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1 核磁気共鳴 (NMR) を用いた蛋白質の立体構造解析 首都大学東京大学院理工学研究科伊藤隆

2 NMRを用いた蛋白質の高次構造解析. 測定 3. NMRシグナルの帰属 主鎖 / 側鎖 2. データ処理 5. 高次構造計算 4. 距離情報の取得

3 核スピンエネルギー順位のゼーマン分裂 ΔE = hγb 0 /2π B 0 : 静磁場強度 h: プランク定数 γ: 磁気回転比 ΔE = hν ν= γb 0 /2π 3 核の γ は の /4 5 N 核の γ は の /0 I=/2 I= B 0 = 0 B 0 0 m = +/2 m = /2 m = + m = 0 m =

4 パルス フーリエ NMR,FID ラジオ波パルス 待ち時間 FT

5 0. 試料調製. 安定同位体標識. どのくらいの量の蛋白質が必要か? 20kDa の蛋白質 mm の溶液として必要な蛋白質量 容量 ~500μL ~0mg 容量 ~250μL ~5mg 現在では,0.5mM 以下の濃度でも充分高次構造解析が可能!

6 0. 試料調製. 安定同位体標識. ~0.5-mM 程度の濃度が必要. 一般に X 線結晶解析に必要な量よりも多く必要である. 効率の良い蛋白質発現系を構築する必要がある. 異核種多次元 NMR のために, 蛋白質を 3, 5 N,( 2 ) で標識する必要がある. 最小培地で十分な発現が必要. 無細胞蛋白質発現システム (?). 蛋白質の性質 ( 大きさ, 溶解度等 ) に即した標識.

7 NMR 装置

8 .NMR 測定. 蛋白質の NMR で用いるパラメータ. 化学シフト. スピン - スピン カップリング. 核オーバーハウザー効果 (NOE). 残余双極子カップリング. etc.

9 化学シフト Ubiquitin N(W) N(bb) N(sc) B Ring A, B(S/T) 3 ランダムコイル状態での化学シフト

10 スピン - スピン カップリング α β α β α β A A α β A 2 A 系における結合電子の相対的スピン配向 カップリングなし A =A 2 カップリングあり A >A 2

11 核オーバーハウザー効果 (NOE) NOE r 6 f(τ c ) 約 5Å 程度以下の距離情報 2D NOESY GDP

12 NMR シグナルの帰属 帰属なし N 帰属あり

13 展開時間 2 次元 NMR 準備 混合 準備 : 励起混合 :NOE - 2D NOESY 準備 : - 5 N INEPT 混合 : 5 N- INEPT - 5 N SQ M 0 z M x M xcosω t + M ysinω t M 2 x M 2 xcosω 2 t 2 + M 2 ysinω 2 t 2

14 2 次元 NMR 観測軸 (dimension ) 間接観測軸 dimension 2

15 - 5 N SQ - 5 N SQ 測定は蛋白質の立体構造解析を目指したプロジェクトで最初に測定する異種核相関 NMR. 状態変化のモニターや種々のタイトレーション実験などで広く使われる.

16 - 5 N SQ y δ δ δ δ ψ rec. acq. 5 N t 5 N-PD z y ( y cos2πjδ+2 x N z sin2πjδ) 2 x N z 2 z N z 2 z N y 2 z N y cosωt 2 z N x sinωt 2 z N z cosωt 2 y N z cosωt ( 2 y N z cosωt cos2πjδ+ x cosωt sin2πjδ) x cosωt

17 - 5 N SQ 5 N (ppm) (ppm)

18 2 次元,3 次元,4 次元 NMR のパルス シークエンスの概念図 2D NMR Prep. t Mix. Obs. t 2 3D NMR Prep. t Mix. Mix. 2 t 2 Obs. t 3 4D NMR Prep. t Mix. Mix. 2 Mix. 3 t 2 t 3 Obs. t 4

19 .NMR 測定. 主鎖シグナルの帰属のための測定. () N(O)A/NA, (2) BA(O)N/BAN, (3) NO/N(A)O etc. 側鎖シグナルの帰属のための測定. () BA(O)N, (2) (O)N, (3) ()(O)N, (4) -OSY/-TOSY etc. NOE 解析のための測定. () 5 N-separated NOESY, (2) 3 -separated NOESY, (3) 4D 3 / 3 -separated NOESY etc. 二面角情報解析のための測定. () MQ-J, (2) NA, (3) NB/N(O)B etc.

