愛知県臨床検査標準化ガイドライン血液特殊染色アトラス愛知県臨床検査標準化協議会 AiCCLS : Aichi Committee for Clinical Laboratory Standardization

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ゆりなはらしない
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1 愛知県臨床検査標準化ガイドライン血液特殊染色アトラス愛知県臨床検査標準化協議会 AiCCLS : Aichi Committee for Clinical Laboratory Standardization

3 発刊によせて愛知県臨床検査標準化協議会会長伊藤宣夫急性白血病の分類は 1980 年代に FAB 分類が提唱されどこの施設でも簡便かつリーズナブルに行える特殊染色を基本に診断が行われるようになったこのような特殊染色の代表的な染色法はペルオキシダーゼ染色エステラーゼ染色鉄染色 PAS(Periodic acid Schiff) 染色があるペルオキシダーゼ染色は白血病細胞の由来が顆粒球系単球系リンパ球系であるかをいち早く鑑別するために欠かすことのできない染色法であるしたがってこの染色法は特殊染色の中でも最も基本となる重要な染色法であるエステラーゼ染色は顆粒球系細胞あるいは単球系細胞の証明および鑑別に用いられる特に NaF の阻害反応は単球系細胞の証明に有用である鉄染色は鉄欠乏状態や鉄過剰状態を推察でき環状鉄芽球の証明は鉄芽球性貧血や骨髄異形成症候群 Myelodysplastic syndromes(mds) の鉄芽球性不応性貧血 Refractory anemia with ring sideroblasts(rars) の診断に直結している PAS 染色は多糖類の証明白血病細胞の分類 ( 顆粒球系単球系リンパ球系の鑑別 ) リンパ球系細胞の予後判定因子として用いられているまた赤芽球系細胞においては腫瘍性の有無を確認するために応用されている急性白血病の分類が FAB 分類から WHO 分類に移行した今日においても特殊染色の意義は変わっていないこの血液特殊染色アトラスは古くから行われている特殊染色の特徴を明らかにし染色のポイントを記載したこれから血液学を学ぶ初心者から経験を積んだベテランまで日常業務のなかで活用して頂ける事を願っている

5 愛知県臨床検査標準化ガイドライン血液特殊染色アトラスペルオキシダーゼ染色愛知県臨床検査標準化協議会 AiCCLS : Aichi Committee for Clinical Laboratory Standardization

7 ペルオキシダーゼ染色 1. はじめにペルオキシダーゼ (peroxidase:pod) は骨髄で産生される酵素であり顆粒球系および単球系の細胞に発現するミエロペルオキシダーゼ (myeloperoxidase:mpo) 好酸球に発現する好酸球ペルオキシダーゼ (eosinophil peroxidase:epo) 血小板巨核球系に発現する血小板ペルオキシダーゼ (platelet peroxidase:ppo) がある血液検査における POD 染色は MPO や EPO を細胞化学的に検出しリンパ球系細胞との鑑別を目的として使用する染色法である特に急性白血病の分類には欠かせない重要な染色法の一つである 1) 2. 染色原理 POD は水素供与体の水素を水素受容体である過酸化物に転移させる過程に作用する酸化還元酵素の一種である水素受容体に過酸化水素を用い POD の作用により水素供与体は酸化重合を起こし発色した細胞を陽性とする 2) 染色原理は以下のように表される基質 + H2O2 POD 基質の酸化物 ( 発色 )+ 2H2O 3. 方法の概要基質の違いにより様々な方法の報告があるが基本的には固定反応 ( 染色 ) 後染色の順で行われる基質別特徴について表 1 に示す表 1 基質別特徴 1),2) 基質略称陽性顆粒の色調種類 3,3 -diaminobenzidine DAB 法 1 茶 ~ 黄褐色 benzidine dihydrochloride BDH 法 1 緑褐色ないし黄褐色ベンチジン誘導体 BB(benzidine base) Mc.Junkin 法黄褐色 2,7-diaminofluorene FDA 法緑黄色 ~ 緑褐色フルオレイン誘導体 α-naphthol-brilliantcresylblue 暗紺色 α-naphthol 法 4-chloro-1-naphthol 黒灰色 2 ナフトール誘導体 3-amino-9-ethylcarbazole 3AC 法 1 赤 ~ 黄褐色 2 カルバゾール誘導体 1 国際血液標準化委員会 (ICSH) が推奨している標準法 2 有機溶媒にて退色するので注意

