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のぶあきなかじゅく
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2 岡山県環境保健センター年報 39, 3 4, 5 調査研究事故時等緊急時の化学物質の分析技術の開発に関する研究 - 動物用医薬品 ( サルファ剤 ) の水質分析法の検討 - Study on the development of analysis method of chemical substances at the time of water quality accidents - Study of water quality analysis method of Veterinary Drugs - 浦山豊弘, 新和大, 中野拓也, 山本淳 ( 水質科 ) Toyohiro Urayama, Kazuhiro Atarashi, Takuya Nakano, Jun Yamamoto (Water Section) 要旨動物用医薬品である合成抗菌剤のサルファ剤物質について, 水質試料の高感度同時分析法を検討したポリマー系逆相固相で抽出した後メタノールで溶出し, 対象物質のピーク形状ができるだけシャープとなる分析カラムを検討し, 液体クロマトグラフタンデム質量分析計で分析することで,6 物質について検出下限値が 3.6 ~ ng/l の高感度な分析法が開発できた河川水及び海水を用いた添加回収試験の回収率は, それぞれ 73 ~ 7,58 ~ 3 であった [ キーワード : 動物用医薬品, サルファ剤, 水質,LC/MS] [Key words:veterinary Drugs,Sulfonamides,Water quality,lc/ms] はじめに動物用医薬品は, 家きん等を病気や寄生虫から守るために用いられている医薬品であり, また, 一部は人用に用いられている成分もあり, これらは排水路や下水道を通じて環境中に排出されていることが考えられる )~ 筆者らは既報 3) において畜水産物中の動物用医薬品の分析法を検討したが, それを応用して環境水中の動物用医薬品であるサルファ剤の物質について分析法を検討し,6 物質の高感度同時分析法開発したので, 報告する実験方法. 検討物質検討物質を表に示す林純薬工業製, 動物薬混合標準溶液 LC/MS Mix に含まれる物質について検討を行った. 試薬動物薬混合標準溶液 LC/MS Mix : 林純薬工業製 ( 各 μg/ml) スルファメトキサゾール - 3 C 6 : SIGMA-ALDRICH (Fluka) 製 ( 純度 99) スルファメトキサゾール -d 4 : 林純薬工業製 ( 純度 97.4) スルファクロロピリダジン- 3 C 6: SIGMA-ALDRICH (Fluka) 製 ( 純度 99) スルファジアジン - 3 C 6: SIGMA-ALDRICH (Fluka) 製 ( 純度 99) スルファメサジン ( スルファジミジン )- 3 C 6: CIL 社製 (μg/ml, 純度 9) スルファドキシン-d 3: 林純薬工業製 ( 純度 99.9) トリメトプリム-d 9: SIGMA-ALDRICH (Fluka) 製 ( 純度 98) スルファジメトキシン -d 6: 和光純薬工業製 ( 環境分析用 )( 純度 98) アセトニトリル, メタノール : LC/MS 用和光純薬工業製精製水 : ミリポア製 Milli-Q Gradient により調製固相カートリッジ : Waters 製 Oasis HLB Plus LP (5 mg) 岡山県環境保健センター年報 3

3 表検討物質一覧表物質名英名分子式 CAS 番号分子量モノアイソトヒック質量スルファニルアミド Sulfanilamide C6H8NOS スルファグアニジン Sulfaguanidine C7HN4OS スルファセトアミド Sulfacetamide C8HNO3S スルフィソゾール Sulfisozole C9H9N3O3S ピリメタミン Pyrimethamine CH3ClN スルファピリジン Sulfapyridine CHN3OS スルファジアジン Sulfadiazine CHN4OS スルファメトキサゾール Sulfamethoxazole CHN3O3S スルファチアゾール Sulfathiazole C9H9N3OS ジアベリジン Diaveridine C3H6N4O スルファメラジン Sulfamerazin CHN4OS スルファトロキサゾール Sulfatroxazole CH3N3O3S スルフィソキサゾール Sulfisoxazole CH3N3O3S オルメトプリム Ormetoprim C4H8N4O スルファベンザミド Sulfabenzamide C3HNO3S スルフィソミジン Sulfisomidine CH4N4OS スルファジミジン Sulfadimidine CH4N4OS スルファメトキシピリダジン Sulfamethoxypyridazine CHN4O3S スルファモノメトキシン Sulfamonomethoxine CHN4O3S スルファクロロピリダジン Sulfachloropyridazine CH9N4OSCl トリメトプリム Trimethoprim C4H8N4O スルファエトキシピリダジン Sulfaethoxypyridazine CH4N4O3S スルファキノキサリン Sulfaquinoxaline C4HN4OS スルファドキシン Sulfadoxin CH4N4O4S スルファジメトキシン