ｽﾗｲﾄﾞ ﾀｲﾄﾙなし

広域 β-lactamase のスクリーニング法と確認試験 産業医科大学村谷哲郎

β ラクタム系 H C H 2 C O CH 2 O C β-lactam 環 H S O H H S CH 3 CH 3 COOH Ampicillin ペニシリン系 Cefazolin セフェム系 Imipenem H 3 C カルバペネム系 O OH C H O CH 2 S S CH 3 COOH SCH 2 CH2HCH COOH H

Monobactam, Carbapenem, Penem モノバクタム系アズトレオナムカルモナム カルバペネム系イミペネムパニペネムメロペネムビアペネム ペネム系ファロペネム H 3 C H 3 C H 2 OH C H O OH C H O S C C H O O O H 3 C C CH 3 COOH S SCH 2 CH2HCH COOH O COOH CH 3 SO 3 - Aztreonam H Imipenem Faropenem

Cephem 系薬剤 セファロスポリン系 C C H O H 2 S OCH 3 O セファマイシン系 OCH 3 CCH 2 S CH 2 C H O S Cefotaxime CH 2 OCCH 3 COOH O S Cefmetazole O CH 2 S COOH CH 3 各種 β-lactamase 特にClassA β-lactamase( 特にCxase typeⅠ) に安定であるため Bacteroides fragilis, Proteus vulgaris, Klebsiella oxytoca, Citrobacter koseriおよびesbl 産生菌にCephalosporinと比較して強い活性を示す

セフェム系の分類 セファロスポリン ( 注射用 ) 第一世代 : cefazolin 第二世代 : cefotiam, cefuroxime, cefamandole 第三世代 : cefotaxime, ceftriaxone, cefodizime, ceftizoxime, cefmenoxime ceftazidime cefoperazone, cefpimizole, cefpiramide 第四世代 : cefpirome, cefepime, cefozopran その他 : cefsulodin セファロスポリン ( 経口 ) 第一世代 : cephalexin, cefaclor 第二世代 : cefotiam*, cefuroxime* 第三世代 : cefixime, cefteram*, cefpodoxime* cefdinir, cefditoren*, cefcapene セファマイシン ( 注射 ) 第二世代 : cefmetazole, cefoxitin, flomoxef** 第三世代 :cefotetan, cefbuperazone, cefminox, latamoxef** *: prodrug **: oxacephamycin

Metallo-β-lactamase 産生株および ESBL 産生 株を除いた株に対する各種薬剤の感受性率 感受性率 (%) 100 80 60 40 20 P. mirabilis K. pneumoniae K. oxytoca C. koseri E. coli C. freundii E. aerogenes E. cloacae S. marcescens 0 染色体上の β-lactamase PM KP KO CK EC CF EA EL SM non Class A Class C :ampicillin, :cefazolin, :cefotiam, :ceftriaxon, :ceftazidime, :cefprome

O β-lactamase 阻害剤 Clavulanic acid: Class A 特異的 AmpC 誘導能高い Sulbactam: 主にClass Aを阻害 弱いながらClass Cも阻害する AmpC 誘導能なし Tazobactam: 主にClass Aを阻害 Morganella morganii 由来 Citrobacter freundii 由来 AmpC β-lactamaseも阻害する AmpC 誘導能なし 2-mercaptopropionic acid:classbβ-lactamaseを阻害する O CHCH 2 OH O O S CH 3 CH O O 3 COOH S CH 2 O COOH CH 3 Clavulanic acid Sulbactam CH 3 CHCOOH SH 2-mercaptopropionic acid O Tazobactam COOH

S E O OH Ser S S:β-lactam or inhibitor E:PBP or β-lactamase Interaction of β-lactam HOH O O Ser H S O O - OH Ser H PBPとβ-lactam or β-lactamaseとβ-lactamase inhibitor E + S ES E-Acyl E + P H 2 O β-lactamaseとβ-lactam E + S ES E-Acyl E + P S

Mitsuhashi 1981 CSase PCaseⅠ PCase Ⅱ PCase Ⅲ PCase Ⅳ PCase Ⅴ PCase (K. pneumoniae) CXase Ⅰ CXase Ⅱ - - β-lactamase の分類 Richmond 1973 Ⅰa, Ⅰb, Ⅰd Ⅲ Ⅴa Ⅴb Ⅱ, Ⅴ - Ⅳ Ⅳ Ⅰc - - - Bush et al. 1995 1 2b 2d 2d 2c 2a 2a 2be 2e 3 2f 2br Ambler 1980 C A D D A A A A A B A A β-lactamase AmpC, FOX-1, MOX-1 TEM-1, TEM-2, SHV-1 PSE-2(OXA-10) OXA-1 PSE-1, 3, 4 Staphylococcal enzyme LE-1 K-1 P. vulgaris L-1, IMP-1, CcrA MC-A, Sme-1 TEM-30~36, TRC-1

