D 型インフルエンザ D 型インフルエンザウイルスの発見 ウイルス分子性状と病原性 わが国における D 型インフルエンザ疫学調査 日本株の分離と性状解析 D 型ウイルス粒子内ゲノム構造 堀本泰介 東京大学大学院農学生命科学研究科獣医微生物学教室
インフルエンザウイルス 型 A B C D 亜型 宿主 ヒト流行 HA (H1-H18) NA (N1-N11) ヒトブタウマ鳥その他 季節性パンデミック なし なし ヒトヒト ( アザラシ )( ブタ ) 季節性 小規模?? ウシブタ??
D 型インフルエンザウイルス (Flu D) 呼吸器疾患のブタから分離 (C/swine/Oklahoma/1334/2011) AGID 抗原性が Flu C とは異なる ウシが主要な宿主動物
分離ウイルス 1. A, B, C 型と免疫拡散法で抗原交差しない 2. 7 本鎖 3. C 型との遺伝学的距離が A 型と B 型の差と同じくらい離れている 4. C 型と遺伝子交雑しない 5. ゲノム分節末端配列が C 型と異なる 6. M1 の転写の仕方が C 型と異なる 7. ウシ, ヒツジ, ヤギに感染する 8. ヒトへの感染性が明らかでない 9. ヨーロッパ アジアでも見つかる Influenza D virus(ictv 2016)
Orthomyxoviridae の分類 (ICTV 2017) Genus: Alphainfluenzavirus Species: Influenza A virus human influenza A virus, avian influenza A virus, swine influenza A virus, equine influenza A virus, canine influenza A virus Genus: Betainfluenzavirus Species: Influenza B virus human influenza B virus Genus: Gammainfluenzavirus Species: Influenza C virus human influenza C virus Genus: Deltainfluenzavirus Species: Influenza D virus bovine influenza D virus, swine influenza D virus その他の Genus: Isavirus, Quaranjavirus, Thogotovirus
インフルエンザウイルスの構造 Flu C/D 7 分節 Flu A/B 8 分節 HEF: hemagglutinin-esterase-fusion Wang and Veit, Protein Cell, 2016
オルソミクソウイルス系統樹 NP Flu C Flu D Flu A Flu B Isa, Thogoto HEF Flu C Flu D Hause et al, mbio, 2014
Flu D vs. Flu C タンパク質 PB2 PB1 P3 HEF NP P42 NS1/2 相同性 (%) 53 70 50 53 40 38 33/29 Terminal sequence 3 -UCGUCUUCGUC- Flu C ORF pu -GAACGAUGACGA-5 3 -UCGUAUUCGUC- Flu D HEF, M, NS pu -GAACGAUGACGA-5 3 -CCGUAUUCGUC- 3Ps & NP pu -GAACGAUGACGA-5
Flu D のゲノム構造 Su et al. Virulence, 2017
Flu A/B HA vs. Flu C/D HEF (C only) (D only) HA HEF (D only) Wang and Veit, Protein Cell, 2016
HA vs. HEF (Flu C) RTK (Flu D) KK Different acylation and lipid raft association of HA or HEF protein. Wang and Veit, Protein Cell, 2016
細胞レセプター : HEF vs. HA エステラーゼ切断部位 ノイラミニダーゼ切断部位 Flu C, D のレセプター 9-O- アセチルシアル酸 Flu A, B のレセプター α2,3/2,6- シアル酸 Song, Gao et al, PloS Pathog, 2016
牛呼吸器病症候群 (BRDC) ウイルス 細菌 ストレス等の複合的要因によって発生例 : 輸送熱 流行性肺炎世界全体で 3,600 億円以上 / 年の経済的被害 ウイルス牛伝染性鼻気管炎ウイルス牛ウイルス性下痢ウイルス牛パラインフルウイルス 3 牛 RS ウイルス牛アデノウイルス牛コロナウイルス牛鼻炎 A/B ウイルス牛パルボウイルス 細菌マンヘミアマイコプラズマパスツレラヒストフィルス 環境因子ストレス 気温湿度 ガスほこり 臨床症状 急性期 : 食欲消失 高熱 呼吸促拍 沈鬱 咳 鼻汁 慢性期 : 衰弱 咳 呼吸困難