Sulfadimethoxin CH4N4O4S スルファニトラン Sulfanitran C4H3N3O5S スルファブロモメタジン Sulfabromomethazine CH3BrN4OS LC/MS の測定条件 LC/MS 機器 :Waters Alliance 5/ Quattro micro API LC LC 機種 :Waters Alliance 5 カラム :Waters 製 Atlantis T3. mm 5 mm,3 μm 移動相 : A:. ギ酸 / mmol/l ギ酸アンモニウム水溶液 (99:) B:. ギ酸 - アセトニトリル溶液 / mmol/l ギ酸アンモニウム- アセトニトリル溶液 (99:) ~ min A:97 85 B:3 5 linear gradient ~ min A:85 77 B:5 3 linear gradient ~ min A:77 5 B:3 75 linear gradient ~ min A:5 B:75 linear gradient ~ 35 min A:B = : 35 ~ 35. min A: 97 B: 3 linear gradient 35. ~ 48 min A:B=97:3 カラム流量 :. ml/min カラム温度 :4 C 試料注入量 :5μL MS MS 機種 :Waters Quattro micro API キャピラリー電圧 :.5 kv ソース温度 : C デゾルベーション温度 :45 C コーンガス量 :6 L/Hr デゾルベーション流量 :5 L/Hr イオン化法 : ESI-Positive( スルファニトランは ESI-Negative) 測定モード :SRM モニターイオン, コーン電圧及びコリジョン電圧 : 表及び表 3 参照 3 岡山県環境保健センター年報

4 表対象物質のモニターイオン, コーン電圧及びコリジョン電圧物質名保持時間モニターイオンコーン電圧コリション電圧 Sulfanilamide > Sulfaguanidine 3.9 Sulfacetamide > Sulfisozole > 56. Pyrimethamine > Sulfapyridine > 9. 3 Sulfadiazine > Sulfamethoxazole > Sulfathiazole > Diaveridine > Sulfamerazin > 9. 4 Sulfatroxazole 7.88 Sulfisoxazole > 56. Ormetoprim.6 5. > Sulfabenzamide > 56. Sulfisomidine 8. Sulfadimidine > Sulfamethoxypyridazine 3.48 Sulfamonomethoxine > Sulfachloropyridazine > Trimethoprim.6 9. > Sulfaethoxypyridazine > Sulfaquinoxaline.3 3. > Sulfadoxin 7.45 Sulfadimethoxin. 3. > Sulfanitran (Negative) > Sulfabromomethazine > 表 3 サロゲート内標準のモニターイオン, コーン電圧及びコリジョン電圧物質名モニターイオンコーン電圧コリション電圧 Sulfamethoxazole- 3 C6 6.8> Sulfadiazine- 3 C > Sulfadimidine- 3 C6 85. > Sulfachloropyridazine- 3 C6 9.4 > Trimethoprim-d9 3. > Sulfadoxin-d3 34. > Sulfadimethoxin-d6 37. > 6. 3 水質試料固相抽出洗浄脱水 ml サロケート添加 Oasis HLB Plus 精製水 5 ml 注射筒 ( 各. ng) ml/min Air 5 ml 3 回溶出濃縮定容ろ過 LC/MS-SRM メタノール N ガスメタノール / 精製水 (:).45 μm フィルター ESI+ ESI+ 5 ml 約. ml まで. ml 図分析法のフローチャート.4 前処理方法水質試料 ml に. ng/μl のサロゲート内標準液を 5μL 添加し, 混合したこれをメタノール ml, 精製水 ml でコンディショニングした固相カートリッジ (Oasis HLB plus) に ml/min の速さで通水した固相カートリッジを精製水 5 ml で洗浄後, 注射筒で空気を 5 ml 3 回通気して固相中の水分を除去したこれをメタノール 5 ml で溶出し,4 C 以下の窒素気流下で約. ml まで濃縮し, メタノール / 精製水 (:) で. ml に定容し,.45μm フィルターでろ過を行い, 試験液とした分析法のフローチャートを図に示す岡山県環境保健センター年報 33

