極小の発光タグ HiBiT 実験特集 2017 年秋号 Promega KWRBN NanoLuc 8 NanoLuc NanoLuc RN ID 9 13 15 NanoLuc 8 4 4-7 2 3 頁 発光タグ HiBiT によるタンパク質発現解析新時代の幕開け 4 頁 HiBiT システムを用いた筋芽細胞細胞融合のモニター系 5 頁 Bi-molecular complementation assay を利用したアルツハイマー病など神経変性疾患病因研究 6 頁 NanoLuc を用いた BRET バイオセンサー BTeam による生細胞内 TP 濃度計測 7 頁 ルシフェラーゼ遺伝子を応用した分泌タンパク質の解析 8 頁 HiBiT 実験 Q& プロメガ株式会社
HiBiT FLuc NanoLuc NanoBiT Fluc GFP 2012 NanoLuc 19 KDa 1/3 100 NanoLuc 11 SmBiT HiBiT 18KDa LgBiT NanoBiT LgBiT 2 SmBiT HiBiT 100 1/100 CMV HiBiT HiBiT 1 2 HiBiT NanoLuc Technology 蛍光標識物 assay BRET ドナー - タンパク質間相互作用 - 化合物タンパク質相互作用 - センサー開発 NanoLuc Luciferase NanoBRET PPI Systems NanoBRET Target Engagement Systems ジェネティックレポーター ( レポーターアッセイ ) NanoLuc Dual & Single ssay 融合タンパク質の定量 分解測定 イメージングなど 発光量 : ホタルの約 100 倍 検出試薬 抗体などの分子標識 修飾基質による酵素アッセイ等 NanoBiT Technology Furimazine ( 細胞透過性 ) RealTime-Glo MT Expression (Fusion or stand alone) タンパク質間相互作用検出 タンパク質の多重化 / オリゴマー化検出 (PS-nnexin V 凝集 ) assay Large BiT (LgBiT) Small BiT (SmBiT) 低親和性 ( 可逆的 ) [Kd : 190µM] 11 アミノ酸 NanoBiT PPI System RealTime-Glo nnexin V System 発光量 : ホタルの約 30 倍 検出試薬成分 アプリケーションによっては細胞内発現により供給 High BiT (HiBiT) 高親和性 ( 不可逆的 ) [Kd : 700pM] 細胞内タンパク質アッセイ 細胞外タンパク質アッセイ 細胞融合 ウイルス感染 タンパク質の細胞間の伝搬の検出 ブロッティング検出 NanoGlo HiBiT Detection Systems 2 HiBiT 11 CRISPR/Cas9 HiBiT HiBiT dbet1 BRD4 PROTCProteolytic Targeting ChimeraE3 BRD4 CRISPR/Cas9 HiBiT- BRD4 dbet1 1. CMVTK CRISPR/Cas9 HiBiT-BRD4 dbet1 CMV HiBiT-BRD4 dbet1 TK HiBiT -BRD4
100,000-10,000 RLU Fluc 2,000-200 RLU HiBiT LgBiT 1B, C dbet HiBiT- BRD4 dbet1 EC 50 10 EC50 1/10 B EC50(nM) 200 150 100 50 0 Endogeneous Cellular Endogeneous HiBiT-BRD4 Transient.1 PROTC dbet1 HiBiT-BRD4 G GPCR G GPCR β GPCR ssay Window HiBiT Extracellular ssay GPCR β 2 DRB2 IsoproterenolISO EC50 51nM 84% SalmeterolSalmEC50 1nM 37 Salm cmp efficacy ISO 1 ISO efficacy HiBiT GPCR potency efficacy β NanoBRET BRET NanoBiT β GPCR β HiBiT 25 20 15 10 5 0 Endogeneous Cellular Endogeneous HiBiT-BRD4 Transient CMV TK HiBiT-BRD4 dbet1 B, C: LgBiT HiBiT-BRD4 CRISPR/Cas9 Live cell formatcrispr/cas9 HiBiT-BRD4lytic format HiBiT-BRD4 lytic format C GPCR HiBiT β DRB2 Salm β 1 HiBiT GPCR Normalized RLUs 1.5 Isoproterenol 1.0 0.5 0.0 Salbutamol Salmeterol Formoterol 0-10 -9-8 -7-6 -5-4 log [Compound] M.2 β 2- adrenagic receptordrb2 EC50nM Isoproterenol 50.9 16% Salbutamol 161 45% Salmeterol 1.04 63% Formoterol 2.92 16% DRB2 HiBiT 30 HiBiT Nano-Glo HiBiT Extracellular Reagent HiBiT N C N CFTRCytic Fibosis Transmembrane Conductance Regulator 508F CFTR CFTR HiBiT CFTR 2 DRB2 HiBiT HiBiT.3 CTFR B RLUs 800000 600000 400000 200000. HiBiT B. Wild type F508 Extracellualr format CTFR format CTFR HiBiT 11 LgBiT NanoLuc 0 Extracellular WT F508 1Sudarshan Rajagopal et al. Mol. Pharmacol. 2011, 80, 367 PromegaClub HiBiT www.promega.co.jp/promegaclub.html 3Promega KWRBN
NanoLuc ユーザーセミナー HiBiT HiBiT 1 C2C12 4 split GFP NanoLuc C LgBiT LgBiT 11 HiBiT LgBiTHiBiT GFP mcherrymch C2C12 GFP-LgBiTmCh-HiBiT NanoLuc 2 C2C12 NanoLuc DCytD NanoLuc C2C12 3 Nano-Glo Live Cell ssay NanoLuc MTT 2. HiBiT GFP-LgBiT, mcherry-hibit C2C12 1. 3. HiBiT HiBiT-LgBiT C2C12 NanoLuc a CytochalasinDCytDb NanoLuc C2C12 HiBiTLgBiT HiBiT 4