8 国際血液学標準化委員会 (International Committee for Standardization in Hematology;ICSH1984) は 3-amino-9-ethylcarbazole(3AC) 3,3 -diaminobenzidine(dab) benzidine dihydrochloride(bdh) を基質とする方法を推奨している ICSH が推奨する BDH はベンチジンに発癌性があるとされ日本では昭和 47 年 10 月の労働安全衛生法でベンチジンの製造および使用が制限されたしかし αナフトールやクロロナフトールの反応が鋭敏であることから用いられてきた 3) 現在では試薬調整や染色手技が簡便であることから DAB 法 FDA 法 α-naphthol 法の染色キットが販売され最も普及しているのは DAB 法である 4. 染色のポイント過酸化水素の劣化や量の過不足は反応が減弱し偽陰性を示すことがあるので試薬の保存管理染色操作には十分注意する標本の染色は検体採取日の染色を基本とするが室温保存する場合でも 4~5 日くらいは染色可能であるさらに長期間保存する際には標本を-80 で凍結保存をする 1) 固定液は室温に戻してから使用する固定時間は細胞数に応じて延長する固定が不十分だと赤血球が溶血する場合があり見にくい標本となる固定液の劣化は陽性顆粒が綺麗な顆粒状を呈さなくなる後染色の前に水洗を丁寧に時間をかけてよくすすぐことで背景の過剰な染色顆粒が落ち陽性細胞が鑑別しやすくなる 5. 臨床的意義 POD は骨髄芽球に発現しリンパ芽球には発現しないため非リンパ性白血病の鑑別に有用である急性白血病の FAB 分類において白血病細胞の 3% 以上が陽性像を示せば由来を骨髄性白血病 (M0 M5a M6 M7 を除く ) とするただし POD は一次顆粒に蓄積されるため顆粒が十分に発現していない非常に未熟な分化段階の細胞では光学顕微鏡レベルでは検出できないことがあるしたがって陽性細胞が 3% 未満であっても顆粒球系細胞を否定できないことを念頭におく必要がある 3) そのほかに成熟好中球の POD 欠損症 ( 先天性後天性 ) があり後天性では骨髄異形成症候群によくみられるまた POD は好中球や単球の殺菌能に関与するため酵素欠損症などの場合は細胞機能検査としても利用できる 4)

9 6. 染色態度正常な血液細胞の POD 活性は顆粒球系の各成熟段階の細胞で認められる ( 一部骨髄芽球単芽球を除く ) なお単球は一般に弱陽性を呈しリンパ球系赤芽球系巨核球系血小板系は全て陰性を示す好酸球は強陽性好塩基球も陽性を呈するが顆粒が水溶性のため湧出しやすく見かけ上は陰性を示すことがある ( 表 2) 染色態度はキットの基質により差が生じることがあるため自施設の試薬の特性を理解しておく必要がある実際の染色態度は次ページより末梢血液および症例の骨髄写真で示す 2) 表 2 各種血球の POD 染色態度血球の種類染色態度 3 骨髄芽球 (-)~(+) 前骨髄球 ~ 成熟好中球 (+)~( ) 好酸球 ( ) 好塩基球 (+) 単芽球 (-)~(±) 単球 (±)~(+) リンパ球 (-) 形質細胞 (-) 赤芽球 (-) 骨髄巨核球 (-) 血小板 (-) 3(-): 陰性 (±): 弱陽性 (+): 陽性 ( ): 強陽性 7. その他検査と矛盾した結果がでた場合目的とする細胞の鑑別時に他の特殊染色や細胞表面抗原の結果と矛盾した場合染色手技や試薬管理の不備を除外して初めて異常な結果だと言える POD 陰性で細胞表面抗原に顆粒球系のマーカーが発現している場合は脂質の証明により細胞鑑別に使用されるズダン黒 B(SBB) 染色や抗 MPO 抗体を使用した細胞内免疫染色電子顕微鏡下の観察を行うことが有用であるまた MPO 酵素を作り出す遺伝子の有無などを検索する方法もある 3)

10 末梢血液好中球 DAB 法 FDA 法 α-naphthol 法ともに陽性 ~ 強陽性

11 末梢血液好酸球 DAB 法 FDA 法 α-naphthol 法ともに陽性 ~ 強陽性メイギムザ染色と同様に細胞質に大型の顆粒が密に充満し好中球より明瞭に染まる

12 末梢血液好塩基球 DAB 法 FDA 法 α-naphthol 法ともに陽性好塩基球の顆粒は水溶性のため湧出しやすく見かけ上は陰性を呈することがある

13 末梢血液単球 DAB 法 FDA 法 α-naphthol 法ともに弱陽性 ~ 陽性 DAB 法では顆粒状に染まり FDA 法 α-naphthol 法では細顆粒状に染まる

14 末梢血液リンパ球 DAB 法 FDA 法 α-naphthol 法ともに陰性

15 症例 1 WHO 分類 :Acute myeloid leukaemia with t(8;21)(q22;q22);runx1-runx1t1 FAB 分類 :AML M2 DAB 法 FDA 法 α-naphthol 法ともに陽性 ~ 強陽性 DAB 法 α-naphthol 法では顆粒が核の上に載り細胞の鑑別がしづらくなるそれに比べて FDA 法では鑑別しやすい後染色の前に水洗を丁寧に行うことで余分な顆粒をある程度洗い流すことができる

