ARKY 22 イオンクロマトグラフィーによる有機酸の測定 はじめに 食品や飲料に含まれる有機酸は 味や香りを特徴づける大切な成分のひとつです また 有機酸は広く環境中にも存在するばかりでなく 化成品などの原料としても広く用いられています したがって 食品や製品の品質管理 環境水の監視に有機酸の測定は重要な意味を持ちます イオンクロマトグラフィーは無機イオンの測定はもちろん このような試料中の有機酸の測定にも広く用いられています イオン排除カラムを用いる有機酸の測定 イオンクロマトグラフィーにおいて 有機酸類はイオン交換 イオン排除または逆相モードで分離することができます 各分離モードによって 溶出順序やマトリックスによる影響が全く異なるため 適したモードを選択することが必要です イオン排除分離カラムには水素型強酸性陽イオン交換樹脂が充填されています 一般に官能基はスルホン酸とカルボン酸型で 水溶液中では完全に解離しています 強酸性の溶離液を流すと 固定相と移動相にわずかな酸性度の違いが生じます この層の境界部分は選択性を有する膜として考えると都合がよく ドナン膜と呼ばれています 分離は ドナン膜を介する分配作用によりおこなわれます 例えば 塩化物イオンや硫酸イオンのように水溶液中で完全にイオン化している陰イオンは 固定相のスルホン酸基の負電荷と反発し 保持されません 固定相 COO COO COO (COOH) 2 CH COOH ドナン膜 Cl 2 (COO ) 2 図 イオン排除分離のメカニズム CH COO 移動相 一方 酸性水溶液中でほとんど解離せず分子の状態で存在している弱酸は ドナン膜内に分配されます つまり解離定数 (pka) の高い成分ほど樹脂に強く保持され溶出が遅くなります その保持の強弱によって溶出時間が異なることを利用して分離がおこなわれます 図 にイオン排除のメカニズムを示します シュウ酸のようなジカルボン酸は 表 に示すように二段階に解離します pkaは. とイオン性が高いことを示しており 実際に分析するとウォーターディップ付近に溶出します pka の他にも 側鎖型異性体は直鎖型異性体よりも早く溶出する 二重結合を有する酸は遅く溶出する傾向があるなど 有機酸の構造も溶出順序に作用します 表 有機酸類の解離定数 ( 化学便覧第 版より ) <モノカルボン酸 > 和 名 pka pka2 pka ギ酸. 酢酸.6 プロピオン酸.67 酪酸.6 イソ酪酸.6 吉草酸.6 イソ吉草酸.8 ヘキサン酸.6 オクタン酸.89 グリコール酸.6 乳酸.66 ピルビン酸 2.26 <ジカルボン酸 > 和 名 pka pka2 pka シュウ酸..82 マロン酸 2.6.28 コハク酸..2 グルタル酸.. アジピン酸.26. ピメリン酸..8 リンゴ酸.2.7 d 酒石酸 2.82.96 アクリル酸.26 マレイン酸.7.8 フマル酸 2.8. フタル酸 2.7.9
<トリカルボン酸 > 和 名 pka pka2 pka クエン酸 2.9..66 図 2 は 2 種類のイオン排除カラムを用いた代表的な有機酸の測定例です ギ酸 酢酸 プロピオン酸の解離定数 (pka) はぞれぞれ..6.67 であり pka の低い順に溶出していることがわかります IonPac ICEAS は pka の大きい有機酸でも比較的早く溶出します IonPac ICEAS6 は pka の小さい有機酸類の分離に適したカラムです 図 2 の分析条件 カラム (A) IonPac ICEAS (B) IonPac ICEAS6 溶離液 (A). mmol/l オクタンスルホン酸 (B). mmol/l ヘプタフルオロ酪酸 サプレッサー AMMSICE II 再生液 mmol/l 水酸化テトラブチルアンモニウム 再生液流量 2. ml/min 恒温槽温度 試料導入量 (A) 2μL, (B) μl ピーク (mg/l) 成分名 A B 成分名 A B シュウ酸 7 乳酸 2 酒石酸 8 ヒドロキシイソ酪酸 クエン酸 9 酢酸 2 リンゴ酸 2 コハク酸 グリコール酸 プロピオン酸 6 ギ酸 2 酪酸 図 に雨水中の有機酸の測定例を示します 雨水中にもわ ずかですが有機酸が含まれています 図 の分析条件 カラム IonPac ICEAS6 溶離液. mmol/l ヘプタフルオロ酪酸 サプレッサー AMMSICE II 再生液 mmol/l 水酸化テトラブチルアンモニウム 再生液流量 2. ml/min 恒温槽温度 試料導入量 μl.7 (A) IonPac ICEAS..8.6..2.2. 7 6 9 2 μs/ cm 7 6 9.2 2 図 雨水中の有機酸の測定例 8 7 6 2 2 6 8 2 6 (B) IonPac ICEAS6 2 6 7 8 9 2 2 図 2 イオン排除モードによる有機酸の測定例 ピーク クエン酸 9 酢酸 6 ギ酸 炭酸 7 乳酸 イオン交換モードでは 溶離液の濃度を上げると測定成分 の溶出時間は早くなりますが イオン排除モードでは溶離液 の濃度を上げると溶出時間が遅くなる傾向があります イオン排除モードで測定する際には イオン排除専用のサ プレッサー (AMMSICE II) が必要です 強酸中の有機酸の測定 イオン排除モードは 試料中の強酸の影響を受けないという 利点があります