NanoLuc ユーザーセミナー NanoBiT Bi-molecular complementation assay () bi-molecular complementation assay amyloid β peptide β split-luciferase complementation assay β Hashimoto, JBC 2011, JNS 2012 NanoBiT FUS (B) 1. FUS FUS FUS LgBiT SmBiT FUSB LgBiT-FUS SmBiT-FUS HEK293 20 luminescence GloMax Navigator CLgBiT-FUS SmBiT-FUS FUS FUS 27 alls N=5, ( *** ) p<0.001 2. FUS FUS LgBiT-FUS SmBiT-FUS HEK293 FUS BLgBiT-FUS SmBiT-FUS HEK293 72 luminescence GloMax Navigator luminescence FUS N=3 FUS FUS FUS bi-molecular complementation assay NanoBiT split luciferase 2 HiBiT 5Promega KWRBN
NanoLuc ユーザーセミナー NanoLuc NanoLuc BRET BTeam TP FRET Team TP ε CFP YFPTeam CFP NanoLuc TP BRET TP BTeam TP ε NanoLuc YFP BRET TP ε BRET YFP 1 TP http://www.imamura. lif.kyoto-u.ac.jp/index.html BTeam NanoLuc BRET YFP NanoLuc TP BTeam BRET BTeam BRET TP 4 mm 2 3 mm BTeam BRET 1B BTeam TP TP B 1. Bteam BTeam ε NanoLuc YFP BRET BBTeam BRET TP NanoLuc BRET TP BTeam TP BTeam TP Yoshida, Kakizuka & Imamura (2016), BTeam, a novel BRET-based biosensor for the accurate quantification of TP concentration within living cells." Scientific Reports 6, 39618. 6 CellTiter-Glo TP BTeam TP FRET BRET NanoBiT TP
NanoLuc ユーザーセミナー HiBiT Nucleus ER Free Ribosomes Golgi IL1 β ELIS NanoLuc IL1 βil1 β -NanoLuc NanoLuc NanoLuc HiBiT HiBiT HiBiT LgBiT HiBiT 2017 Transport Vehicle 1. ELIS Luciferase assay ELIS NanoLuc /HiBiT HiBiT HiBiT 2017 2. IL1 β HEK293T IL1 β Casp1-Venus 48 IL1 β -NanoLuc HiBiT HiBiT 2017 ELIS NanoLuc /HiBiT NanoLuc HiBiT 11 HiBiT F LG HiBiT 12/7 2017 Luciferase ctivity medium (counts/s) 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 Plasmid amounts Mock Cell:HEK293T cell plasmid:il1β-luc+csp1-venus(50ng) 10 25 100 10 25 100 10 25 100 (ng) IL1β-Luc2 IL1β-hRLuc IL1β-NanoLuc N=4, Error bar indicates ±SD 7Promega KWRBN
HiBiT HiBiT 1 www.promega.co.jp/nanobitsynthesis/ HiBiT N C N C His Flagc-Myc N C HiBiT ORF HiBiT ORF HiBiT HiBiT LgBiT Nano-Glo HiBiT Extracellular Detection System N2420 20 HiBiT Flexi cloning site CRISPR-Mediated Tagging of Endogenous Proteins with a Luminescent Peptide http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acschembio.7b00549 CRISPR/Cas9 RN DN HiBiT Cas9 CRISPR/Cas9 HiBiT http://www.promega.co.jp/hibitcrispr/ HiBiT LgBiT HiBiT HiBiT-LgBiT Kd=7x10-10 M His FLGc-Myc Kd=2.2x10-9 1x10-5 M HiBiT 2017 HiBiT 2017 12 22 www.promega.co.jp/hibitcamp/ HiBiT www.promega.co.jp/hibitserv/ RentaMX HiBiT The Future of HiBiT Technology for Molecular Biological nalysis No. 2LS02 12 7 1145 1245 2 2 12 ConBio2017 40 / 90 HiBiT www.promega.co.jp/rentamax/ 7 Web sitewww.promega.jp Tel. 03-3669-7980 / Fax. 03-3669-7982 E-Mail : prometec@jp.promega.com プロメガ株式会社本社 103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町 14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981/Fax. 03-3669-7982 販売店 大阪事務所 532-0011 大阪市淀川区西中島 6-8-8 花原第 8 ビル 704 号室 Tel. 06-6390-7051/Fax. 06-6390-7052 製品の仕様 価格については 2017 年 10 月現在のものであり予告なしに変更することがあります PK1710-04B