20 NMR 測定に要する時間. 主鎖シグナルの帰属のための測定. BA(O)N/BAN ~ 4 日 (2 日 +2 日 ) NO/N(A)O ~ 4 日 ( 日 +3 日 ) 側鎖シグナルの帰属のための測定. BA(O)N ~ 2 日 (O)N ~ 2 日 ()(O)N ~ 3 日 -TOSY ~ 4 日 NOE 解析のための測定. 5 N-separated NOESY ~ 6 日 3 -separated NOESY ~ 6 日 計 ~32 日

21 どうして NMR 測定は時間がかかるのか? ( 例 )3D BA(O)N 観測軸 (dimension ) 積算 :32 回 回のスキャン :.5sec つの FID:.5x32=48sec dimension 2 80 points dimension 3 44 points 測定に必要な時間 =48 (sec) x 80 x 44 = 47 時間

22 ryoprobe システム概要 (Bruker 提供資料による ) コイル部およびプリアンプ部を冷却. 高温超伝導体使用. 従来型プローブと比較して S/N 比が約 3 倍向上. 従来と比較して /9 の測定時間で同じ S/N 比 ryoprobe TM クライオプリアンプ ryoplatfome TM 冷 e ガス 分光計

23 d 2. データ処理. 多次元フーリエ変換の概略. d2 d 方向 FT d2 方向 FT d3 d3 方向 FT スライス #32 スライス #64 スライス #96

24 2. データ処理. 3 次元 /4 次元スペクトルのデジタル分解能向上. () Linear Prediction, (2) Maximum Entropy Method etc. 最近, 迅速な多次元 NMR 測定を可能にするような新たな測定法 + データ処理法が多数報告されるようになった.

25 NMR resonance assignment NOE-based assignment strategies Side-chain O O NOE 3 J NOE 3 J ー N---N--- 3 J 3 NOE J NOE 3 J : OSY, TOSY, 3D 5 N-separated TOSY, NOE: NOESY, 3D 5 N-separated NOESY, Backbone

26 NMR resonance assignment Assignment based on J-correlations J N J Nα J Side-chain J J O O 35z J J 35z 30z J N 30z J J Nα J N ー N---N--- 5z z 55z 5z z 55z 5z J N J 2 J 7z J N J 2 Nα J 7z Nα 92z 40z 92z 40z Uniform 3 / 5 N-enrichment is required! Backbone

27 NMR resonance assignment Assignment based on J-correlations J N J Nα J Side-chain J J O O 35z J J 35z 30z J N NO 30z J J Nα J N ー N---N--- 5z z 55z 5z z 55z 5z J N J 2 J 7z J N J 2 Nα J 7z Nα 92z 40z 92z 40z Backbone

28 Backbone resonance assignment by multidimensional triple-resonance NMR N (i+) N (i) N (i+2) - 5 N SQ O R O R O R O // N α N α N α // i i i+ i+2 NO 5 N(i+2) 3 (i+) 5 N 5 N(i+) 3 3 (i) 3 (i ) 5 N(i) 5 N N N

29 Backbone resonance assignment by multidimensional triple-resonance NMR NA N(O)A R O R O R O N α N α N α i i i+ // // NA R O R O R O N α N α N α i i i+ // // N(O)A 3 α (i ) N i i+ i 3 α (i) 5 N i i+ i N N N

30 Backbone resonance assignment by multidimensional triple-resonance NMR NA N(O)A R O R O R O N α N α N α i i i+ // // R O R O R O N α N α N α i i i+ // // residue i residue i+ residue i+2 residue i+3 residue i+4 residue i+5 3 N

31 Backbone resonance assignment by multidimensional triple-resonance NMR intraresidue (i) + interresidue (i ) NA interresidue (i ) N(O)A R O R O R O N α N α N α i i i+ // // BAN N NAB N(A)O R O R O R O N α N α N α i i i+ // // BA(O)N (O)N N(O)AB NO

32 BA(O)N BAN B(i+) B(i+) B(i+3) NO N(A)O - 5 N SQ crosspeak i B(i-) O(i) O(i) O(i+2) O(i+2) crosspeak i+3 A(i) A(i) B(i+2) B(i+2) O(i+) O(i+) O(i+3) - 5 N SQ A(i-) A(i+2) A(i+2) A(i+) A(i+) O(i-) A(i+3)

