採取器具の開発少量ずつ卵管内 N 検出率 (%) 平均 OD 値有意差に貯留されてゆ膣スワブ なしくことが明らか子宮スワブ になり ( データ未膣スワブ あり提示 ) 必要量を卵管貯留液 任意に採取する子宮スワブ ありことができなか卵管貯留液 った また 卵管貯留液を採取するためには特殊な器具を使用する必要があり このことが鶏に対して過度のストレスを与える結果となり 産卵が一時的に停止するなどの育種上望ましくない影響を及ぼすことも明らかとなった 以上の結果から ウイルス分離材料としては卵管貯留液が最適であることが判ったものの 実用性の観点からは膣スワブで代用することが賢明であるとの結論に達した ウ-4 分離飼育システムの確立ウイルス接種鶏のいるケージから隣接するケージ内の非感染鶏へ ALV の水平伝播が起こるかどうかを初生ヒナから 12 週齢まで調べた 1) ウイルス接種鶏 1 羽と同一ケージ内で飼育された SPF 鶏では 4 週齢頃より感染抗体の上昇が見られ 感染初期にはウイルス排泄も確認された また 同一ケージ内で飼育された移行抗体 (+) 鶏でも 移行抗体が消失する 4 週齢頃より同様の感染抗体の上昇が認められた 2) 試験群毎の隣接ケージへの水平伝播の有無を表 3 に示した 隣接ケージへの水平伝播が認められたのは 仕切り板が設置されていなかったケージのみであっ 8

9 た 表 3 水平伝播確認試験 試験群 ウイルス株 接種羽数 仕切り板 水平伝播 1 A 1 あり なし 2 A 1 なし なし 3 A 7 あり なし 4 A 7 なし あり 5 J 1 あり なし 6 J 1 なし あり 7 J 7 あり なし 8 J 7 なし なし 3) 水平伝播により感染した個体は 抗体の上昇が認められたものの 試験期間中に恒常的なウイルス排泄鶏に転化することはなかった ウ-5 清浄化の難易度分析清浄化システムを試験的に運用した際の 清浄化前後の抗体陽性率の変化を図 5 に示した 清浄化前の汚染度が低かったホワイトロック [WR] では 17.0% から 7.1% に 汚染度が中程度であったロードアイランドレッド [RIR] では 49.2% から 13.3% に 最も汚染度の高かった白色レグホーン [WL] では 86.6% から 3.8% に減少した 以上の結果から 清浄化システムは ALV 汚染度及び鶏種に関係なくあ る程度有効に機能することが示唆された 抗体保有率 (%) 低 [WR] 中 [RIR] 高 [WL] 清浄化前清浄化後 図 5 清浄化の難易度分析 ( 清浄化前後の ALV 抗体陽性率の推移 ) ウ-6 実用原々種鶏の清浄化清浄化の難易度分析 ( イ ウ -5) で試験的に運用した清浄化システムに更なる改良を加えたものを運用した 本試験で清浄化の対象とした白色レグホーン系原々種は 母系が 2 系統存在し隔年使用であるため 2 年間連続して清浄化を図った [ 図 6] ウ-6-1 第 2 回清浄化実施結果 9