分子構造に基づいた β-lactamaseの分類 (Amblerの分類) Hydrolyze β-lactam bond o structural homology o sequence homology Class A Serine β-lactamase Class C 4 β-lactamase ClassB Metallo-β-lactamase Class D unnamed Class B3 (Class E) Class B1 Class B2 (Bellingham Research Institute website)

腸内細菌科の菌種における β-lactamase 染色体遺伝子 AmpC β-lactamase (Class Cβ-lactamase) penicillin, cephalosporin, cephamycin, monobactamを分解する抗菌薬の種類により安定性は異なる SHV-1, LE-1 (Class Aβ-lactamase) Klebsiella pneumoniaeが保有 主にpenicillinを分解する 産生量が多い場合は第一世代 cephalosporinも分解する 広域スペクトルClass Aβ-lactamase Citrobacter koseri, Klebsiella oxytoca, Proteus vulgarisなどが保有 penicillin, cephalosporin, monobactamを分解する外来遺伝子 TEM-1, TEM-2, SHV-1など主にpenicillinを分解する ESBL( 基質特異性拡張型 β-lactamase) penicillin, cephalosporin, monobactamを分解する Class Bβ-lactamase(Metallo-β-lactamase) monobactam 以外を分解 Class Cβ-lactamase( 由来は異菌種の染色体上のAmpC)

AmpCβ-lactamase の dendrogram FOX-1 FOX-2 FOX-3 a AmpC P. aeruginosa AmpC M. morganii DHA-1 DHA-2 AmpC E. coli MOX-1 MOX-2 CMY-1 CMY-8~11 AmpC S. marcescens a ACC-1 a a a MIR-1 ACT-1 AmpC E. cloacae a AmpC C. freundii CMY-2~-7 CMY-12 LAT-1 LAT-3 CFE-1 akano et al. AAC 2004; 48:1151-8 (neighbor joining method)

誘導型 AmpCβ-lactamase BL BL BL PBP PBP AmpG Cell wall PBP AmpD AmpD Murain monomer AmpC ampr 転写抑制 ampc AmpR 転写促進 ampr ampc AmpR

AmpR: DA binding protein ampc の promotor 領域に結合し ampc の転写を抑制する AmpD: -acetyl muramyl-l-alanine amidase murain monomer を分解し peptideglycan の合成に再利用する 変異すると β-lactamase 増加 AmpG: 膜貫通タンパク質 murain monomer を細胞質内へ取り込む 欠損株では β-lactamase が産生されない AmpE: 膜タンパク質 β-lactam とは結合しない AmpD の合成に関与している? AmpC: β-lactamase Amp タンパク質の役割

Plasmid 性 Class Bβ-lactamase (metallo-β-lactamase) IMP type IMP-1 type: IMP-1, -3, -6 IMP-2 type: IMP-2, -8, -11, -16 IMP-5 type: IMP-5, -7 IMP-4, IMP-10 VIM type VIM-1 type: VIM-1, -4, -5 VIM-2 type: VIM-2, -3, -6 SPM type

ESBL の出現 (TEM, SHV, OXA type) ペニシリン 第三世代セファロスポリン Class A Class A Penicillinase から ESBL への mutation セファマイシンカルバペネム ESBL ESBL ESBL OXA 型 (ClassD)ESBL の出現 CTX-M type(classa) の増加 カルバペネムやセファマイシンを分解するものも存在するが 稀である

ESBL へのアミノ酸変異 SHV-1 SHV-2 SHV-5 SHV-12 SHV-32 35 L L L Q L 238 G S S S G 240 E E K K E Amino acid at position 126 A A A A V 156 G G G G D TEM-1 TEM-2 TEM-3 TEM-26 TEM-52 39 Q K K Q Q 104 E E K K K 164 R R R S R 182 M M M M T 238 G G S G S 6 SHV-59 OXA-35 TEM-138

CTX-M type β-lactamase の系統樹 CTX-M-3-1, 10, 11, 12, 15, 22, 23, 28, 29, 30, 33 KLUC1 Kluyvera cryocrescens CTX-M-8-25, 26 Toho-2 KLUG Kluyvera georgiana CTX-M-9-13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 24, 27 CTX-M-2-4, 5, 6, 7, 20, 31, Toho-1 KLUA1, A2, A5 Kluyvera ascorbata Chromosomal Plasmid mediated OXY1-3, 4 Klebsiella oxytoca CTX-M-52 ペニシリン セファロスポリン モノバクタムを分解可能

