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ひでたつひがき
5 years ago
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1 LAAN-D-MS007 GC/MS を用いた緑茶葉中代謝物のプロファイリング GC/MS Application Note No. 4 GC/MS Metabolomics & Life Science Project (Yuki Sakamoto, Katsuhiro Nakagawa, Haruhiko Miyagawa, Shuichi Kawana, Shinji Fukumoto) Tairo Ogura Abstract お茶の品評会で順位付けされた 9 種の高級緑茶葉から代謝物を抽出し GC/MS で測定しました測定結果を多変量解析しスコアプロットとローディングプロットより順位を特徴付けていると推測される化合物を確定しましたまた PLS 回帰分析によって順位を予測するためのモデルを作成することができました Keywords: GC/MS, food, metabolomics, green tea leaves, amino acids, organic acids, sugars はじめにメタボローム解析 ( メタボロミクス ) は代謝物を網羅的に解析する方法であり医療分野における診断マーカー探索や病因解析製薬分野における薬効や毒性を示すバイオマーカー探索食品分野における品質管理予測など幅広い分野へ適用されています [1] メタボローム解析には GCやLCなどのクロマトグラフに質量分析計を接続したさまざまな複合分析装置が用いられていますなかでも GC/MSは他のクロマトグラフィーに比べ分離能に優れ化合物にごとに特異的なマススペクトルが得られるため多くの代謝物を分離検出するのに適していますまたマススペクトルと保持時間を基準化した保持指標をデータベース化することによって代謝物の同定が容易になります GC/MSをメタボローム解析へ適用することの有効性を検証するために弊社のGCMS-QP2010 Plus とUmetrics 社の多変量解析ソフトウェアSIMCA-P を用いてお茶の品評会での順位とそれに寄与する緑茶葉の成分および品評会での順位を予測するためのモデルについて検討しました実験試薬リビトールをミリQ 水に溶解し 0.2 mg/mlの濃度で調製し内標準としましたメトキシム誘導体化に使用するメトキシアミン溶液はメトシキアミン塩酸塩 ( 和光純薬工業株式会社 ( 大阪 )) をピリジンに溶解させ20 mg/mlの濃度で調製しましたトリメチルシリル (TMS) 誘導体化に使用するMSTFA(N Methyl N-trimethylsilyl-trifluoroacetamide) はGLサイエンス株式会社 ( 東京 ) から購入しました機器 GC/MSには島津 GCMS-QP2010 Plusをデータ処理にはGCMSsolutionをまたマススペクトルライブラリには NIST2008 年度版と島津 GC/MS 代謝成分データベースをそれぞれ用いました多変量解析にはUmetrics 社の SIMCA-Pソフトウェア (Ver ) を用いました