10 当該年使用の親鶏雄は第 1 回清浄化を試験的に実施した鶏群なので 親鶏雌と比較して抗体陽性率が低くなっていた また ALV 分離率が雌 5.8% 雄 0% の鶏群からウイルスが分離されなかった親鶏を選抜して次世代を作出したが 垂直伝播による育成鶏の ALV 分離率は約 5% であった しかし これらの陽性鶏群を 鶏群世代 Ⅰ 世代 Ⅱ 第 1 回清浄化第 2 回清浄化 年第 3 回清浄化世代 Ⅲ 度陽性率 (%) ウイルス抗体 世代 Ⅳ 図 6 実用原々種鶏の清浄化 現時点では育成鶏の検査結果しかない 淘汰した結果 本鶏群の成鶏時の ALV 分離率は 0% になった ウ-6-2 第 3 回清浄化実施結果当該年使用の親鶏雌は第 1 回清浄化を試験的に実施した鶏群で 親鶏雄は前年に清浄化を実施した鶏群である 親鶏の ALV 分離率及び抗体陽性率は既にかなり低い数値になっており 清浄化システム運用後の育成鶏にはウイルスが分離される個体は完全にいなくなっていた また 中和試験の結果から中和抗体陽性鶏も皆無の状態になった ウ-7 清浄化技術の確立本事業の成果から トリ白血病ウイルスの精度の高い清浄化システムに必要な要件を図 7 に示したが 重要度が高いと考えられるものを大きな文字で表現した 実用レベルでは 育成鶏のウイ ルス検査と水平伝播による被害を最小限にする分離飼育装置の導入が最も重要である 親鶏のウイルス検査による摘発 淘汰は垂直伝播の危険性を減少させる効果から 抗体陽性率の高い鶏群に対しては有効な方策と位置付けられる また 清浄化後 高対象鶏群の ALV 抗体保有率調査低ウイルス排泄母鶏の摘発 淘汰 育成鶏のウイルス検査 分離飼育清浄化確認のための ALV 抗体検査図 7 実用的な清浄化システムの確立 の抗体検査はシステムの精度管理上からは必須の項目であり 全数検査ができない場合でも抽出検査で確認すべきであると思われる 10

11 ウ-8 血清亜群型別法の開発 [ 委託研究 ] ウ-8-1 ALV 亜群特異的領域の遺伝子単離と組換え蛋白質の発現 Bac to Bacバキュロウイルス発現システムにより組換え抗原の発現を試みた 設計した7 種類の発現ベクターはすべてウイルスに組み込むことができたが 組換え抗原の発現が確認できたクローンは2クローンのみであった (enva- MBP- control) そこでBac N Blue バキュロウイルス発現システムにより 再度亜群特異的領域とその領域を含む 外皮蛋白質であるgp85 蛋白全体を発現させることを試みた Bac N Blueシステムにおいても発現ベクターはすべてウイルス 中和抗体結合部位 レセプター結合部位 gp bp SDS-PAGE Western Blotting 発現部位 300bp M M M M Cell Bac to Bac システム Bac N Blue システム 2 MBP MBP 3 A- Env-A 1 4 Cell 6 -A Env-A 4 B- Env-B MBP MBP 7 -B Env-B 3 A- Env-A 9 -B MBP Env-A 図 8 組換え抗原の分析 に組み込むことができ 抗 抗体を用いたWestern Blottingにより組換え抗原の発現分析を行った結果 Bac to Bacシステムで発現が確認できたクローンに加え 3クローン (-enva -envb MBP-envA-) で抗原の発現が確認できた ( 図 8) これらのクローンを用いて抗原の収量を上げる調整を行いSDS-PAGEで発現量を確認したが バンドが確認できたクローンはcontrolのMBP-のみであった さらに 鶏免疫抗 A LV 抗体を用いたWestern Blottingによる反応を試みたが 前記同様にバンドは認められなかった 以上の結果から バキュロウイルス発現システムではEnv 蛋白の特異的領域を発現することはできるが 実用化に充分な抗原量を得ることができないことが明らかとなった ウ-8-2 ウイルス型別法の開発ウ 常法により選定したペプチドをウサギに免疫し 抗ペプチドウサギ免疫血清を得た 得られた免疫血清に対して ALV 精製抗原にて亜群特異的な反応が見られるかどうかを確認した その結果 ALV-A 精製抗原特異的に反応する抗 SR A 抗体及びALV-B 精製抗原特異的に反応する抗 B2 抗体の2つのウサギ免疫血清が選定できた ( 図 9) しかし 選定した免疫血清はIgG 精製等を行うと反応性が低下したため ELISA 用抗体として利用することができなかった 11