図 はイオン排除分離カラムを使用した醤油中に含まれる有機酸の測定例です 醤油には多量の塩化物イオンが含まれているため 陰イオン交換モードで測定をおこなうと塩化物イオンの付近に溶出してくる有機酸の定量ができません しかしイオン排除モードでは 塩化物イオンなどの強酸イオンはほとんど保持されないためウォーターディップ付近に溶出し 有機酸のピークに影響を与えません 図 では 6 分付近に溶出しているピークが塩化物イオンです このように強酸を多く含む試料中の有機酸の測定についてはイオン排除モードが適しています 図 の分析条件 カラム IonPac ICEAS6 溶離液. mmol/l ヘプタフルオロ酪酸 サプレッサー AMMSICE II 再生液 mmol/l 水酸化テトラブチルアンモニウム (TBAOH) 再生液流量 2. ml/min 恒温槽温度 検出器電気伝導度検出器試料導入量 μl 試料前処理試料を超純水で 倍希釈後ろ過 図 の分析条件 カラム IonPac ICEAS 溶離液. mmol/l オクタンスルホン酸 サプレッサー AMMS ICEII 再生液 mmol/l 水酸化テトラブチルアンモニウム / mmol/l ホウ酸 試料導入量 μl..8.6..2.2. 2 図 イオン排除モードによる炭酸の測定例ピーク (mg/l) 2 炭酸 2 6 7 9 2 2 図 イオン排除モードによる醤油中の有機酸の測定 ピーク 塩化物イオン 7 乳酸 クエン酸 9 酢酸 リンゴ酸 コハク酸 6 ギ酸 イオン排除モードによる炭酸の測定 イオン排除モードで炭酸を測定することができます 再生液にホウ酸を加えると ピーク終了点付近のマイナス側への落ち込みを防ぐことができます なお この条件では炭酸イオン (CO 2 ) は 炭酸水素イオン (HCO ) として分離 検出されるため 炭酸イオンと炭酸水素イオンの分離はできません 陰イオン交換モードによる有機酸の測定 陰イオン交換モードは 無機陰イオンと有機酸の同時測定が可能であり 分離の調節も容易です また 濃縮法も適用できるという利点があります 高濃度の無機陰イオン中の有機酸を測定するためには グラジエントシステム ( グラジエントポンプまたは溶離液ジェネレーター ) が必要な場合があります 一般に陰イオン交換モードにおいて グリコール酸 乳酸 プロピオン酸 酢酸 ギ酸はフッ化物イオンから塩化物イオンの間に溶出します また リンゴ酸 コハク酸 酒石酸は硫酸イオン付近に シュウ酸は硫酸イオンより少し遅れて溶出します クエン酸は 陰イオン交換カラムの標準条件ではかなり遅くに溶出するか カラムの種類によっては溶出しない場合もあります 陰イオン交換モードで測定する場合は 無機陰イオンとの分離に注意する必要があります 図 2 の (B) における成分のうち プロピオン酸とクエン酸を除いた成分を陰イオン交換モードで測定したクロマトグラムを図 6 に示します 上図は有機酸類 下図には無機陰イオンのクロマトグラムです
図 6 の分析条件 カラム IonPac AGA, ASA 溶離液 8 mmol/l Na2CO, mmol/l NaHCO サプレッサー ASRSULTRA 恒温槽温度 試料導入量 2μL 図 7 の分析条件 カラム IonPac AG7, AS7 溶離液 KOH ( 溶離液ジェネレーター EG 使用 ) グラジエント 2 mmol/l (~8 min), 2~ mmol/l (8 ~2 min), ~ mmol/l (2~ min) 溶離液流量. ml/min サプレッサー ASRSULTRA 試料導入量 2μL 7,9 6 8,2 7 9 6 2 6 78 9 9 2 7 8 6 9 2 6 8 2 6 8 2 図 6 イオン交換モードによる測定例ピーク (mg/l) グリコール酸 シュウ酸 7 乳酸 F 9 酢酸 2 Cl 6 6 ギ酸 6 NO2 8 ヒドロキシイソ酪酸 7 Br 2 リンゴ酸 2 8 NO 2 コハク酸 9 HPO 2 2 酒石酸 2 SO 2 2 2 2 図 7 イオン交換モードにおけるグラジエント例 ピーク (mg/l) 7 乳酸 F 2 9 酢酸 Cl 6 ギ酸 6 NO2 炭酸 7 Br