33 3 α / 3 β chemical shifts Gly Ala ArgAsn Asp ys Gln Glu is Ser Leu Lys Met Thr Phe Trp Ile Tyr Pro Val

34 Side-chain NMR resonance assignment BA(O)N BA(O)N (O)N ()(O)N O J 35z J ---N- J N z 55z 5z J 2 J 7z Nα J N 40z 92z J Nα J 35z J 30z J - 30z - J 30z O J 35z J ---N- J N z 55z 5z J 2 J 7z Nα J N 40z 92z J Nα J 35z J 30z J - 30z - J 30z

35 Side-chain NMR resonance assignment -TOSY O J 35z J ---N- J N z 55z 5z J 2 J 7z Nα J N 40z 92z J Nα J 35z J 30z J - 30z - J 30z O J 35z J ---N- J N z 55z 5z J 2 J 7z Nα J N 40z 92z J Nα J 35z J 30z J - 30z - J 30z

36 B(i-) crosspeak i B(i-) A(i-) B(i-) - 5 N SQ B(i-)-B(i-) BA(O)N (O)N BA(O)N (O)N 3 chemical shift: A(i-) - 3 SQ A(i-) A(i-) B(i-) A(i-) 3 chemical shift: B(i-)

37 4. 構造情報 (NOE や J カップリング等 ) の解析. 5. 構造計算. NOE の解析とは? Arg2-D# Met-N Gly38-A Glu37-N Pro4-D Leu3-N

38 距離情報を集めることで, 立体構造 が決定できる理由 距離情報 : A 地点と B 地点の距離 =0km B 地点と 地点の距離 =8km 地点と A 地点の距離 =6km 鏡像 B A A B Distance Geometry

39 距離情報から立体構造を計算する 距離情報 : 8cm でぴったりのバネ A 地点と B 地点の距離 =0km B 地点と 地点の距離 =8km 地点と A 地点の距離 =6km 6cm でぴったりのバネ 0cm でぴったりのバネ 手を離す B A

40 NMR 情報をもとにした蛋白質の高次構造計算 Distance Geometry / Simulated Annealing 距離が満たされた NOE 情報 距離が満たされていない NOE 情報

41 4. 構造情報 (NOE や J カップリング等 ) の解析. 5. 構造計算. 現状では,NOE が構造決定のための最も重要な情報である. NOE の解析と構造計算のステップが最も時間がかかる. 理由.2D/3D/4D NOESY で得られる NOESY クロスピークのうち, ユニークに帰属できるのは一部である. 2. ユニークに帰属できない NOE(ambiguous NOEs) の帰属は, 構造計算を繰り返して iterative に行う必要がある. 3.NOE の解析を手動で効率よく行うには, 蛋白質 アミノ酸の立体化学的な知識と経験が必要. NMR を用いた蛋白質の構造解析の全プロセスの中で自動化が最も希求されるステップであるといえる.

42 4. 構造情報 (NOE や J カップリング等 ) の解析. 5. 構造計算. 昔使われていた, 一般的な, 構造計算の方法は以下の通り. NOE クロスピーク テーブル ユニークに帰属できるか? YES 距離情報 判断のためにフィードバック 高次構造計算 ( 初期 ) 構造

43 4. 構造情報 (NOE や J カップリング等 ) の解析. 5. 構造計算. 最近は... NOE クロスピーク テーブル ユニークに帰属できるか? YES NO 距離情報 あいまいな 距離情報 判断のためにフィードバック 高次構造計算 ( 初期 ) 構造

44 4. 構造情報 (NOE や J カップリング等 ) の解析. 5. 構造計算. 構造計算の自動化が陥りやすい危険.. 計算の最初の段階は構造情報の量が少ないので, 誤った初期構造を導く危険性がある. 比較的強度の大きいノイズに影響されやすい. 2. 初期構造を基に構造情報を絞り込むので, 初期構造における誤りに影響される危険性がある. 対策.ambiguous NOEs を正しく導入して, 十分な距離情報から初期構造を計算する. 2. 初期構造が 正しい のかを評価する. 3. ノイズを効率よく除外する工夫をする.

45 あいまいな 距離制限から 蛋白質の高次構造を計算する. M. Nilges alculation of protein structures with ambiguous distance restraints. Automated assignment of ambiguous NOE crosspeaks and disulphide connectivities. J. Mol. Biol. 245, , 995 ARIA (Ambiguous Restraints for Iterative Assignment) ARIA は,NOE データを用いた蛋白質の高次構造計算に必要な一連の作業を, 完全に自動に iterative に実行する.

