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1 The world leader in serving science HCA コンプリートソリューション Cellomics ArrayScan VTI ラボプロダクツ事業本部セルラーイメージング営業部南里晃平

2 ハイコンテントアナリシス 3 つのテクノロジーを進化させた技術 Flexible, wide reagent selection Individual cell visualization Spatial resolution and localization 蛍光顕微鏡 High capacity quantitation Automatable, uses microplates Simple, Easy to use プレートリーダー フローサイトメーター Measures each cell in population Multi-parameter output per cell Visualization and analysis tools 個々の細胞の分析 ( 局在や形態変化など ) スループットが高く簡便 サブポピュレーション解析 個々の細胞からマルチデータの取得 解析 2

3 ハイコンテントアナリシス 免疫学 神経科学 がん研究 幹細胞 トキシコロジー RNAi シグナル伝達 ES 細胞 ips 細胞 コロニー解析 神経突起伸張 シナプト形成 線虫 ゼブラフィッシュ 酵母 細胞形態変化 細胞浸潤 細胞運動 細胞周期 血管新生 GFP アッセイ 転写因子の活性化 受容体の活性化 GPCR アポトーシス 遺伝毒性 細胞毒性 sirna FRET 多くのリファレンス ( 文献リスト参照 ) 煩雑なマニュアルによる実験手法の自動化 マルチカラー解析により複数の細胞内ターゲットの同時解析 新たなターゲットとアッセイフォーマットを利用したスクリーニング ターゲットバリデーションを高速化 RNAi 実験における複雑な細胞情報の解析 in vitro スクリーニングによる毒性予測 システム生物学における細胞機能の解明 3

4 ハイコンテントアナリシス How Does It Work? 1. マイクロプレートでの複数波長による細胞イメージ取得 2. 画像のデジタル処理によって細胞内 細胞膜上 細胞周辺の 特異的ターゲットを定義し測定 3. 画像をアルゴリズムによって処理することで生物学的に意義の ある数字でデータを表示 4. データマネージメントと可視化 4

5 HCA コンプリートソリューション 細胞イメージアナライザー Cellomics ArrayScan VTI イメージ解析ソフトウェア Cellomics BioApplication ValidObjectCount SelectedObjectCount %SelectedObjectCount MeanNucArea MeanNucInten(NucCh) MeanNuc-CytoIntenDiff(TargetCh) StdDevNucArea 85.7 StdDevNucInten(NucCh) 68.8 StdDevNuc-CytoIntenDiff StdErrNucArea 6.6 StdErrNucInten(NucCh) 5.3 StdErrNuc-CytoIntenDiff 16.9 CVNucArea 0.5 CVNucInten(NucCh) 0.2 CVNuc-CytoIntenDiff 0.8 AvgCellDensity/Field MeanNucInten(TargetCh) MeanCytoRingInten(TargetCh) StdDevNucInten(TargetCh) StdDevCytoInten(TargetCh) 54.3 #ValidFields 1.0 インフォマティクス 蛍光試薬キット & GFP 細胞株 ユーザートレーニング HCS101 トレーニングクラス vhcs Discovery ToolBox HCi Appliance Cellomics Store HCS Reagent Kit Redistribution Assay 5

6 Cellomics ArrayScan VTI 特長 基礎研究 アッセイデべラップメントからハイスループットスクリーニングに対応 リアルタイムアナリシスによる全自動高速イメージ取得 & 解析 顕微鏡スライド ウェルプレート対応 付着系細胞だけでなく浮遊系細胞 線虫 ゼブラフィッシュに対応 6

7 Cellomics iq リアルタイムアナリシスによるゲーティング機能 1ウェルあたりのイメージ取得視野数の設定が不要です リアルタイム解析により自動的にアッセイに必要とされる細胞数を確保するまでイメージ取得 (ex. ターゲットが一定以上発現している細胞 1000 個 /1ウェルに達するまで 同じウェル内でイメージを取得 ) ハイスループットを実現 シーケンシャル ワークフロー パラレル ワークフロー Cellomics IQ 7

8 ArrayScan VTI 光学系 カールツァイス倒立顕微鏡 浜松ホトニクス 12bitグレイスケールCCDカメラ 1344 x 1024 ピクセル 120W 白色光源 メタルハライドランプ( 約 1500 時間 ) 励起波長範囲:350nm-700nm Illumination Liquid Light Filter Guide Objective Lens Dichroic Mirror Shutter Hg/ Halide Arc Lamp Cooled CCD Camera Emission Filter 8

9 ArrayScan VTI 対物レンズ 対物レンズ 5X NA X NA0.3 10X NA X NA0.4 40X NA0.75 5X 10X 20X 40X Colony Analysis Translocation Micronucleus Cytoskeleton 9