コハク酸 8 NO リンゴ酸 2 SO 2 シュウ酸 9 HPO 2 クエン酸 陰イオン交換モードでは フッ化物イオンと塩化物イオンの間に溶出する乳酸 グリコール酸 酢酸 ギ酸 プロピオン酸などを十分に分離できないことがあります 陰イオン交換カラムの種類および溶離液の種類や濃度を最適化すれば ある程度分離することもできますが 硫酸イオンなどのように保持の強いイオンとの同時測定は困難です このような場合は イオン交換モードでグラジエントをおこなう必要があります 図 7 に陰イオン交換カラムを用いた無機陰イオンと有機酸の一斉分析例を示します 低濃度有機酸の測定 イオン排除モードでは濃縮導入法 ( 濃縮カラムにイオンをトラップして感度を上げる操作 ) を適用できないため 低濃度の有機酸は試料を大容量 (.~2 ml) 導入して測定する必要があります しかし この方法ではウォーターディップが大きくなるため フッ化物イオン付近に溶出する有機酸の定量が困難である場合や 極低濃度の有機酸を検出することができない場合があります イオン交換モードでは濃縮導入法を用いることで μg/l レベルの有機酸の測定が可能です 図 8 は濃縮導入法を利用したμg/Lレベルの有機酸と無機陰イオンの同時測定例です なお 乳酸や酢酸など フッ化物イオン付近に溶出する有機酸類はコンタミネーションしやすい 成分自体の安定性が低い 濃縮カラムに保持されにくいなどの理由で 極微量を再現性
よく濃縮することは難しいので注意してください ( 濃縮導入法については技術資料 TR78 をご覧ください ) 図 8 の分析条件 カラム IonPac AG7, AS7 溶離液 KOH ( 溶離液ジェネレーター EG 使用 ) グラジエント mmol/l (~8 min), ~8 mmol/l (8 ~ min), 8 mmol/l ( min ~) 溶離液流量. ml/min サプレッサー ASRSULTRA 試料濃縮量 ml 2. 2.... 9 6 2 6 8 7 2 9 22 2 2 図 8 有機酸と無機陰イオンの濃縮法によるクロマトグラムピーク (μg/l) F 8 NO 9 酢酸 炭酸 6 ギ酸 2 SO 2 2 メタクリル酸 シュウ酸 Cl 2 9 PO 6 NO2 22 o フタル酸 7 Br UV 検出器による有機酸の測定 有機酸はカルボニル基 (COO) やベンゼン環などの紫外部に吸収を持つ官能基を有しているため 紫外吸光光度 (UV) 検出器を用いて検出をおこなうことができます カルボニル基の吸光度はあまり大きくありませんが 2 nm 付近に極大吸収を持ちます 表 2 に 電気伝導度と UV 検出器 ( 2 nm) の検出感度の比較を示します 表 2 より 安息香酸や oフタル酸 フマル酸は電気伝導度よりも UV の方がはるかに感度がよいことがわかります 逆にギ酸やグリコール酸は 電気伝導度の感度の方が良好です 電気伝導度検出器と UV 検出器を直列に接続し 同時に検出をおこなうこともできます 溶離液に UV 吸収を持つ成分が含まれている場合 UV 検出器は使えません 例えば イオン排除モードの溶離液の つであるオクタンスルホン酸は UV 吸収があるため UV 検出器による検出は不可能です 表 2 電気伝導度と UV 検出器 ( 2 nm) の検出感度比較 電気伝導度 UV 電気伝導度 ピーク高さ * ピーク高さ * とUVの検出 (μs) (mau) 感度比 * 2 安息香酸.27 2.68 2. イソ吉草酸.2.29.6 イソ酪酸..6.7 ギ酸 7..7. 吉草酸... クエン酸..2. グリコール酸.2.9. グルコン酸.69.79.2 コハク酸.7.9.6 酢酸..6. 酒石酸.6.7. シュウ酸 2.66.. 乳酸..2. oフタル酸. 29. 2. フマル酸..28 2. マレイン酸.6 8.6 28. マロン酸.7.69.2 酪酸.2.. Lリンゴ酸.29.79. *; mg/l の標準を 2 μl 導入したときの値 *2; それぞれの検出法においてベースラインノイズを としたときのピーク強度を計算し UV に対する電気伝導度の値で示した 有機酸測定時の注意事項 有機酸は無機イオンと比べて分解が早いため 標準液やサンプルは室温で保存せず 冷蔵庫で保存するようにしてください mg/l レベルの有機酸は室温で 晩放置しただけで分解してしまうことがあります 低濃度の標準液は毎日調製し直すことをお勧めします イオン排除モードの溶離液に使用するオクタンスルホン酸と再生液に使用する水酸化テトラブチルアンモニウムは 市販されている試薬ではバックグラウンド電気伝導度が下がらないなどの問題が生じる恐れがあるため 必ずダイオネクス社製の純正試薬をご使用ください