12 ウ ALV 精製抗原に対する複数のモノクローナル抗体を作製し それぞれの反応 性をALV 精製抗 原にて確認した 抗 SRA 抗 RAV1 その結果 ALV- A 精製抗原特異的に反応するモノクローナル抗体としてA1 A9 及びALV-B 精製抗原特異的に反 応するモノクロ 図 9 ペプチド抗体の選定 ーナル抗体としてB1 B2の各 2 種類を選定できた ( 図 10) ウ 上記で選定した抗ペプチドウサギ免疫血清 モノクローナル抗体を組み合わせた抗原検出 ELISAの 検討を行ったが ALV- A 培養上清を亜群特異的に検出することはできなかった ( 図 11) ウ ALV-A 及びBを特異的に検出可能なプライマーの設計を行い それらのプライマーを用いて各ウイルス標準株 を特異的に増幅できるかどうかを確認した それにより A 亜群について 1 セット B 亜群については2セットのプライマーセットが選定できた 次に 各種鶏群の清浄化過程で分離されたウイルス株からRT-PCR によりcDNAを作製し それをテンペレートとしてそれぞれのプライマーでPCRを A1 A9 抗 B1 抗 B2 抗 B3 精製抗原 A B A B 図 10 モノクローナル抗体の選定 精製抗原抗 SRA A 亜群特異的抗 B2 B 亜群特異的ウイルス中和活性抗 SRA 陰性抗 B 2 陰性精製抗原ペプチド抗体ラベル抗体 B1 精製抗原 A1 A9 A 亜群特異的 B2 B1 B2 B 亜群特異的精製抗原モノクローナル抗体ラベル抗体 培養上清抗ペプチドウサギ免疫血清 0 00 原液 0 原液モノクロ抗体 : 培養上清 : 原液,, 0 抗ペプチド血清 :, 500, 2000 ラベル抗体 :HRPO ウサギ血清 0 A1 B1 A1 B1 A1 B1 モノクローナル抗体 (x200) 図 11 抗原検出用免疫血清 行った 上記と併行して ALV 共通プライマーを用いた PCR を行い 増幅産物の 12

13 シークエンスにより亜群を特定した シークエンスの結果からA 亜群と特定された野外分離株の大部分は 選定したA 亜群特異的プライマーでのみ増幅された 一方 A 亜群特異的プライマーで増幅されなかった1 株は B 亜群特異的プライマーで増幅され シークエンスの結果もB 亜群に合致した ウ-8-3 抗体型別法の開発ウ ペプチド抗原 ペプチド抗体を駆使して様々な抗体型別法を試みたが 良好な結果は得られなかった モノクローナル抗体とALV 精製抗原を用いたサンドイッチEL ISAでは ALV 精製抗原のみを用いた従来法と比較して交差反応が減少することが確認できた ( 図 12) 免血希釈 ,3,5: 抗 ALV-A 鶏血清 2,4,6: 抗 ALV-B 鶏血清 7,8,9,10:SPF 血清 1000 従来法精製抗原 サンドイッチ ELISA モノクロ抗体 1-4 レーン : 従来法 5-10 レーン : サンドイッチ ELISA 免疫血清 ラベル抗体 図 12 モノクローナル抗体を用いた抗体検出 ELISA の検討 ウ 遺伝子組換え技術を利用した抗体検出 ELISAの開発は 事業期間内での完遂が困難であると判断し 既存技術であるフォーカス抑制中和試験の応用化に転換した エ. 考察 トリ白血病ウイルスの感染様式に焦点を当て 垂直伝播鶏及び垂直感染ヒナの摘発方法また摘発漏れによる水平伝播の阻止対策など 育種鶏を清浄化するために必要な各種要件を3カ年にわたって調べてきた ALVに関しては多くのことが明らかにされている反面 不明な点も数多く残されている 本研究では これらの不明な点をひとつひとつ明らかにしながら清浄化システムを開発しなければならなかった また 構築した清浄化システムを実用原々種鶏に適用しその有効性を検証するためには 育種の世代更新サイクルに合わせて実施するしか手立てはなく 実質的には1 年に1 回しか検証の機会はなかった それゆえ 研究課題の基礎的な試験を行いながら そこから得られた成果を迅速にシステムに反映させる必要に迫られた 振り返ってみれば 本研究テーマを3 年間の事業とするには多 13