46 YANA Peter Güntert, ET/RIKEN Frankfurt Univ. Automated NMR structure calculation using networkanchored assignment and constraint combination 初期構造の情報がない状態 や NOE の部分帰属がない状態 からの信頼性の高い自動構造計算法の確立..Network-anchored assignment of NOESY crosspeaks. 複数の NOE 情報が互いに支持する構造は確からしい. お互いに帰属を相補しあう NOE の組み合わせを優先する. 2.onstraint combination. ノイズが含まれている可能性がある距離情報を 2 つづつペアにして ( どちらかが満たされればいいという条件 ) 導入し, 誤った距離情報が使用されるリスクを下げる.

47 あいまいな 距離情報 Unambiguous NOEs assign ( resid 2 and name N ) ( resid 2 and name A ) volume= peak=246 ppm=8.936 ppm2=5.33 Ambiguous NOEs assign ( resid 2 and name N ) ( resid 25 and name B2 候補 or resid 26 and name A 候補 2 or resid 30 and name B 候補 3 or resid 76 and name B 候補 4 ) volume= peak=300 ppm=8.939 ppm2=3.764

48 Superpos itionof2 0NMR derive dstructu res RMSD >2.5 (Å) >2.0 >.5 >.0 >0.5 DinI( DinI( RIKEN)v sdini(ni sdini(ni,f0a.pdb RMS D=.54Å N NMR 情報をもとにした蛋白質の高次構造計算大腸菌 DinI 蛋白質 (84 アミノ酸残基 ) N RMSD for residues 2-79 Backbone atoms: 0.57A, all heavy atoms:.0a

49 あいまいな NOE 情報を用いた高次構造計算高次構造の精密化の例根粒菌 FixJ の 末端ドメイン RMSD Å (backbone / non-).82 / / / / /.07

50 NMR から得られる構造情報. 短距離の情報. NOE ( - 間距離 ) J- カップリング (φ,ψ,χ) 3 secondary shift (φ,ψ) ross-correlation ( ψ ) 2 isotope shift ( φ,ψ ) 水素結合 2. 長距離の情報. Residual dipolar coupling (bond vector) Rotational diffusion anisotropy, T /T 2 (bond vector) diamagnetic shift ( -ring, =O, -N) pseudocontact shift ( -paramag.) urie spin-relaxation cross correlation ( -paramag.)

51 TROSY-NO を測定することによって水素結合の存在を直接同定することが可能になった. O O N N O O N N O O N N O O N N 3h J N 3h J N 従来法アミドプロトンの交換速度やストランド間の NOE から間接的に同定 TROSY-NO 水素結合に由来する 3h J N を直接観測曖昧さのない情報イレギュラーな構造にも適用可

52 Residual dipolar coupling 蛋白質を弱く配向させると, 例えば N 結合の J N は, 本来の J N に residual dipolar coupling (D N ) が加算されて観測される. この D N は蛋白質の配向軸に対する角度の情報に変換できる. D N 由来の構造情報は曖昧さを含まず,NOE 由来の情報とは独立. 高次構造計算に有効である! 蛋白質を配向させる方法 J..Prestegard Nature Struct. Biol. supplement. 常磁性イオン 2. 両親媒性物質 DMP/DP etc. 3. 超分子会合体繊維状のファージ etc. 4. 繊維状高分子セルロース 5. ゲル加圧したアクリルアミド

53 高次構造の評価は非常に重要! 同一の NMR データから異なった方法によって導かれた 2 つの構造

54 NMR 法は構造決定の手段であるだけではなく, 相互作用などの機能解析にも非常に有用である. NMR で相互作用を解析するメリット. 種々の実験を比較的容易に組むことができる. 異種多量体の系. 種々のタイトレーションが可能. 2. 相互作用インターフェイスの同定が容易. hemical Shift Perturbation etc. 3. 交換速度に応じた解析. 速い交換 中程度の交換 遅い交換. NMR で相互作用を解析するデメリット.. 分子量の増大に伴う解析の困難さ. 2. 立体構造に直結する情報が得にくい. 3. 交換を考慮したデータの解析が必要.

55 srad5 の N 末端ドメインと dsdna の相互作用 5 N (ppm) N SQ G65 srad5(9-84) K64 A2 T dsdna K58 T (ppm) N I66 G65 K64 A69 I6 Y54 結合インターフェイスのマッピング Δδ

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