35 食用動物における動物用抗菌薬の使用状況の調査結果について実験材料及び方法 1 被検物質は製剤 1g 中イソプロチオランとして 250mg 含有する顆粒剤であるフジックス ( 日本農薬 ( 株 ) 製製造番号 : B6512) を用いた 2 試験方法 (1) 供試動物ホルスタイン種の牛 (

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あいりかむら
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1 34 技術資料牛にイソプロチオラン製剤を飼料添加投与後の残留確認試験小池 ( 浜本 ) 好子臼井優峯戸松勝秀下山晃園部研一飯塚智美 ( 平成 21年 1 月 30日受付平成 21年 4 月 7 日受理 ) TECHNICAL REPORT A Residue Determination Test of Isoprothiolane-added Cattle Feed Additive Koko Koike-Hamamoto, Masaru Usui, Katsuhide Minetomatsu, Akira Shimoyama, Kenichi Sonobe, Tomomi Iizuka National Veterinary Assay Laboratory, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries Tokura, Kokubunji, Tokyo , Japan ( Received: 30th January 2009; Accepted: 18th June 2009) A feed additive which contained isoprothiolane as an active ingredient was added to a cattle feed at the highest approved level and was continuously administered to three cows for four weeks. After a 14 day withdrawal period, the cows were sacrificed and quantitative analyses of isoprothiolane concentration in fat, the liver and small intestines were carried out by GC-MS/MS. イソプロチオランを有効成分とする飼料添加剤を承認された用法及び用量の最高用量となるように飼料に添加し 3 頭の牛に4 週間連続投与したこれらの牛を使用禁止期間 ( 14 日間 ) 経過後に屠殺採材し脂肪肝臓及び小腸の中のイソプロチオラン濃度を質量分析装置付ガスクロマトグラフィー ( GC/MS/MS) を用いて測定した緒言この試験の目的はイソプロチオランを有効成分とする飼料添加剤の使用基準の妥当性を確認することである暫定残留基準値 ( 暫定 MRL) が設定されている成分であるが当該成分の使用基準作成時にはイソプロチオランの牛への強制経口投与での残留試験の結果しかなかったため本試験を実施した本試験では 3 頭の牛にイソプロチオラ 1 ( 財 ) 日本冷凍食品検査協会 Japan Frozen Foods Inspection Corporation ンを有効成分とする飼料添加剤を使用基準の用法及び用量の最高用量となるように飼料に添加し承認されている最長投与期間である4 週間の連続投与を行った投与終了から使用禁止期間 ( 14 日間 ) 経過後にこれらの牛を屠殺採材し臓器組織中のイソプロチオラン濃度を質量分析装置付ガスクロマトグラフィー ( GC/MS/MS) を用いて測定した臓器組織としては牛への強制経口投与による残留試験のデータからイソプロチオランが最も多く残留することが想定される肝臓及び脂肪の他その他の内臓として小腸を選択した