ペニシリンおよび第一世代セファロスポリンのみならず 第二世代以降のセファロスポリンおよびモノバクタムを分解可能な外来性の Class A および Class D β-lactamase のことを ESBL と呼んでいる TEM, SHV, OXA, CTX-M, etc ESBL 現在の定義 一般の細菌検査室では遺伝子型までルチンで見ることは出来ない為 Phenotype ( 感受性によるスクリーニングと CVA による確認試験 ) で ESBL かどうかを決定できるこの定義は合理的である つまり CLA の添加により セファロスポリンの抗菌力が明らかに回復すれば ESBL 産生株と決定できる Klebsiella oxytoca, Proteus vulgaris, Bacteroides fragilis, Stenotrophomonas maltophilia などが染色体上に有する広域スペクトル Class A β-lactamase は ESBL とは区別される

ESBL とは区別される広域スペクトル Class A β-lactamase 産生株 A B A B A B C E D F C D C D K. oxytoca Rko2250 B. fragilis Rbf847 P. vulgaris Rpv1901 薬剤感受性パターンとCVAの併用試験のみからはESBL 産生株かどうかは断定できない PCRなどの遺伝子検査が必要である A: CTX/CVA B: CTX C: CAZ/CVA D: CAZ E: CPDX/CVA F: CPDX

基質特異性拡張型 β-lactamase (ESBL) の種類 ESBL の type TEM type SHV type OXA type CTX-M type CTX-M-2 type CTX-M-3 type UOE-2 type CTX-M-8 type その他 TEM-3,4,5,6 ~ 135 ( ただしすべてがESBLではない TEM-30 ~ 45など ) SHV-11, 12, SHV-2 ~ 46 OXA-2~31 CTX-M-1 ~ 37およびその他 CTX-M-2, 4, 5, 6, 7, 20, 31 およびToho-1 CTEX-M-1,3,10,11,12,22,23,28,29,30,33および UOE-1 (CTX-M-15と同一) CTX-M-9,13,16,17,19,21,24,27およびUOE-2 (CTX-M-14, 18と同一 ), Toho-2 CTX-M-8,25,26 プラスミド性の基質域の広いClassA β-lactamase IMI-1, MC-A, Sme-1, GES type, KPC type

CTX-M type の薬剤感受性パターン 10 >256 MIC (μg/ml) 8 128 32 6 8 4 2 2 0.5 0 UOE-1 UOE-2 CTX-M-2 CTX-M-3 : CPDX, : CTX, : CAZ, : AZTM, : CPR, : CMZ CAZ<CTX

TEM, SHV type の薬剤感受性パターン 10 >256 MIC (μg/ml) 8 128 32 6 8 4 2 2 0.5 0 TEM-6 TEM-U3 TEM-26 SHV-12 : CPDX, : CTX, : CAZ, : AZTM, : CPR, : CMZ CAZ>CTX

ESBL 産生 E. coli の北部九州 山口地区 500 400 における年次推移 o. of isolates 300 200 100 0 1997 1999 2001 2003 2005 1998 2001 2002 2004 :UOE-2 (CTX-M-14), :CTX-M-2, :CTX-M-3, :CTX-M-12 :UOE-1 (CTX-M-15), :TEM, :SHV, :not identified

Isolation frequency (%) 40 30 20 10 0 臨床材料からの腸内細菌科の分離頻度 (n=1745) EC EL KO ET CK KZ CIT others KP CF SM EA PM MM PRO 便 962, 尿 308, 呼吸器 245, 膿 114, 血液 34 生殖器 29, 胆汁 15, 腹水 15, 耳漏 9, その他 14 EC:E. coli KP:K. pneumoniae EL:E. cloacae CF:C. freundii KO:K. oxytoca SM:S. marcescens ET:Enterobacter spp. EA:E. aerogenes CK:C. koseri PM:P. mirabilis KZ:K. ozaenae MM:M. morganii CIT:Citrobacter spp. PRO:Providencia spp. others 産業医科大学病院 2005 年

Isolation frequency (%) 検査材料別腸内細菌科の分離頻度 (n=1745) 30 20 10 0 E. coli, K. pneumoniae 以外 EL KO ET CK KZ CIT CF SM EA PM MM others EL:E. cloacae CF:C. freundii KO:K. oxytoca SM:S. marcescens ET:Enterobacter spp. EA:E. aerogenes CK:C. koseri PM:P. mirabilis KZ:K. ozaenae MM:M. morganii CIT:Citrobacter spp. : 呼吸器, : 尿, : 便, : 膿