5 .5 装置検出下限値及び分析法の検出下限値と定量下限値装置検出下限値 (IDL) 及び分析方法の検出下限値 (MDL) と定量下限値 (MQL) の測定及び算出は, 化学物質環境実態調査実施の手引き ( 平成年度版 ) 4) に従った IDL は, 検量線に用いる最低濃度付近の標準液を 7 回繰り返し測定し, 得られた測定値の標準偏差を用いて算出した MDL 及び MQL は, 海水に IDL 試料換算値の 5 倍程度の標準物質を添加した試料を 7 個作成し, 分析フローに従い前処理を実施した後,LC/MS で測定し, 得られた測定値の標準偏差を用いて算出した図抽出用固相カートリッジの検討結果 ( スルファメトキサゾール ) IDL = t(n-,.5) σ n-,i t( n -,.5): 危険率 5, 自由度 n- の t 値 ( 片側 ) σ n-,i:idl 算出のための測定値の標本標準偏差 MDL = t(n-,.5) σ n-,m MQL = σ n-,m t(n-,.5): 危険率 5, 自由度 n- の t 値 ( 片側 ) σ n-,m:mdl 算出のための測定値の標本標準偏差 3 検討結果及び考察 3. 抽出用固相カートリッジの検討結果 5)~ 過去の分析法開発 7) において高回収率であった Oasis HLB,Sep-Pak C8,InertSep PLS-3 の3 種類の固相を検討した精製水 ml にスルファメトキサゾール標準物質. μg を添加し, 各固相に ml/min で通水, メタノール5 mlで溶出した後, アセトニトリル5 mlで溶出した結果を図に示すシリカ系固相の Sep-Pak C8 は, 5) 酸性下での通水で極性物質でも高回収率が得られた事例もあったが, 今回の検討では回収率が低かったポリマー系固相の Oasis HLB,InertSep PLS-3 では, いずれも高回収率であったが,Oasis HLB がメタノール 5 ml 溶出での回収率が高く, アセトニトリル画分への残留もなかったので,Oasis HLB を採用することとした 3. 溶出溶媒の検討結果 3. の検討から Oasis HLB を採用することとしたが, InertSep PLS-3 ではアセトニトリル画分への残留が確認されたためアセトニトリルでの溶出も検討することとし, サルファ剤物質に対し, 溶出溶媒の種類 ( メタノールまたはアセトニトリル ) と量 (5mL または ml) を検討した精製水 ml に標準物質各 ng を添加し, ml/min で通水, メタノール 5 ml で溶出後, 更にメタノール 5 ml で溶出したもの及びアセトニトリル 5 ml で溶出後, 更にアセトニトリル 5 ml で溶出したものを比較した結果を表 4 に示すピリメタミン, ジアベリジン, オルメトプリム, トリメトプリムの 4 物質はアセトニトリルでは回収率が低く,mL でも溶出しきってないと考えられたため, メタノールを採用することとした一般にメタノールよりアセトニトリルの方が溶出力が強いが,4 物質はスルホニル基を持たずアミノ基をつ持つため, メタノールの持つプロトン親和性が溶出に寄与していると考えられたまた, 溶媒量については, メタノール 5mL で目的物質の 5 以上が溶出し, メタノール 5 ~ ml への残留が以下であったので, メタノール 5 ml での溶出とした 3.3 試料通水時の ph の検討試料通水時の ph 調整の必要の有無を確認するための検討を行った海水 ( 水島沖 ) ml に標準物質各 ng を添加し,pH をそれぞれ 3,4,5,7,9 に調整した後, ml/min で通水, メタノール 5 ml で溶出した ( 測定溶媒はメタノール,pH8 は ph 未調整 ) 結果を表 5 に示す多くの物質では ph9 で回収率が低くなることが確認されたが, 通常の公共用水域の ph7 ~ 8 では ph 調整不要であると判断したまた, スルファセタミドは ph5 以下にしなければ回収できなかったが, 多成分を簡易かつ一斉に分析することが目的であるため, スルファセタミドを除く 6 物質の同時分析法の確立を目標とした 34 岡山県環境保健センター年報

6 表 4 溶出溶媒の検討試験結果 (Oasis HLB) 回収率 () メタノールアセトニトリル対象物質計計 ml ml ml ml Sulfanilamide Sulfaguanidine Sulfacetamide Sulfisozole Pyrimethamine Sulfapyridine Sulfadiazine Sulfamethoxazole Sulfathiazole Diaveridine Sulfamerazin Sulfatroxazole Sulfisoxazole Ormetoprim Sulfabenzamide Sulfisomidine.. 3 Sulfadimidine Sulfamethoxypyridazine Sulfamonomethoxine Sulfachloropyridazine Trimethoprim Sulfaethoxypyridazine Sulfaquinoxaline Sulfadoxin Sulfadimethoxin Sulfanitran Sulfabromomethazine 表 5 通水時の ph の検討試験結果 (Oasis HLB) 対象物質回収率 () ph3 ph4 ph5 ph7 ph8 ph9 Sulfanilamide Sulfaguanidine Sulfacetamide Sulfisozole Pyrimethamine Sulfapyridine Sulfadiazine Sulfamethoxazole Sulfathiazole Diaveridine Sulfamerazin Sulfatroxazole Sulfisoxazole Ormetoprim Sulfabenzamide Sulfisomidine Sulfadimidine Sulfamethoxypyridazi Sulfamonomethoxine Sulfachloropyridazine Trimethoprim Sulfaethoxypyridazin Sulfaquinoxaline Sulfadoxin Sulfadimethoxin Sulfanitran Sulfabromomethazine 岡山県環境保健センター年報 35