2 35 食用動物における動物用抗菌薬の使用状況の調査結果について実験材料及び方法 1 被検物質は製剤 1g 中イソプロチオランとして 250mg 含有する顆粒剤であるフジックス ( 日本農薬 ( 株 ) 製製造番号 : B6512) を用いた 2 試験方法 (1) 供試動物ホルスタイン種の牛 ( 雄 2 頭雌 1 頭導入時体重 73 ~ 120 k g) を室温で飼育した ( 20 日間 ) 馴化期間中は濃厚飼料及びヘイキューブを2 回 / 日給餌し自由飲水とした休薬期間中においては馴化期間と同様に飼育したコントロール ( 無投薬の臓器組織 ) は動物医薬品検査所において投与群と同様に飼育した牛から別途採材した (2) 投薬量及び投薬方法薬剤はイソプロチオランとして 50mg/kgBW となるように濃厚飼料に混合し朝 9 時に投薬した牛が薬剤を添加した濃厚飼料を全て食べ終えた後ヘイキューブを与えた水は自由飲水とした投薬時は 1 週間毎に体重を測定し製剤の投与量を補正したこのような飼料添加による投薬を 4 週間連続で行った (3) 分析用試料の採材休薬 14 日目に屠殺し肝臓脂肪及び小腸 ( 牛海綿状脳症の危険部位を除く食用部分 ) を採材した採材した臓器組織は 5g ずつにわけ分析まで-80 で凍結保存した 3 試料中のイソプロチオランの残留分析 (1) 牛の各臓器組織中のイソプロチオラン濃度の測定は平成 17 年 1 月 24 日付け食安発第号厚生労働省医薬食品局食品安全部長通知の一斉試験法 ( 畜水産物 ) により行った具体的な方法をスキーム1に示したこの分析方法で使用したゲル浸透クロマトグラフィー ( GPC) 固相抽出 ( PSA) 及び GC/MS/MS の条件等は下記に示した 1 GPC 条件機種名 : GL-Science G-Prep-8150( GL サイエンス製 ) GPC カラム : CLNpak EV-2000, 20mm i.d. 300mm( shodex 製 ) に CLNpak EV-G, 20mm i.d. 100mm( shodex 製 ) を接続した物移動相 : アセトン : シクロヘキサン ( 1:4) 流速 :5mL/min カラム温度 : 40 検出波長 :UV254nm 注入量 :5mL GPC の分取範囲は min とした 2 PSA カラム Bond elute PSA 500mg( Varian 製 ) 3 GC/MS/MS 条件装置 : タンデム型 GC/MS/MS( Varian 製 ) ガスクロマトグラフ ( Cp-3800 型 ) 質量分析計 ( 300MS) GC 条件カラム : VF-5MS( 30m 0.25mm 膜厚 0.25 μ m Varian 製 ) カラム温度 : 注入後 1 分間 50 に保ちその後 125 まで 25 /min で昇温し次いで 300 まで 10 /min で昇温し 300 を 10 分間保持するキャリアガス : 高純度ヘリウムキャリアガス流量 :1.2mL/min 注入口温度 : 250 注入方式 : スプリットレス ( 40psi,1mL) 注入量 : 1 μ L MS/MS 条件イオン化モード :EI イオン化エネルギー :( 70eV) トランスファーライン温度 : 300 イオン源温度 : 250 コリジョンエネルギー :25V コリジョンガス : アルゴンコリジョンガス圧 :2m torr 定量イオン : プロダクトイオン 85.0m/ z ( プレカーサーイオン : 162.0m/z) 動薬検年報第 45 号 (2008)

3 36 小池好子臼井優峯戸松勝秀下山晃園部研一飯塚智美

4 37 食用動物における動物用抗菌薬の使用状況の調査結果について (2) 検量線イソプロチオラン標準品 ( 和光純薬工業製残留農薬試験用純度 : 99.0 %) 20.0mg を量りアセトンで溶解し標準原液 ( 200mg/L) を作成したこの標準原液を 5 ~ 100 n g/ml の濃度となるようにアセトン : ヘキサン (1:1) で希釈した標準溶液を用いてイソプロチオランのピーク面積を測定し検量線を求めた結果イソプロチオランの検量線は良好な直線性を示した ( r=0.995 以上図 1) 濃度に希釈し試料 5 g にこの希釈液 1 ml を添加して添加回収率を求めた (3) 添加回収率及び検出限界牛の各コントロールにイソプロチオランの暫定 MRL 相当の 0.02ppm となるように ( 1) の標準原液 ( 200mg/L) をアセトン : ヘキサン (1:1) で 0.1mg/L の Table1 Recovery of Isoprotiolane from bovine tissues Spike level Recovery(%) CV (0.02ppm) Mean (%) Liver Fat Intestines イソプロチオラン標準溶液コントロール添加回収及び検体の各クロマトグラムを図 2~4に示すイソプロチオランの保持時間は約 16 分であった添加回収率は全ての臓器組織で平均 90% 以上であり変動係数は 10% 以下であったこれらの結果は残留に関する試験ガイドライン ( 動物用医薬品関係事務の取扱について平成 12 年 3 月 31 日農林水産省畜産局衛生課薬事室長通知 ) を満足していたイソプロチオランの検出限界 (S/N=3) 及び定量限界 (S/N= 10) は肝臓及び小腸でそれぞれ 0.85ng/ g 及び 2.8ng/ g 脂肪でそれぞれ 1.7ng/g 及び 5.7ng/ gであった肝臓及び小腸の定量限界は暫定 MRL( 20ng/g) の1/7 以下であり脂肪の定量限界は1/3 以下であったことからこの残留分析法の感度は十分であると考えられた結果 1 供試動物 (1) 試験期間中投薬期間以外の休日を除く毎日一般状態を観察したその結果異常は観察されなかった (2) 導入時投薬時投薬後及び屠殺時に体重を測定したその結果を表 1に示した牛の平均の体重増加は投薬期間中は 0.6kg/ 日休薬期間中は 1.2 k g/ 日であった動薬検年報第 45 号 (2008)