10 ArrayScan VTI フィルターセット カテゴリー Broad Blues Greens Orange Reds Deep Reds Far Reds エキサイテーション / エミッション (nm) 365(50)/535(45) 475(40)/535(45) 535(35)/590(35) 575(25)/640(30) 630(50)/695(55) 例 Hoechst, DAPI, coumarins FITC, GFP, fluorescein, Alexa Flour 488 TRITC, rhodamine, Cy3, Alexa Fluor 546 Texas Red, Alexa Flour 594 Cy5, DRAQ5, Alexa Fluor

11 光学セクショニング画像通常の蛍光イメージ vs ApoTome イメージ 通常の蛍光イメージ Apotome イメージ ApoTome 白色光源での光学セクショニング 通常の蛍光フィルタを使用 Membrane stained Jurkat Cells A B 必要に応じて簡単に通常イメージと Apotome イメージを切り替えられます Microtubule staining 11

12 明視野モジュール 透過光イメージの取得 解析 12

13 Emission Filter Wheel FRET Fluoresence resonance energy transfer, for protein-protein interactions. QDots or Quantum dots - Tiny semicounductor crystals that can be designed to excite and emit at very specific wavelengths, for structural analysis. Live Cell Applications Used with Optical density filters to attenuate light to avoid photoxicity. Anywhere where more spectral discrimination is needed. 13

14 Cellomics BioApplication 画像解析アルゴリズム Developer Tools Target Activation Compertmental Analysis Morphology Explorer Spot Detector Colocalization Toxicology Multiparameter Cytotoxicity Cell Health Profiling Micronucleus Comet Assay ZebraTox Neurobiology Neuronal Profiling Cancer/Oncology Cell Cycle Cell Spreading Cell Motility Tube Formation Signaling Pathways Cytoplasm to Nucleus Translocation Molecular Translocation Cyto-Cell Mem Translocation Receptor Trafficking GPCR Signaling 14

15 アプリケーション例 Intracellular Intensity Changes 細胞生死判定 MDR 評価 StemCell 分化測定 分裂期細胞の割合測定 EGFP 導入率測定 ターゲットタンパクのリン酸化測定 細胞内シグナリング解析 Spot Analysis GPCR リサイクリング リソソーム染色パターン解析 ミトコンドリア染色パターン解析 phosphoh2ax 接着斑解析 脂質蓄積 ゴルジ体やエンドソームの崩壊評価 コロニー内の細胞数測定 Colocalization 内在性 GFP-GPCR とFluorescent Transferrin の共局在 ミトコンドリア内のcytochrome-c 局在 microtubule と接着斑タンパクの共局在 細胞膜上の受容体局在 受容体へのリガンドバインディング Intracellular Translocation NFkB PKCα STAT ERK NFAT p38 HIF-1α PhosphoCREB FOXO3a PKA Beta Catenin PhosphoAKT Smad3,4 などトランスロケーション 受容体 / リガンドの細胞膜から細胞質へのインターナリゼーション Internalization & Receptor Activation GPCR インターナリゼーション EGFP アッセイ Gs,Gq による活性化 細胞内カルシウム測定 直接ラベルしたリガンドのインターナリゼーション Cell Cycle Cell Proliferation CellCycle BrdU Ki67 Cyclin B1 PhosphoRb PLK1 p21/clip1 PhosphoHistoneH3 15

16 アプリケーション例 Cell Morphology and Motility 細胞形態変化 血管新生 筋管細胞 細胞浸潤 細胞遊走 コロニー解析 細胞骨格 ( アクチン, チューブリン ) の再形成 Neurite Outgrowth 神経伝達物質発現有無による突起伸張のポピュレーション解析 CNS 神経突起内におけるPre-synaptic vesicles 解析 ミエリンやCSPG による神経突起伸張阻害と その阻害効果を阻害する化合物のスクリーニング ベータアミロイドによる神経突起伸張阻害 Cell Health & Toxicity 細胞毒性 神経毒性 肝毒性 (Phospholipidosis, Cholestasis, Glutathione depletion, etc) アポトーシス (Caspase 9, Caspase 3, PARP, Cytochrome c release, Annexin V, TUNEL) Autophagy(Ubiquitin, LC3B) 遺伝毒性 ( 小核 コメットアッセイ ) DNA 損傷 (phospho H2AX, Ku 70/80 p53, MDM2, p21, ATM and Chk2) Heat Shock Proteins(Hsp) によるCell ストレス FRET Assay Cameleon Ca2+ biosensor を用いたカルシウム測定 GeneBlazer Assay タンパク質間相互作用解析 sirna Screening 細胞骨格に及ぼす遺伝子のスクリーニング 細胞毒性を示す遺伝子のスクリーニング 細胞運動を抑制する遺伝子のスクリーニング 特定シグナリングに影響を及ぼす遺伝子のスクリーニング Stem Cell Biology 幹細胞の分化, 成長に影響を及ぼす因子の解析 筋芽細胞への幹細胞分化解析 神経細胞への幹細胞分化解析 コロニー解析 多能性幹細胞の解析 16

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