7 3.4 逆相 - イオン交換ミックスモード固相の検討 3. 及び 3.3 の検討で, 保持時間が短く水溶性が高い物質の回収率が低い傾向であったため, イオン交換系固相を検討することとし, 陰イオン交換系の Waters 製 Oasis MAX Plus 及び陽イオン交換系の Oasis MCX Plus の種類の逆相 - イオン交換ミックスモード固相を検討した河川水 ( 旭川乙井手堰 ), 海水 ( 水島沖 ) m L に標準物質各 ng を添加し, ml/min で通水,MAX は濃アンモニア水 / 精製水 (5:95), 精製水で洗浄後, メタノール 5 ml で溶出し, 更にギ酸 / メタノール (:98)5 ml で溶出,MCX は, ギ酸水溶液, 精製水で洗浄後, メタノール 5 ml で溶出し, 更に濃アンモニア水 / メタノール ( 5 : 9 5 ) で溶出した ( 測定溶媒はメタノール ) 結果は表 6のとおりで, 対象物質は3 種類の溶出パターンに分かれた溶出パターンを表 7 に示すパターンは, 陽イオン性を示し, 陰イオン性を示さない物質で, 該当の6 物質はアミノ基をつ持つ物質であったパターンは, 陰イオン性を示し, 陽イオン性を示さない物質で, 該当のスルファニトランは, ニトロ基の電子供与作用により級アミンが陽イオンになりにくいと判断され逆相 -イオン交換ミックスモード固相の検討試験結果表 6 逆相 - イオン交換ミックスモード固相の検討試験結果回収率回収率 () () 海水海水河川水河川水対象物質対象物質 MAX MAX MCX MCX MAX MAX MCX MCX ギ酸 / / 計計 NH3/ 計計ギ酸 / / 計計 NH3/ 計計 Sulfanilamide Sulfanilamide Sulfaguanidine Sulfaguanidine Sulfacetamide Sulfacetamide Sulfisozole Sulfisozole Pyrimethamine Pyrimethamine Sulfapyridine Sulfapyridine Sulfadiazine Sulfadiazine Sulfamethoxazole Sulfamethoxazole Sulfathiazole Sulfathiazole Diaveridine Diaveridine Sulfamerazin Sulfamerazin Sulfatroxazole Sulfatroxazole Sulfisoxazole Sulfisoxazole Ormetoprim Ormetoprim Sulfabenzamide Sulfabenzamide Sulfisomidine Sulfisomidine Sulfadimidine Sulfamethoxypyridazine Sulfadimidine Sulfamonomethoxine Sulfamethoxypyridazine Sulfachloropyridazine Sulfamonomethoxine Trimethoprim Sulfachloropyridazine Sulfaethoxypyridazine Trimethoprim Sulfaquinoxaline Sulfaethoxypyridazine Sulfadoxin Sulfaquinoxaline Sulfadimethoxin Sulfadoxin Sulfanitran Sulfadimethoxin Sulfabromomethazine Sulfanitran Sulfabromomethazine 表 7 逆相 - - イオン交換ミックスモード固相での溶出パターン表 7 逆相 -イオン交換ミックスモード固相での溶出パターン溶出パターン該当物質ハターン MAX 溶出パターン MCX 該当物質番号ハターン MAX ギ酸 / MCX NH3/ 番号ギ酸 / NH3/ Sulfanilamide, Sulfaguanidine, Pyrimethamine, Diaveridine, Sulfanilamide, Ormetoprim, Sulfaguanidine, Trimethoprim Pyrimethamine, Diaveridine, Ormetoprim, Trimethoprim Sulfanitran Sulfanitran 3 Others 3 Others 36 岡山県環境保健センター年報

8 アセトニトリル ppb-ch3cn HPCmix+CAM (-7-)ACN_D3_MRM 3_5 : MRM of Channels ES > 56.88e4 アセトニトリルスルファメトキサゾールスルファメトキサゾールアセトニトリル _5 : MRM of Channels ES > 56 3.e4 アセトニトリル 5 アセトニトリルアセトニトリル _53 : MRM of Channels ES > 56.9e _54 : MRM of Channels ES > 56.e4 5 アセトニトリルアセトニトリル図 3 試験液の溶媒組成を変えた場合のクロマトグラム -( スルファメトキサゾール ) ppb-ch3cn HPCmix+CAM (-7-)ACN_D3_M ppb-ch3cn HPCmix+CAM (-7-)ACN_D3_MRM 3_5 : MRM of Channel ES+ 3_5 : MRM of Channels ES e4 アセトニトリル 8.3.7e Sulfaguanidine アセトニトリル Sulfacetamide _5 : MRM of Channel ES+ 3_5 : MRM of Channels ES e4 アセトニトリル e アセトニトリル _53 : MRM of