16 症例 2 WHO 分類 :Acute myeloid leukaemia with inv(16)(p13.1q22) or t(16;16)(p13.1;q22);cbfb-myh11 FAB 分類 :AML M4Eo DAB 法 FDA 法 α-naphthol 法ともに陽性 DAB 法 α-naphthol 法では顆粒が核の上に載り細胞の鑑別がしづらくなるそれに比べて FDA 法では鑑別しやすい後染色の前に水洗を丁寧に行うことで余分な顆粒をある程度洗い流すことができる

17 症例 3 WHO 分類 :Acute promyelocytic leukaemia with t(15;17)(q22;q21);pml-rara FAB 分類 :AML M3 DAB 法 FDA 法 α-naphthol 法ともに強陽性 DAB 法 α-naphthol 法では顆粒が核の上に載り細胞の鑑別がしづらくなるそれに比べて FDA 法では鑑別しやすい後染色の前に水洗を丁寧に行うことで余分な顆粒をある程度洗い流すことができる

18 症例 4 WHO 分類 :Acute myeloid leukaemia with minimal differentiation FAB 分類 :AML M0 DAB 法 FDA 法は陰性 α-naphthol 法は一部の細胞で陽性この症例のように染色態度が乖離する場合があるが基質の違いによるものと思われる

19 症例 5 WHO 分類 :Acute myeloid leukaemia without maturation FAB 分類 :AML M1 DAB 法 FDA 法 α-naphthol 法ともに陽性 DAB 法 FDA 法 α-naphthol 法ともに顆粒状または塊状に染まる

20 症例 6 WHO 分類 :Acute monoblastic and monocytic leukaemia FAB 分類 :AML M5a DAB 法は一部陽性 FDA 法 α-naphthol 法は陰性 DAB 法では一部の細胞が顆粒状に染まる

21 症例 7 WHO 分類 :T lymphoblastic leukaemia/lymphoma FAB 分類 :ALL L2 DAB 法 FDA 法 α-naphthol 法ともに陰性

22 7. 参考文献 1) 安藤秀実 : ペルオキシダーゼ染色, スタンダード検査血液学第 3 版,109~110, 医歯薬出版, ) 後藤文彦 : ペルオキシダーゼ染色, 月刊 Medical Technology 別冊最新染色法のすべて,296~301, 医歯薬出版, ) 三浦玲子 : ペルオキシダーゼ染色, スタンダード検査血液学第 2 版,128, 医歯薬出版, ) 阿南健一 : 血球の光顕細胞化学, 形態学からせまる血液疾患,458~488, 近代出版,1999.

23 ガイドライン作成委員会作成委員長牧俊哉 ( 名古屋第一赤十字病院 ) 作成委員赤座久美子 ( 名鉄病院 ) 作成委員今井正人 ( 愛知医科大学病院 ) 作成委員梶浦容子 ( 名古屋大学医学部附属病院 ) 作成委員蒲澤康晃 ( 厚生連稲沢厚生病院 ) 作成委員川崎達也 ( 厚生連江南厚生病院 ) 作成委員酒巻尚子 ( 厚生連豊田厚生病院 ) 作成委員佐藤聖子 ( 藤田保健衛生大学病院 ) 作成委員田中里枝 ( 愛知県がんセンター中央病院 ) 作成委員藤原妙 ( 医療法人豊田会刈谷豊田総合病院 ) 問い合わせ先愛知県臨床検査標準化協議会事務局名古屋市中村区名駅五丁目 16 番 17 号花車ビル南館 1 階公益社団法人愛知県臨床検査技師会事務所 Tel Fax 愛知県臨床検査標準化協議会愛知県臨床検査標準化ガイドライン発行平成 27 年 9 月吉日発行所愛知県臨床検査標準化協議会発行者伊藤宣夫編集者所嘉朗内田一豊牧俊哉

10,000 L 30,000 50,000 L 30,000 50,000 L 図 1 白血球増加の主な初期対応表 1 好中球増加 ( 好中球 >8,000/μL) の疾患 1 CML 2 / G CSF 太字は頻度の高い疾患 32

10,000 L 30,000 50,000 L 30,000 50,000 L 図 1 白血球増加の主な初期対応表 1 好中球増加 ( 好中球 >8,000/μL) の疾患 1 CML 2 / G CSF 太字は頻度の高い疾患 32 白血球増加の初期対応白血球増加が 30,000~50,000/μL 以上と著明であれば, 白血病の可能性が高いすぐに専門施設 ( ) に紹介しよう ( 図 1) 白血球増加があれば, まず発熱など感染症を疑う症状所見に注目しよう ( 図 1) 白血球増加があれば, 白血球分画を必ずチェックしよう成熟好中球 ( 分葉核球や桿状核球 ) 主体の増加なら, 反応性好中球増加として対応しよう ( 図

愛知県臨床検査標準化ガイドライン 血液特殊染色アトラス 愛知県臨床検査標準化協議会 AiCCLS : Aichi Committee for Clinical Laboratory Standardization

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