2 前処理品評会で順位づけされた9 点の緑茶葉を用いました 9 点の緑茶葉の選択は順位が5から45 位までの5の倍数の順位に相当するものとしました緑茶葉は既に報告されている前処理手順 [2] に従って処理をおこないましたまず緑茶葉試料 30 mgを液体窒素下で破砕し抽出溶媒の水 / メタノール / クロロホルム (1 / 2.5 / 1) 混合溶液 1 mlと内部標準のリビトールを添加しました充分にかく拌し遠心分離後液相を900 ulをはかり取りましたはかり取った液相にミリQ 水 400 ulを添加し 2 相 ( 水 / メタノール相とクロロホルム相 ) に分離させました遠心分離後水 / メタノール相 400 ulをはかり取りました次に減圧遠心分離してメタノールを溶液から除き次に凍結乾燥しました凍結乾燥した残渣をメトシキム誘導体化後トリメチルシリル (TMS) 誘導体化を行いGC/MS 測定用試料としましたそれぞれの緑茶葉試料を3 回づつ前処理を行いました GC/MSの分析条件をTable 1に示します緑茶葉試料 30 mg 抽出液 900 µl 上清 400 µl 残渣誘導体化試料液体窒素下にて破砕 1mL 水 / メタノール / クロロホルム (1/2.5/1) 混合溶液添加内部標準 ( リビトール ) 添加かく拌後遠心分離 400 µl MilliQ 水添加かく拌後遠心分離減圧遠心分離 ( メタノール除去 ) 凍結乾燥 200 µl メトキシアミン溶液 (20 mg/ml, ピリジン ) を添加 90 分間 30 で加温 100 µl MSTFAを添加 37 で30 分間加温 Fig. 1: Sample preparation flow chart Table 1: Analytical conditions Instruments GC/MS: Auto-injector: Column : GCMS-QP2010 Plus AOC-20i + s Rtx -5MS (30 m x 0.25 mm I.D. df=0.25 µm, Restek Corporation) Analytical Conditions GC Injection Temp.: 250 Column Temp.: 80 (2 min) (15 /min) (20 min) Injection Mode: Split Carrier Gas: He (Constant Linear Velocity) Linear Velocity: 36.8 cm/sec Split Ratio: 25:1 Injection volume : 1 µl MS Ion Source Temp.: 200 Interface Temp.: 250 Scan Range: m/z Event Time: 0.2 sec Scan Speed: 5000 u/sec 化合物の同定トータルイオンクロマトグラムとマスクロマトグラムを用いてピークを検出し検出されたピークはGC/MS 代謝成分データベースとNISTライブラリを用いて同定しました同定結果をもとに定量イオン確認イオン保持時間マススペクトルと保持指標を化合物ごとに化合物テーブルに登録しましたそのテーブルを用いて各成分を自動検出し検出された成分のピーク面積を自動計算し内部標準 ( リビトール ) の面積で除した値 ( 面積比 ) を算出しました多変量解析ケモインフォマティクス用ソフトウェアのSIMCA-P (Umetrics 社 ) で多変量解析を行いました

3 結果分析結果緑茶葉試料のトータルイオンクロマトグラムをFig. 2に示します約 100 成分の化合物が検出されました検出された成分を代謝成分データベースとNISTデータベースを用いて同定しましたその結果をTable 2に示します糖類アミノ酸類および有機酸類など71 成分を同定することができました (x10,000,000) 1.25 TIC Fig. 2: Total ion chromatogram of green leaf extract. Table 2: Identified compounds and their retention time ID Compound Name RT ID Compound Name RT 1 L-Alanine-2TMS Lyxose methyloxime-tms Oxalic acid-2tms Asaparagine-3TMS Malonic acid-2tms Lyxose methyloxime-tms Urea-2TMS 6.27 Ribitol-5TMS (IS) Serine-2TMS L-Glutamine-4TMS Methyl 5-oxo-2-pyrrolidinecarboxylate Xylonic acid-3tms Ethanolamine-3TMS Theanine L-Leucine-2TMS L-Glutamine-3TMS Phosphoric acid-3tms Shikimic acid-4tms L-Isoluecine-2TMS Citric acid-4tms L-Threonine-2TMS Caffeine L-Proline-2TMS Quinic Acid- TMS Glycine-3TMS Fructose-Methyloxime-5TMS Succinic acid-2tms Fructose-Methyloxime-5TMS Glyceric acid-3tms Glucose-Methyloxime-5TMS Fumaric acid-2tms L-Lysine-4TMS L-Serine-3TMS Mannose-Methyloxime-5TMS ,4-Bis[(trimethylsilyl)oxy]dihydro-2(3H)-furanone-2TMS L-Tyrosine-3TMS L-threonine-3TMS Benzoic acid-4tms L-Aspartic acid-2tms Gluconic acid-5tms Ketoglucose methyloxime-3tms Palmitic acid-tms Methylmaric acid-3tms Gluconic acid-5tms Arabino-Hexos-2-ulose-4TMS Inositol-6TMS Malic acid-3tms Galactose-Methyloxime-5TMS L-Aspartic acid-3tms Phosphoric acid propylester-4tms Pyroglutamic acid-2tms Stearic acid-tms aminobutyric acid-3tms L-Tryptophan-3TMS L-Norvaline-3TMS Xylopyranose-4TMS L-Threonic acid-4tms Glucose-6-phosphate-Methyloxime-5TMS Isopropylmalic acid-3tms Glucose-6-phosphate-Methyloxime-5TMS Glycerol-3TMS Glucoheptulose-Methyloxime-TMS Ornithine-3TMS Di-n-octyl phthalate L-Glutamic acid-3tms Maltose-8TMS Phenylalanine-2TMS Sucrose-8TMS Asparagine-4TMS Arabinopyranose-4TMS ,3,4,5-Tetrahydroxypentanoic acid-1,4-lactone-3tms Raffinose-8TMS 19.92