Channel ES+ 3_53 : MRM of Channels ES e5 5 アセトニトリル 6.37.e アセトニトリル _54 : MRM of Channel ES+ 3_54 : MRM of Channels ES e e アセトニトリルアセトニトリル図 4 試験液の溶媒組成を変えた場合のクロマトグラム図 4 試験液の溶媒組成を変えた場合のクロマトグラム -( 保持時間 8 分以下の物質 ) 図 5 試験液の溶媒組成を変えた場合のクロマトグラム-3( 保持時間 8~9 分 ) 図 5 試験液の溶媒組成を変えた場合のクロマトグラム -( 保持時間 8 分以下の物質 ) -3( 保持時間 8 ~ 9 分 ) たパターン3は, 陽イオン性, 陰イオン性共に示す物質であり, 対象物質の多くが該当した Oasis MCX を用いれば,に該当するスルファニトラン以外の物質はアンモニア / メタノール画分に溶出するが, スルファメトキサゾール, スルファトロキサゾール, スルフィソキサゾール, スルファベンズアミドでは以上がメタノール画分に溶出し, また, 回収率も 8 未満の物質が多かったため, 採用しないこととした 3.5 試験液の溶媒組成の検討結果測定条件のうち, 試験液の溶媒組成を検討することとした測定カラムとして当初検討した XTerra カラムでは, 試験液をアセトニトリルで調製すると, 図 3 5 に示すとおりピークがリーディングすることが分かった ( 使用カラム :Waters 製 XTerra MS C8. mm 5 mm,3.5 μm, 注入量 : μl) 3.6 注入量の検討結果注入量を 5μL にしたところ, 図 6 に示すとおりアセトニトリルでも問題なくなり,5 アセトニトリルでも保持時間が最も短いスルファグアニジンを除き問題なくなったアセトニトリルでは, 保持時間 5 分以下のものはピーク形状が崩れた ( 測定カラムは AtlantisT3 を使用 ) 岡山県環境保健センター年報 37

9 ppb-ch3cn 5uL HPCmix+CAM A-T3-3um (-5-)ACN_D3_MRM 3_89 : MRM of Channels ES e5.54 スルファグアニジン ( ピークは本 ) 3. アセトニトリル ppb-ch3cn 5uL HPCmix+CAM A-T3-3um (-5-)ACN_D3_MRM 3_93 : MRM of Channels ES e5.44 アセトニトリル ppb-5ch3cn 5uL HPCmix+CAM A-T3-3um (-5-)ACN_D3_MRM 3_97 : MRM of Channels ES e アセトニトリル ppb-ch3cn 5uL HPCmix+CAM A-T3-3um (-5-)ACN_D3_MRM 3_ : MRM of Channels ES e4 スルファグアニジン ( ピークが本に分離 ) アセトニトリル図 6 注入量 5 μlで測定したクロマトグラム図 6 注入量 5 μl で測定したクロマトグラム 3.7 試験液の溶媒組成の検討結果 3.5 及び 3.6 の検討結果から, 有機溶媒の割合を低くするか, 注入量を少なくすれば保持時間が短い物質でもピーク形状が崩れないことがわかったので, 注入量は感度とピーク形状を考慮して 5 μl とし, 有機溶媒の割合を減らしても測定物質が溶解しなくなる現象が現れないかを確認した河川水 ( 旭川乙井手堰 ), 海水 ( 水島沖 ) ml に標準物質各 ng を添加し, ml/min で通水, メタノール 5 ml で溶出したものを用い, 試験液の溶媒をメタノール / 精製水 (:4), メタノール / 精製水 (:), メタノールと変更し, 同じ溶媒組成の標準品との面積値の比較を行った結果を表 8 に示す有機溶媒の割合を変更しても明確な違いは現れず, 有機溶媒の割合を下げても, 測定物質が溶解しなくなる現象は確認されなかったので, 試験液の溶媒をメタノールからメタノール / 精製水 (:) に変更した 3.8 移動相及びカラムの検討結果移動相をギ酸 / アセトニトリル系 ( 図 7) からギ酸 / メタノール系 ( 図 8) に変更したところ, むしろテーリングしてピーク幅が広がり気味となった測定カラムを XBridge C8( 図 9) 及び Atlantis T3( 図 ) に変更したところ, いずれもピークがシャープとなり良好であったが,Atlantis T3 の方がよりシャープであったので,Atlantis T3 を採用することとした 3.9 移動相条件の検討カラムを XTerra から Atlantis T3 に変更することで個々のピーク形状はシャープになったが, 目的物質同士の分離では 5 ~ 分に何も溶出せず, ~ 4 分に何物質か重なったピークがあった ( 図 ) そこで, ~ 4 分に溶出していた物質のピーク間隔が広がるよう ~ 分で B:5 3 となるよう緩やかにグラジエントさせるよう変更した 38 岡山県環境保健センター年報