5 38 小池好子臼井優峯戸松勝秀下山晃園部研一飯塚智美 Table2 Body weights of the three cattle Body weight at each time point(kg) Cattle No. Induction Pre-administration Post-administration Pre-sacrifice Mean SD

6 39 食用動物における動物用抗菌薬の使用状況の調査結果について動薬検年報第 45 号 (2008)

7 40 小池好子臼井優峯戸松勝秀下山晃園部研一飯塚智美 2 試料中のイソプロチオランの残留分析 (1) 試料分析結果牛の各臓器組織におけるイソプロチオラン濃度の分析結果を表 3 に示したイソプロチオランは肝臓で5~9 ppb 脂肪で検出限界付近の量が検出されたが小腸では検出限界以下であり全て暫定 MRL 以下であった Table3 Residue levels of Isoprotiolene in each tissue * ND: Not detected (A) Liver (B) Fat Cattle No. Residue level Cattle No. Residue level (ppm) (ppm) (0.002) (0.002) (0.002) Mean±SD 0.006±0.003 Mean±SD (0.002) (C) Intestines Cattle No. Residue level (ppm) 1 ND 2 ND 3 ND Mean±SD ND まとめ牛にイソプロチオランを有効成分とする飼料添加剤を使用基準の用法及び用量の最高用量 ( 50mg/kg/ 日 ) で4 週間投与し使用禁止期間 ( 14 日間 ) 経過後に屠殺採材し肝臓脂肪及び小腸のイソプロチオランを GC/MS/MS 法で定量したその結果すべての臓器組織でイソプロチオランは暫定 MRL 以下であったこの結果よりイソプロチオランを有効成分とする飼料添加剤の使用基準の妥当性が確認された引用文献 1) 厚生労働省 : 食品に残留する農薬飼料添加物又は動物用医薬品の成分である物質の試験法について ( 平成 17年 1 月 24日付け食安発第号厚生労働省医薬食品局食品安全部長通知 ) 別添

表 1. HPLC/MS/MS MRM パラメータ表 2. GC/MS/MS MRM パラメータ表 1 に HPLC/MS/MS 法による MRM パラメータを示します 1 化合物に対し定量用のトランジション確認用のトランジションとコーン電圧を設定しています表 2 には GC/MS/MS

表 1. HPLC/MS/MS MRM パラメータ表 2. GC/MS/MS MRM パラメータ表 1 に HPLC/MS/MS 法による MRM パラメータを示します 1 化合物に対し定量用のトランジション確認用のトランジションとコーン電圧を設定しています表 2 には GC/MS/MS ACQUITY UPLC TM /MS/MS と GC/MS/MS によるベビーフード中の残留農薬の分析 No. 720007 20001436J 概要 EU の Baby Food Directive 2003/13/EC 1) ではベビーフード中の使用が禁止されている残留農薬について明示していますその濃度が 0.003mg/kg を超えているのかあるいは 0.004-0.008mg/kg