4 多変量解析主成分分析 (PCA) のスコアプロットを用い順位の異なる緑茶葉の差異を調べた結果をFig. 3に示します図中の数字は品評会での順位を表します主成分 1によって順位の高い緑茶葉と低い緑茶葉がグラフの左右に分かれており順位の差異が示されていることがわかりますまた R2とQ2はそれぞれ0.7505と0.6182でしたスコアプロットの結果をもとにローディングプロットを作成し順位と順位に関係している化合物を検討しましたその結果をFig. 4に示します図中の数字は化合物のID(Table 2) を示します品評会で順位の高い緑茶葉は Glutamine, ArabinopyranoseやCaffeine が多く含まれ一方順位の低い緑茶葉には Sucrose Theanine Quinic Acid FructoseやGlucoseが多く含有することを示唆する結果が得られました Factor Factor 1 R2X[1] = R2X[2] = Fig. 3 Score plot result of principal component analysis : Theanine 47: Quinic Acid 48: Fructose 50: Glucose 69: Sucrose Factor 順位の低い茶葉に寄与する成分 : Caffeine 43: Glutamine 順位の高い茶葉に寄与する成分 70: Arabinopyranose Peak ID R2X[1] = Fig. 4 Loading plot result of principal component analysis

5 PLS 回帰分析によって順位を予測するモデルを作成しデータを適用した結果をFig. 5に示します横軸にこのモデルの予測順位を縦軸に品評会の順位を示しています順位が5,10,20,30,40と45 位のデータをトレーニングセットとしてモデルを作成しました R2Y,Q2とRMSEEはそれぞれ0.9766, と2.3879でした次にそのモデルに 15,25と35 位のデータを適用して順位を予測しましたテストセットから計算されたRMSEPは4.5584でしたこれらの結果からこのモデルを順位の予測に適用できる可能性が示唆されました 50 y=0.9528*x+1.15 R2= Y Observed Y Predicted RMSEP = Fig. 5 PLS model of measured and predicted ranking 結論お茶の品評会で順位付けされた10 種の緑茶葉から代謝物を抽出しGCMS-QP2010 Plusをもちいて測定しましたその結果約 100 成分を検出することができそのうち71 成分は代謝成分データベースとNISTマススペクトルライブラリを用いて同定できました得られた結果をSIMCA-P (Umetrics 社 ) に適用して多変量解析を行なった結果スコアプロットとローディングプロットによって順位の高い緑茶葉と低い緑茶葉を特徴付けていると予想される代謝化合物を見つけだすことができましたまた PLS 回帰分析によって順位予測モデルを作成することができました謝辞本研究では大阪大学大学院工学研究科生命先端工学専攻福崎英一郎先生馬場健史先生ならびに研究室の皆様に懇切丁寧なご指導と多大なご協力をいただきました参考文献 [1] Fukusaki, E.; メタボロミクスの可能性と技術的問題. 生物工学 2006, 84, [2] Pongsuwan, W.; Fukusaki, E.; Bamba, T.; Yonetani, T.; Yamahara, T.; Kobayashi, A. Prediction of Japanese Green Tea Ranking by Gas Chromatography/Mass Spectrometry-Based Hydrophilic Metabolite Fingerprinting. J. Agric. Food Chem. 2007, 55,