10 表 8 試験液の溶媒組成の検討試験結果 8 河川水海水対象物質メタノール / メタノール / メタノール / メタノール / 精製水精製水メタノール精製水精製水メタノール (:4) (:) (:4) (:) Sulfanilamide Sulfaguanidine Sulfacetamide 8 Sulfisozole Pyrimethamine Sulfapyridine Sulfadiazine Sulfamethoxazole Sulfathiazole Diaveridine Sulfamerazin Sulfatroxazole Sulfisoxazole カラム :XTerra Ormetoprim 移動相 93 : ギ酸 / ギ酸アセトニトリル Sulfabenzamide 88 9 B:3(-min)-43(7min)-98(min) Sulfisomidine Sulfadimidine Sulfamethoxypyridazine Sulfamonomethoxine Sulfachloropyridazine Trimethoprim Sulfaethoxypyridazine Sulfaquinoxaline Sulfadoxin Sulfadimethoxin Sulfanitran Sulfabromomethazine 平均 ppb-ch3cn ul HPCmix+CAM (-7-)ACN_D3_MRM 3_6 3: MRM of 5 Channels ES+. 4.3e _6 : MRM of Channels ES+ 8.6.e _6 : MRM of Channel ES+ 6.e 図 7 当初検討した条件で測定したクロマトグラム ( 基準とする ) ppb-ch3cn ul HPCmix+CAM (-7-)ACN_D3_MRM 3_6 3: MRM of 5 Channels ES+ カラム :XTerra. 移動相 : ギ酸 / ギ酸アセトニトリル 4.3e5 B:3(-min)-43(7min)-98(min) _6 : MRM of Channels ES e _6 : MRM of Channel ES e ppb-ch3cn ul HPCmix+CAM XTerra (-3-)_D3_MRM 3_8 3: MRM of 5 Channels ES+ ppb-ch3cn ul HPCmix+CAM XBridge (-5-)ACN_D3_MRM. カラム :XTerra 4.88e5 3_8 3: MRM of 5 Channels ES+ 移動相 : ギ酸 / ギ酸メタノール. カラム :XBridge 5.88e5 B:3(-min)-43(3min)-98(min) 移動相 : ギ酸 / ギ酸アセトニトリル.4 B:3(-min)-43(5min)-98(min) _8 : MRM of Channels ES _8 : MRM of Channels 3.5e5 ES e _8 : MRM of Channel ES _8 : MRM of Channel.9e5 ES e 図 7 当初検討した条件で測定したクロマトグラム ( 基準とする ) ppb-ch3cn ul HPCmix+CAM XTerra (-3-)_D3_MRM 3_8 3: MRM of 5 Channels ES+ カラム :XTerra. 4.88e5 ppb-ch3cn ul HPCmix+CAM XBridge (-5-)ACN_D3_MRM 移動相 : ギ酸 / ギ酸メタノール 3_8 3: MRM of 5 Channels ES+ B:3(-min)-43(3min)-98(min) カラム :XBridge. 5.88e5 移動相 : ギ酸 / ギ酸アセトニトリル.4 B:3(-min)-43(5min)-98(min) _8 : of MRM Channels ES e _ : of MRM Channels ES e _8 : MRM of Channel ES e _8 : MRM of Channel ES e4 図 7 当初検討した条件で測定したクロマトグラム ( 基準とする ) 図 8 移動相をメタノール系に変更して測定したクロマトグラム図 9 カラムをXBridgeに変更して測定したクロマトグラム ppb-ch3cn ul HPCmix+CAM A-T3-3um (-5-)ACN_D3_MRM 3_9 3: MRM of 5 Channels ES+.56 カラム :Atlantis T3 6.8e5 移動相 : ギ酸 / ギ酸アセトニトリル B:3(-min)-43(5min)-98(min) _9 : MRM of Channels ES e 図 8 移動相をメタノール系に変更して測定したクロマトグラム _9 : MRM of Channel ES+.77.3e 図 8 移動相をメタノール系に変更して測定したクロマトグラム図 9 カラムを図 9 カラムをXBridge に変更して測定したクロマトグラム図図カラムを AtlantisT3 に変更して測定したクロマトグラムクロマトグラム ppb-ch3cn ul HPCmix+CAM A-T3-3um (-5-)ACN_D3_MRM 3_9 3: MRM of 5 Channels ES+.56 カラム :Atlantis T3 6.8e5 移動相 : ギ酸 / ギ酸アセトニトリル B:3(-min)-43(5min)-98(min) 岡山県環境保健センター年報 _9 : MRM of Channels ES e5