牛呼吸器病症候群 (BRDC) ワクチンを接種しても BRDC は発生する ウイルス牛伝染性鼻気管炎ウイルス牛ウイルス性下痢ウイルス牛パラインフルウイルス 3 牛 RS ウイルス牛アデノウイルス牛コロナウイルス牛鼻炎 A/B ウイルス牛パルボウイルス 混合ワクチン メタゲノム解析で これらよりも D 型インフルエンザウイルスの方が BRDC 牛から高頻度に検出 (2016) 現在の BRDC の主要病原体は Flu D である可能性
D 型インフルエンザウイルスが検出された国 (2015 年まで ) 日本の牛における D 型ウイルスの 疫学調査
D 型ウイルス特異抗体の検出 血清 ( 血漿 ) 茨城県下の牧場飼育の乳用牛 ( ホルスタイン )28 頭 RDE 非働化処理 ウイルス D/swine/Oklahoma/1334/2011 ( カンザス大 Hause 博士より分与 ) 0.6% 七面鳥赤血球を用いて HI 試験 ( 1:40 を陽性 ) Murakami et al, EID, 2016
1/8 採血採血時年齢 5y6m 4y5m 3y11m 3y10m 3y4m 3y4m 3y4m 3y3m 3y1m 2y2m 2y1m 2y1m 2y0m 1y12m 1y7m 1y3m 1y0m 0y11m 0y8m 0y7m 7y9m 8y0m 6y11m 6y3m 7y10m 1y11m 1y10m 9y0m 160 640 160 160 HI 価過去に Flu D に感染わが国にも Flu D は存在 No. 移動歴 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 茨城茨城茨城茨城茨城茨城茨城茨城茨城茨城茨城茨城茨城茨城茨城茨城茨城茨城茨城茨城北海道北海道茨城茨城北海道茨城 北海道茨城 北海道茨城
No. 1/8 採血 HI 価 2/3 採血 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 160 640 160 160 40 160 160 160 320 160 160 160 160 160 160 40 320 160 160 320 160 40 鼻スワブ RT-PCR 陽性 ゲノム全塩基配列を決定 ( 茨城株 ) ウイルス分離は陰性 本牧場において Flu D の流行があった
日本における抗体保有状況まとめ 陽性率 0% ~15% ~30% ~45% 45%~ 計 30.4% Horimoto et al, PloS One, 2016
D 型ウイルス抗体陽性率 陽性率 (%) 60 40 20 陽性数 140 120 60 40 20 ホルスタイン黒毛和種 0 ホルスタイン 黒毛和種 0 40 160 HI 価 320 640
D 型ウイルス抗体陽性率 陽性率 (%) 60 40 陽性率 (%) 60 40 20 20 0 2010 2012 2013 2014 2015 2016 0 0.5 1 2 3 4 5 6 7 8- 年齢 採血年
宮崎県内農場別抗体陽性率 陽性率 (%) 60 40 20 0 3 5 8 9 11 12 13 14 15 17 18 19 20 21 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 農場番号 高い水平伝播性を示唆
Flu D が検出された国 (2017 年まで ) ケニアラクダ 99% 抗体陽性自然宿主?? Salem et al, EID, 2017
エチオピアのヒトコブラクダ血清 泉對博先生 ( 日大獣医 ) 地域動物種サンプル数 Bati 近郊 ラクダヤギヒツジウシロバ 21 12 20 8 2 Jijiga 近郊 ラクダウシヤギ 17 7 8 Bati Jijiga 合計 ラクダウシヤギヒツジロバ 38 15 20 20 2 95 放牧地を共有 夜になって放牧地から連れて帰り家畜ごとに収容
HI 結果 エチオピアのヒトコブラクダ血清 地域動物種陽性数 ( 陽性率 %) Bati 近郊 Jijiga 近郊 合計 ラクダヤギヒツジウシロバ ラクダウシヤギ ラクダヤギヒツジウシロバ 19/21 (90.5) 1/12 (8.3) 0/20 (0) 0/8 (0) 0/2 (0) 3/17 (17.6) 0/7 (0) 0/8 (0) 22/38 (57.9) 1/20 (5.0) 0/20 (0) 0/15 (0) 0/2 (0)
モンゴルのフタコブラクダ血清 HI 結果 40 検体全て陰性 () ラクダは草原で放牧 所有者はゲルに居住し家畜とともに移動 夜になっても放牧したまま 15 samples 10 samples 15 samples
まとめ 国内において FluD による牛の呼吸器疾患を初めて検出した FluD はすでに全国的にウシ社会に侵淫している FluD の自然宿主は東アフリカのヒトコブラクダである?