14 少不向きであったかも知れない しかし 研究成果の中には初めて確認された事象もある たとえば 父鶏のALV 陽性率が高くても 母鶏の陽性率が低ければ垂直伝播が起こりにくいこと その逆のケースでは垂直伝播が起こりやすいことなどである 他にも ウイルス排泄が不安定 不定期な個体では 摘発漏れを起こすような可能性が高いこと等が挙げられる 最終的には3 年間に得られた成果を集積し 実用的で精度の高い清浄化システムが開発できたと確信している 抗体の亜群型別法の開発に関しては 外来性ウイルス抗体と特異的に反応すると予想される領域の変更 また バキュロウイルス発現系の変更を行いながら組換え抗原の発現は達成できた しかし 抗原を精製するための充分量を発現させることができず 本手法を用いた開発を断念した ただし 試験を行ったいずれの発現系においても コントロール抗原は発現できていることから (SDS-PAGEで確認可) 目的とする領域が適切に選択されれば開発の道が開かれる可能性は残されている 一方 ウイルス亜群型別法の開発は P CR 手法を用いて型別が可能であることを確認できた オ. まとめ 本研究成果に基づいて構築した清浄化システムは 2 世代にわたる清浄化システム導入の結果 90% 以上あった ALV 抗体陽性率をゼロの状態にすることができた 最終的に確立された清浄化システムは 運用上のミスが発生しない限りにおいては 1 世代で ALV を清浄化できる可能性が非常に高いと考えられる 委託研究の ELISA 開発は 遺伝子組換え手法を用いた亜群特異的抗原の量産化が困難を極め 最終的には実用化の道は開かれなかった トリ白血病ウイルスの精度の高い清浄化システムの完成 は様々な波及効果をもたらすことが期待される 簡潔に以下に列記する 1) 多系統 多羽数からなる国産鶏 地鶏を清浄化し 生産性を向上させることができる これにより外国鶏との競争力が増し 国内自給率の向上及び地域の活性化と雇用の拡大に貢献できる 2) 動物用生ワクチンの製造の一部及び生物学的製剤の検定には SPF 種卵が使用されている しかし 国内で維持されている既存の SPF 鶏は近親交配により生産性が極端に低下している現状にある そこで ALV を含めて介卵感染する病原体すべての清浄化が図れれば 生産性の高い鶏種 系統での SPF 種卵の生産が実現可能となる また インフルエンザ等のヒト用生ワクチンの製造には通常の種卵が用いられているが 将来的にはより高品質のものへの転換を要請される可能性もあり そうなれば SPF 種卵の需要は益々高まってくる 一方 ALV の清浄化それ自身を事業化するためには解決すべき課題がいくつかある 本事業で開発した清浄化システムには 高度な技術と清浄化対象鶏群を飼養す 14

15 る大規模な鶏舎設備を必要とする 後藤孵卵場は本事業の遂行と併行して ( 独 ) 家畜改良センター岡崎牧場及び岐阜県畜産研究所養鶏研究と本事業テーマでの共同研究を展開していた 岡崎牧場には関連するすべての技術移転を行い 独自に清浄化できる道筋がついた 岐阜県は検査以外の部分をすべて自前で行っている しかし 両者とも本格的な研究機関であるから独自に実施できるのであり 技術を移転すればどこでもできるというシステムではない よって 先に述べたような民間で維持されている鶏群を清浄化するためには受託事業とする以外の道はないと思われる 清浄化システムを受託可能な事業にするためには 専用の鶏舎を増設する等の新たな設備投資が必要となってくる しかし 民間で受託事業化するためには 採算性の面で委託側との折り合いをつけることが難しいと予想される この問題の解決策として 種卵を受け取り孵卵期間中に陽性個体の摘発 淘汰を行い ALV フリーヒヨコのみを委託側に返す方法が考えられる 本研究中にこの手法に関する付加的な試験を行って一定の知見は得られたが 検討すべき課題は残されている カ. 特許出願 学会発表等 ( ア ) 工業所有権等現段階では取得の予定なし ( イ ) 学会発表等本研究成果は順次学会及び論文で発表予定である 15

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