11 図当初検討した移動相条件で測定したクロマトグラム AddSTD-_ppb_HPCmix+Macrolide3mix_5uL_5-95ACN_D5_MRM 3_47 MRM of 5 Channels ES e5 ng/ml_std(hpcmix+mac3+csng+ssng)_5ul_mrm_dry 3_586 MRM of 5 Channels ES e 物質名 9.49 表 9 装置検出下限 8.68e5 (IDL) の算出結果 9 (IDL) 試料量 (ml).9 図最終的な移動相条件で測定したクロマトグラム図当初検討した移動相条件で測定したクロマトグラム図図最終的な移動相条件で測定したクロマトグラム ng/ml_std(hpcmix+mac3+csng+ssng)_5ul_mrm_dry 3_586 MRM of 5 Channels ES 最終液量 (ml) 注入液濃度 (ng/ml) 注入量 (μl) 平均値 (ng/ml) 標準偏差 (ng/ml ) IDL* (ng/ml ) IDL 試料換算値 (ng/l) Sulfanilamide Sulfaguanidine Sulfacetamide Sulfisozole Pyrimethamine Sulfapyridine Sulfadiazine Sulfamethoxazole 図最終的な移動相条件で測定したクロマトグラム Sulfathiazole Diaveridine Sulfamerazin Sulfatroxazole Sulfisoxazole Ormetoprim Sulfabenzamide Sulfisomidine Sulfadimidine Sulfamethoxypyridazine Sulfamonomethoxine Sulfachloropyridazine Trimethoprim Sulfaethoxypyridazine Sulfaquinoxaline Sulfadoxin Sulfadimethoxin Sulfanitran Sulfabromomethazine *: IDL = t (n-,.5) σn S/N CV () 最終条件における分離状況を図に示す 3. 装置検出下限 (IDL) 及び検出下限 (MDL), 定量下限 (MQL) IDL を表 9,MDL,MQL を表に示す IDL は.( スルファグアニジン及びスルフィソゾール )~.9 ng/ml( スルファニトラン ),MDL は 3.6( スルファニルアミド )~ ng/l( スルファニトラン ) であったスルファニトランのみ感度が低く, これは食品分析に用いている装置でも同様の傾向であった 3. 添加回収試験結果河川水への添加では, スルファセタミドとスルファニトランを除き,7 ~ の良好な回収率であった ( 表 ) 海水への添加では, 酸性下で通水する必要があるスルファセタミドのほか, スルファグアニジンとスルフィソゾールで 7 未満の回収率となった ( 表 ) 4 岡山県環境保健センター年報

12 表検出下限 (MDL) 及び定量下限 (MQL) の算出結果表添加回収試験結果 ( 河川水 ) 対象物質試料操作ブ標準試料換無添加標準サロケートランク平均値 MDL MQL CV 添加量算濃度平均偏差回収率平均 (ng/l) (ng/l) (ng/l) () (ng) (ng/l) (ng/l) (ng/l) (ng/l) () Sulfanilamide 海水.. ND ND Sulfaguanidine 海水.. ND ND Sulfacetamide 海水 Sulfisozole 海水.. ND ND Pyrimethamine 海水.. ND ND Sulfapyridine 海水.. ND ND Sulfadiazine 海水.. ND ND Sulfamethoxazole 海水.. ND ND Sulfathiazole 海水.. ND ND Diaveridine 海水.. ND ND Sulfamerazin 海水.. ND ND Sulfatroxazole 海水.. ND ND Sulfisoxazole 海水.. ND ND Ormetoprim 海水.. ND ND Sulfabenzamide 海水.. ND ND Sulfisomidine 海水.. ND ND Sulfadimidine 海水.. ND ND Sulfamethoxypyridazine 海水.. ND ND Sulfamonomethoxine 海水.. ND ND Sulfachloropyridazine 海水.. ND ND Trimethoprim 海水.. ND ND Sulfaethoxypyridazine 海水.. ND ND Sulfaquinoxaline 海水.. ND ND Sulfadoxin 海水.. ND ND Sulfadimethoxin 海水.. ND ND Sulfanitran 海水. ND ND Sulfabromomethazine 海水.. ND ND ( 注 ) スルファセタミドは酸性下で抽出する必要があり phを調整しない他成分との同時分析ではMDLを求めることができなかった対象物質試料名試料量 (ml) 試験数無添加検出濃度 (ng/l) サロケート回収率 () 試験数検出濃度 (ng/l) ng 添加回収率 () 変動サロケート係数回収率 () () Sulfanilamide 河川水 ND Sulfaguanidine 河川水 ND Sulfacetamide 河川水 ND Sulfisozole 河川水 ND Pyrimethamine 河川水 ND Sulfapyridine 河川水 Sulfadiazine 河川水 ND Sulfathiazole 河川水 ND Diaveridine 河川水 ND Sulfamerazin 河川水 ND Sulfatroxazole 河川水 ND Sulfisoxazole 河川水 ND Ormetoprim 河川水 ND Sulfabenzamide 河川水 ND Sulfisomidine 河川水 ND Sulfadimidine 河川水 ND Sulfamethoxypyridazine 河川水 ND Sulfamonomethoxine 河川水 ND Sulfachloropyridazine 河川水 ND Trimethoprim 河川水 ND Sulfaethoxypyridazine 河川水 ND Sulfaquinoxaline 