ウシ Flu D の分離と性状解析 呼吸器症状牛の鼻腔検体 ( 山形 ) 牧場 月齢 性別 Flu D (RT-PCR) A 14 陽性 A 14 陽性 ウイルス分離 HRT-18G ヒト結腸癌 ) trypsin 存在下で継代 5 日 5 日 ST ( ブタ精巣 ) CPE 観察 HA 価 8 D/bovine/ Yamagata/ 2016 ( 山形株 )
PB2 PB1 P3 HEF NP M NS 日本株の系統樹解析 D/bovine/Nebraska/9-5/2012 D/bovine/Oklahoma/660/2013 D/bovine/Texas/3-13/2011 D/bovine/Kansas/11-8/2012 D/bovine/Kansas/13-21/2012 D/bovine/Minnesota/628/2013 D/bovine/Minnesota/729/2013 D/bovine/Italy/1/2014 D/bovine/Italy/46484/2015 D/bovine/Mississippi/C00046N/2014 D/bovine/Kansas/14-22/2012 D/swine/Oklahoma/1334/2011 D/swine/Italy/199724-3/2015 D/bovine/Kansas/1-35/2010 D/bovine/France/2986/2012 D/bovine/Shandong/Y125/2014 D/bovine/Shandong/Y127/2014 D/bovine/Shandong/Y217/2014 D/bovine/Miyazaki/B22/2016 D/bovine/Ibaraki/7768/2016 D/bovine/Ibaraki/7765/2016 D/bovine/Yamagata/10710/2016 97 84 97 88 89 74 97 94 0.0050 D/bovine/Minnesota/628/2013 D/bovine/Minnesota/729/2013 D/bovine/Kansas/13-21/2012 D/bovine/Kansas/1-35/2010 D/bovine/Texas/3-13/2011 D/bovine/Nebraska/9-5/2012 D/bovine/Kansas/11-8/2012 D/bovine/Oklahoma/660/2013 D/bovine/Mississippi/C00046N/2014 D/swine/Oklahoma/1334/2011 D/bovine/Kansas/14-22/2012 D/swine/Italy/199724-3/2015 D/bovine/Italy/46484/2015 D/bovine/Italy/1/2014 D/bovine/Shandong/Y125/2014 D/bovine/Shandong/Y127/2014 D/bovine/Shandong/Y217/2014 D/bovine/France/2986/2012 D/bovine/Miyazaki/B22/2016 D/bovine/Ibaraki/7768/2016 95D/bovine/Yamagata/10710/2016 99 89 13 67 95 82 98 77 55 96 0.0050 D/bovine/Shandong/Y217/2014 D/bovine/Shandong/Y125/2014 D/bovine/Shandong/Y127/2014 D/bovine/France/2986/2012 D/bovine/Miyazaki/B22/2016 D/bovine/Ibaraki/7768/2016 D/bovine/Ibaraki/7765/2016 D/bovine/Yamagata/10710/2016 D/bovine/Mississippi/C00046N/2014 D/swine/Oklahoma/1334/2011 D/bovine/Kansas/14-22/2012 D/swine/Italy/199724-3/2015 D/bovine/Italy/1/2014 D/bovine/Italy/46484/2015 D/bovine/Texas/3-13/2011 D/bovine/Kansas/1-35/2010 D/bovine/Minnesota/628/2013 D/bovine/Minnesota/729/2013 D/bovine/Kansas/13-21/2012 D/bovine/Kansas/11-8/2012 D/bovine/Oklahoma/660/2013 D/bovine/Nebraska/9-5/2012 62 86 92 59 54 50 42 61 98 0.0050 D/bovine/Shandong/Y127/2014 D/bovine/Shandong/Y125/2014 D/bovine/Shandong/Y217/2014 D/bovine/Kansas/1-35/2010 D/bovine/Kansas/11-8/2012 D/bovine/Nebraska/9-5/2012 D/bovine/Oklahoma/660/2013 D/swine/Oklahoma/1334/2011 D/bovine/Mississippi/C00046N/2014 D/bovine/Kansas/14-22/2012 D/bovine/Italy/46484/2015 D/bovine/Italy/1/2014 D/swine/Italy/199724-3/2015 D/bovine/France/2986/2012 D/bovine/Texas/3-13/2011 