島津 GC/MS とメタボローム弊社の GC/MS はメタボロミクスの研究の先駆けともいえる先天性代謝異常の研究に用いられ国内外で高い評価を得ています代謝物分析やメタボロミクス分析において GC/MS には次のことが求められます (1) 注目すべき代謝物が必ずしも高濃度で存在するとは限られないため微量代謝物も検出可能な感度を有している必要があります (2)

保持指標とマススペクトルを併用した同定が必要ですそのためにデータ解析ソフトウェアは保持指標を取り扱える必要があります (4) NISTなどのマススペクトルライブラリには一部の代謝成分が登録されていませんそのため代謝物を対象とした専用ライブラリが必要です弊社の GCMS-QP2010 Plus はこれらの条件を満たす機器ですガスクロマトグラフ / 質量分析計 GCMS-QP2010

6 島津 GC/MS とメタボローム弊社の GC/MS はメタボロミクスの研究の先駆けともいえる先天性代謝異常の研究に用いられ国内外で高い評価を得ています代謝物分析やメタボロミクス分析において GC/MS には次のことが求められます (1) 注目すべき代謝物が必ずしも高濃度で存在するとは限られないため微量代謝物も検出可能な感度を有している必要があります (2) 網羅的に代謝物を検索するために前処理で代謝物の損失を少なくすることが重要ですそのためクリーンナップ過程が省かれることが多く分析試料がきょう雑物を多く含みますそのような試料をGC/MS で分析するとイオン源が汚染されやすい問題があります汚れに強くしかもイオン源が汚染されても容易に洗浄できることが望まれます (3) 代謝物は類似したマススペクトルを与える成分があるため保持指標とマススペクトルを併用した同定が必要ですそのためにデータ解析ソフトウェアは保持指標を取り扱える必要があります (4) NISTなどのマススペクトルライブラリには一部の代謝成分が登録されていませんそのため代謝物を対象とした専用ライブラリが必要です弊社の GCMS-QP2010 Plus はこれらの条件を満たす機器ですガスクロマトグラフ / 質量分析計 GCMS-QP2010 Plus GCMS-QP2010 Plus の特徴 1. 高感度 2. 保守メンテナンスが容易 3. 保持指標を用いた化合物同定が可能 GC/MS 代謝成分データベース ( アミノ酸脂肪酸有機酸 ) GC/MS 代謝成分データベースは, ガスクロマトグラフ質量分析計 GCMS-QP2010 シリーズワークステーション GCMSsolution 向けライブラリです保持指標付きマススペクトルライブラリを用いることによって, 候補化合物を大幅に減らし, 検索結果の信頼性を向上します本データベースには, 分析条件, マススペクトル, 保持指標などを登録した 4 種類のメソッドファイルと,CAS 番号などを含む化合物情報, マススペクトル, 保持指標を含む 4 種類のライブラリ, ハンドブック ( ライブラリ情報の印刷物 ) から構成されていますメソッド / ライブラリにはアミノ酸, 脂肪酸, 有機酸の代謝関連成分について, 電子イオン化法スペクトル :261 スペクトル, 化学イオン化法スペクトル :50 スペクトルが登録されておりますこのデータ集は弊社が得た情報および内容のままにご提供するものでありその正確性および特定の目的における有用性について保証するものではありません弊社はこのデータ集の使用により直接的または間接的に生じたいかなる損害に対しても責任を負えないものでありその使用により生じた結果および現象についてはお客様の責任としますこのデータ集の著作権は株式会社島津製作所が所有しています当社の許可なく内容の一部または全部を転載複製することはできませんこのデータ集の内容は将来予告なしに変更することがありますこのデータ集の内容は作成にあたり万全を期しておりますが万一誤りや記載もれなどが発見されてもただちに修正できないことがあります Copyright 2009 Shimadzu Corporation. All right reserved. Printed in Japan, March 2009

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Appilation　Note LAAN-C-XX011A Lifescience O HO O MS 1 MS 2 C 14 H 16 N 10 HO HO O MS 3 Application Note No.10 Application Note No.10 Application Note No.10 Intensity (x100,000,000) 7.5 5 5.0 2.5 1 2 3 4 6 7 8 9 10 +:TIC