ESBL 産生株の分離状況日本海 ひびき臨床微生物研究会共同研究会員数 23 施設 ( 5 検査センターを含む ) 54 名 北部九州 山口地区の細菌検査室との共同研究 山口県 福岡 北九州 筑豊 周防灘 大分県 佐賀県 筑後 熊本県

o. of isolates 250 200 150 100 50 0 ESBL 産生 P. mirabilis の年次別分離株数 2000 2001 2002 2003 2004 2005 (year) :CTX-M-2, :CTX-M-3 :UOE-2 140 120 100 80 60 40 20 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 (year) : 北九州, : 山口, : その他 参加施設の増減があるため 単純には比較できないが ESBL 産生 P. mirabilisは増加している

患者数 ( 人 ) 60 50 40 30 20 ESBL 産生株の施設別分離人数 2004 年 (1-5 月 ) に 4 名以上分離された施設 :K. pneumoniae :P. mirabilis :C. koseri :E. coli 10 0 KW S IT K 8657 O A H SM I 2017 8029 K 8417 8049 YS 7124 MT 240 60 施設から 372 人 ( 菌種が異なればカウントした ) 4 人以上分離されたのは 22 施設

北部九州 山口地区における ESBL 産生株の分離数 o. of isolates 180 420 160 140 120 100 80 60 40 20 0 EC KP EL CF KO SM EA CK PM :ESBL 産生株, :IMP-1 産生株ひびき臨床微生物研究会共同研究 2005 EC:E. coli KP:K. pneumoniae EL:E. cloacae CF:C. freundii KO:K. oxytoca SM:S. marcescens EA:E. aerogenes CK:C. koseri PM:P. mirabilis

Double disc test and E-test UOE-2 producer SHV-12 producer 21 cefpirome A C A C Amoxicillin /clavulanate B D B D Cefepime Cefepime +clavulanate A: Cefotaxime, B: Cefotaxime + clavulanate C: Ceftazidime, D: Ceftazidime + clavulanate 第 4 世代セファロスポリンである CFPM と CVA を用いた E-test が市販されている 誘導型 Class Cβ-lactamase 産生株に対しては 有用と考えられる

ドライプレート 栄研 DPD1(DPD, 長瀬産業 ) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ABPC FMOX S/C A 32 16 8 2 1 0.5 32 16 8 32/32 16/16 I S PIPC AZT MIO B 64 32 16 8 4 2 16 8 4 8 4 >R S S S S S S I S S I S CTX FOM MEPM C 32 16 8 4 2 1 128 64 32 16 8 I I S S S S I S S R I CTX/CVA AMK GM D 4/4 2/4 1/4 0.5/4 0.25/4 0.12/4 32 16 8 8 4 I S S >R I S CAZ LVFX CPFX E 32 16 8 4 2 1 8 4 2 4 2 R I S S S S R I S R I CAZ/CVA CAZ CAZ F 4/4 2/4 1/4 0.5/4 0.25/4 0.12/4 64 16 8 4 2 R CPDX IPM IPM G 32 16 8 4 2 1 32 8 4 2 1 R CPDX/CVA IPM H 4/4 2/4 1/4 0.5/4 0.25/4 0.12/4 16 8 4 2 1 R I S S S

Microdilution method CTX-M-15 producer μg/ml alone 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 ceftazidime 64 with CVA <0.12 cefotaxime >128 22 with CVA <0.12 0.12 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 μg/ml with CVA 4μg/ml 第 4 世代セファロスポリンとCVAの併用パネルを考慮すべき CTXは不要?

ESBL 確認試験 P/C アーゼテスト ( 日水製薬 ) ESBL 産生 E. coli PCase Control CSase - + - Rec 3557 ESBL 産生 E. cloacae PCase Control CSase - + + Rel 4350 ESBL 産生株はセフェム系薬に耐性を示すが CVA が添加されているセファロスポリナーゼの部分は変化させない Class C 同時産生株では 判定できない

Cica βtestⅠ/mbl/cva 24 HMRZ-86 Smear bacteria directly HMRZ-86 with 2-mercaptopropinic acid negative Metallo ESBL suspected HMRZ-86 with clavulanate ESBL Metallo suspected 誘導型 Class Cβ-lactamase の有無に影響されない 一部の Class Cβ-lactamase では擬陽性を示す

各種 ESBL 産生株に対する CVA 配合ディスクの効果 CTX+CVA CPR CTX CAZ+CVA CAZ CPDX CPDX +CVA

CPR CTX CTX+CVA CAZ CAZ+CVA CPDX CPDX+CVA

CPR CTX CTX+CVA CAZ CAZ+CVA CPDX CPDX+CVA

CPR CPDX CPDX+CVA CAZ CAZ+CVA CTX CTX+CVA

SEC23