河川水 ND Sulfadoxin 河川水 ND Sulfadimethoxin 河川水 ND Sulfanitran 河川水 ND Sulfabromomethazine 河川水 ND ( 注 ) スルファセタミドは酸性下で通水する必要があるため ph 未調整で通水した同時分析では回収率が低くなっているスルファニトランは ESI-Negative では高めに定量される傾向にあり ESI-Positive では低め ( 回収率 44) に定量される傾向にある対象物質表添加回収試験結果 ( 海水 ) 表添加回収試験結果 ( 海水 ) 試料名試料量 (ml) 試験数無添加検出濃度 (ng/l) サロケート回収率 () 試験数検出濃度 (ng/l) ng 添加回収率 () 変動係数 () サロケート回収率 () Sulfanilamide 海水 ND Sulfaguanidine 海水 ND Sulfacetamide 海水 Sulfisozole 海水 ND Pyrimethamine 海水 ND Sulfapyridine 海水 ND Sulfadiazine 海水 ND Sulfathiazole 海水 ND Diaveridine 海水 ND Sulfamerazin 海水 ND Sulfatroxazole 海水 ND Sulfisoxazole 海水 ND Ormetoprim 海水 ND Sulfabenzamide 海水 ND Sulfisomidine 海水 ND Sulfadimidine 海水 ND Sulfamethoxypyridazine 海水 ND Sulfamonomethoxine 海水 ND Sulfachloropyridazine 海水 ND Trimethoprim 海水 ND Sulfaethoxypyridazine 海水 ND Sulfaquinoxaline 海水 ND Sulfadoxin 海水 ND Sulfadimethoxin 海水 ND Sulfanitran 海水 ND Sulfabromomethazine 海水 ND ( 注 ) スルファセタミドは酸性下で通水する必要があるため ph 未調整で通水した同時分析ではほとんど回収できなかった岡山県環境保健センター年報 4

13 4 まとめ合成抗菌剤であるサルファ剤等物質の多成分同時分析法を検討し, 次の結果を得た対象物質は, 逆相系固相カートリッジの Oasis HLB に通水し, メタノール 5mL で溶出する方法で抽出できることがわかったスルファセタミドは酸性で通水する必要があったが, その他の物質は ph 調整不要であり, 多成分を簡易かつ一斉に分析することが目的であるため, 同物質を除く 6 物質の分析法とした 3逆相 - イオン交換ミックスモード固相を検討したが, 対象物質により挙動が異なり, 回収率も低かったため採用しないこととした 4 保持時間が短い物質では, 注入量を増加させるか, 試験液の有機溶媒の割合を増加させると, ピークがリーディングして形状が崩れる傾向にあった 5 測定カラムは,Atlantis T3 がピーク幅が狭く, 保持時間が短い物質でもリーディングが少なかった 6 開発した分析法は, 水質試料中のサルファ剤等 6 物質の分析に適用でき, 検出下限は,3.6 ~ ng/l であった 7 河川水及び海水を用いた添加回収試験 ( 河川水は. μg/l, 海水は. μg/l 添加 ) の回収率は, それぞれ 73 ~ 7,58 ~ 3 であったなお, 本研究は環境省委託の平成 5 年度化学物質分析法開発調査 ( 環境省環境安全課 ) と連携して実施した文献 ) 大月史彦, 肥塚加奈江, 前田大輔, 山本淳 : 厚生労働省ガイドラインによる残留動物用医薬品一斉試験法の妥当性評価, 岡山県環境保健センター年報, 35,9-3, ) 浦山豊弘, 肥塚加奈江, 赤木正章, 山本淳 : 厚生労働省ガイドラインによる残留動物用医薬品一斉試験法の妥当性評価 ( 第報 ), 岡山県環境保健センター年報,36,9-4, 3) 浦山豊弘, 肥塚加奈江, 赤木正章, 北村雅美 : 厚生労働省ガイドラインによる残留動物用医薬品一斉試験法の妥当性評価 ( 第 3 報 ), 岡山県環境保健センター年報,37,37-44,3 4) 環境省総合環境政策局環境保健部環境安全課 : 化学物質環境実態調査実施の手引き ( 平成年度版 ), 平成年 3 月,9 5) 浦山豊弘, 杉山広和, 劒持堅志, 藤原博一, 鷹野洋ら :LC/MS による農薬の多成分同時分析のための基礎的検討, 岡山県環境保健センター年報,3, 57-6,6 6) 浦山豊弘, 劒持堅志, 吉岡敏行, 藤原博一, 中桐基晴 :LC/MS による農薬の多成分同時分析のための基礎的検討 (Ⅱ), 岡山県環境保健センター年報, 3, 75,7 7) 浦山豊弘, 劒持堅志, 吉岡敏行, 藤原博一, 中桐基晴 :LC/MS を用いた水質中モノハロゲン化フェノール類の分析法, 岡山県環境保健センター年報,3, 59-65,8 4 岡山県環境保健センター年報

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06_新_マクロライド系.indd 岡山県環境保健センター年報 39, 43 53, 2015 調査研究事故時等緊急時の化学物質の分析技術の開発に関する研究 -マクロライド系抗生物質の水質分析法の検討- Study on the development of analysis method of chemical substances at the time of water quality accidents - Study on