D/bovine/Kansas/13-21/2012 D/bovine/Minnesota/628/2013 D/bovine/Minnesota/729/2013 D/bovine/Miyazaki/B22/2016 D/bovine/Yamagata/10710/2016 D/bovine/Ibaraki/7768/2016 92D/bovine/Ibaraki/7765/2016 94 99 89 95 65 70 94 74 42 0.0050 D/bovine/Italy/46484/2015 D/swine/Italy/199724-3/2015 D/bovine/Italy/1/2014 D/bovine/Mississippi/C00030P/2014 D/bovine/Mississippi/C00046N/2014 D/bovine/Kansas/14-22/2012 D/swine/Oklahoma/1334/2011 D/bovine/Kansas/1-35/2010 D/bovine/Minnesota/628/2013 D/bovine/Minnesota/729/2013 D/bovine/Shandong/Y127/2014 D/bovine/Shandong/Y125/2014 D/bovine/Shandong/Y217/2014 D/bovine/France/2986/2012 D/bovine/Kansas/13-21/2012 D/bovine/Texas/3-13/2011 D/bovine/Kansas/11-8/2012 D/bovine/Nebraska/9-5/2012 D/bovine/Oklahoma/660/2013 D/bovine/Mississippi/C00014N/2014 D/bovine/Mississippi/C00013N/2014 D/bovine/Miyazaki/B22/2016 D/bovine/Yamagata/10710/2016 D/bovine/Ibaraki/7768/2016 D/Bovine/Ibaraki/7765/2016 76 87 99 99 42 40 98 72 94 67 0.0050 D/swine/Italy/199724-3/2015 D/bovine/Italy/1/2014 D/bovine/Italy/46484/2015 D/bovine/Mississippi/C00046N/2014 D/swine/Oklahoma/1334/2011 D/bovine/Texas/3-13/2011 D/bovine/Shandong/Y125/2014 D/bovine/Shandong/Y127/2014 D/bovine/Shandong/Y217/2014 D/bovine/France/2986/2012 D/bovine/Kansas/1-35/2010 D/bovine/Minnesota/628/2013 D/bovine/Minnesota/729/2013 D/bovine/Kansas/13-21/2012 D/bovine/Oklahoma/660/2013 D/bovine/Nebraska/9-5/2012 D/bovine/Kansas/11-8/2012 D/bovine/Kansas/14-22/2012 D/bovine/Miyazaki/B22/2016 D/bovine/Yamagata/10710/2016 D/bovine/Ibaraki/7768/2016 D/bovine/Ibaraki/7765/2016 99 63 66 95 97 62 57 99 98 97 0.0050 D/bovine/Italy/1/2014 D/swine/Italy/199724-3/2015 D/bovine/Nebraska/9-5/2012 D/bovine/Oklahoma/660/2013 D/bovine/Kansas/11-8/2012 D/bovine/Minnesota/628/2013 D/bovine/Minnesota/729/2013 D/bovine/Texas/3-13/2011 D/bovine/Kansas/1-35/2010 D/bovine/Kansas/13-21/2012 D/swine/Oklahoma/1334/2011 D/bovine/Kansas/14-22/2012 D/bovine/Mississippi/C00046N/2014 D/bovine/France/2986/2012 D/bovine/Shandong/Y125/2014 D/bovine/Shandong/Y127/2014 D/bovine/Shandong/Y217/2014 D/bovine/Miyazaki/B22/2016 D/bovine/Ibaraki/7765/2016 D/bovine/Ibaraki/7768/2016 D/bovine/Yamagata/10710/2016 99 57 89 99 75 58 55 59 0.0050
伊仏中米 2 米 1 日 D/bovine/Italy/46484/2015 D/swine/Italy/199724-3/2015 D/bovine/Italy/1/2014 D/bovine/Mississippi/C00030P/2014 D/bovine/Mississippi/C00046N/2014 D/bovine/Kansas/14-22/2012 D/swine/Oklahoma/1334/2011 D/bovine/Kansas/1-35/2010 D/bovine/Minnesota/628/2013 D/bovine/Minnesota/729/2013 D/bovine/Shandong/Y127/2014 D/bovine/Shandong/Y125/2014 D/bovine/Shandong/Y217/2014 D/bovine/France/2986/2012 D/bovine/Kansas/13-21/2012 D/bovine/Texas/3-13/2011 D/bovine/Kansas/11-8/2012 D/bovine/Nebraska/9-5/2012 D/bovine/Oklahoma/660/2013 D/bovine/Mississippi/C00014N/2014 D/bovine/Mississippi/C00013N/2014 D/bovine/Miyazaki/B22/2016 D/bovine/Yamagata/10710/2016 D/bovine/Ibaraki/7768/2016 D/Bovine/Ibaraki/7765/2016 99 99 40 98 94 0.0050 OK 系統 660 系統日本系統 HEF
M 42 98 D/bovine/Shandong/Y217/2014 D/bovine/Shandong/Y125/2014 D/bovine/Shandong/Y127/2014 D/bovine/France/2986/2012 D/bovine/Miyazaki/B22/2016 D/bovine/Ibaraki/7768/2016 D/bovine/Ibaraki/7765/2016 D/bovine/Yamagata/10710/2016 D/bovine/Mississippi/C00046N/2014 D/swine/Oklahoma/1334/2011 D/bovine/Kansas/14-22/2012 D/swine/Italy/199724-3/2015 D/bovine/Italy/1/2014 D/bovine/Italy/46484/2015 D/bovine/Texas/3-13/2011 D/bovine/Kansas/1-35/2010 D/bovine/Minnesota/628/2013 92 D/bovine/Minnesota/729/2013 D/bovine/Kansas/13-21/2012 50 D/bovine/Kansas/11-8/2012 D/bovine/Oklahoma/660/2013 D/bovine/Nebraska/9-5/2012 中仏日米 1 伊米 2 OK 系統 660 系統 0.0050
ホモロジー山形株 vs. 米国 OK 株 分節 塩基 アミノ酸 PB2 96% 98% PB1 96% 98% P3 96% 96% HEF 96% 95% NP 95% 96% M 97% 97% NS 96% 96% 日本株間 99.5~99.8% 99.6~%
HEF の系統間で異なるアミノ酸部位 OK 系統 vs. 日本系統 OK 系統 vs. 660 系統 日本系統 vs. 660 系統 K212(OK) R212(660) S212
単クローン性抗体の HI 反応性 クローン ウイルス山形株 OK 株 660 株 B4 6,400 1,600 6,400 B13 < < < R36 12,0 25,600 6,400 G22 3,200 < G27 2,040,0 < < G74 400 < 200
まとめ FluD 日本株 ( 山形株 ) を分離した 日本株は外国株と系統的に異なり 国内で独自に進化した 日本株は外国株と HEF 抗原性が異なる HEF 抗原には共通エピトープと系統特異エピトープがある
インフルエンザウイルス粒子内の RNP 数 A 型 B 型 50nm Nakatsu et al., mbio, 2016
人工的に作製した 7 分節 A 型ウイルスの RNP 数 8 vrnas 7 vrnas HA 分節欠損 8 本 (%) 8 本 7 本 (17%) (83%) N=11 N=12
HA(-) ウイルス粒子内の RNA の解析 野生型ウイルス HA(-) ウイルス Coverage Depth (nucleotide reads/total nucleotide reads) 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 0 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 0 PB2 PB1 PA HA NP NA M 5 12.1% NS Nucleotide position (crna for virus genes) 18S rrna 3 28S rrna 8.8% 6.5% Noda, Murakami et al. Nature Comm, 2018
7 分節の C 型, D 型ウイルスでは? C 型ウイルス D 型ウイルス 7 本 (30%) 8 本 (70%) 7 本 (27%) 8 本 (73%) Nakatsu et al., JVI, 2018
まとめ ゲノム分節数にかかわらずインフルエンザウイルスは 8 本の RNP を取り込んでいる ゲノムパッケージングの際に宿主 RNA を利用する可能性がある 8 本の RNP が 1+7 に配置することが効率のよいゲノムパッケージングに重要と考えられる
Acknowledgment カンザス大北大宮大岩大岐大鹿大麻大岩医大大阪府開業日生研鳥取県京大ウ再研東大医科研東大農 Ben Hause 日尾野隆大 迫田義博目堅博久 乗峰潤三彦野弘一 村上賢二猪島康雄安藤貴朗 乙丸孝之介 小澤真佐藤礼一郎 村上裕信 阪口雅弘村木靖石井一功大森崇司 田積晃浩 平修増田恒幸野田岳志河岡義裕小田切友葉 石田大歩 遠藤麻衣子 上間亜希子 小林知也 村上晋