レスピア静注 経口液 60mg 第 2 部 ( モジュール 2) 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 薬物動態試験の概要文 ノーベルファーマ株式会社

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1 第 2 部 ( モジュール 2) 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 薬物動態試験の概要文 ノーベルファーマ株式会社

2 2.6.4 薬物動態試験の概要文 目次 薬物動態試験の概要文 まとめ 分析方法及び試験材料 分析方法 試験材料 吸収 分布 組織内濃度 全身オートラジオグラム 幼若動物と成熟動物における分布の差異 胎盤通過性 タンパク質結合性 代謝 代謝経路 代謝物 代謝活性の生後変化 排泄 尿 糞及び呼気中排泄 乳汁移行性 薬物動態学的薬物相互作用 薬物代謝酵素誘導 カフェインによって影響を受ける薬物 カフェインの代謝に影響する薬物 考察

3 2.6.4 薬物動態試験の概要文 略語一覧 略語 内容 AAMU 5-acetylamino-6-amino-3-methyluracil AC acetone AUC 血中濃度 - 時間曲線下面積 (area under the blood concentration time curve) Ca カフェイン (caffeine) [ 14 C]-CO 2 14 C 標識二酸化炭素 Cl クリアランス (clearance) C max 最高血漿中濃度 CNS 中枢神経系 (central nervous system) cpm counts per minute CSF 脳脊髄液 (cerebrospinal fluid) CYP チトクローム P450 (cytochrome P450) 1,7-DAU 6-amino-5-(N-formylmethylamino)-3-methyluracil 3,7-DAU 6-amino-5-(N-formylmethylamino)-1-methyluracil 1,3,7-DAU 6-amino-5-(N-formylmethylamino)-1,3-dimethyluracil DEX dexamethasone dpm disintegrations per minute FMO flavin containing monooxygenase フラビン含有モノオキシゲナーゼ [ 3 H, 14 C]-カフェイン 3 H, 14 C 二重標識カフェイン HPLC 高速液体クロマトグラフィー (high performance liquid chromatography) iv 静脈内 K m ミカエリス定数 MC 3-methylcholanthrene min 分 (minute) 1MU 1-methyluric acid 13MU 1,3-dimethyluric acid 17MU 1,7-dimethyluric acid 137MU 1,3,7-trimethyluric acid n 例数 NADPH nicotinamide adenine dinucleotide phosphate PB phenobarbital PBS リン酸緩衝生理食塩液 (phosphate-buffered saline) po 経口 PX paraxanthine T 1/2ab 吸収半減期 T 1/2 消失半減期 TB theobromine 138TMA 1,3,8-trimethylallantoin TP theophylline V d 分布容積 酵素の最大初速度 V max -2-

4 2.6.4 薬物動態試験の概要文 薬物動態試験の概要文レスピア静注 経口液 60 mg( 以下 本剤 ) は 3 ml 中にカフェインクエン酸塩 60 mgを含有する 静注及び経口のいずれも投与可能な バイアル入りの水溶性の無菌製剤である 本剤は 米国においてBen Venue Laboratories Inc( ベンベニューラボラトリーズ ) が製造販売している製剤とであることから 当該会社が米国において承認申請の際に提出した資料 [1999 年 9 月承認 ] に 適切な公表論文の精査を加えれば 本剤の薬物動態評価は可能と考えたため 新たな試験は実施しなかった 薬物動態試験成績については Ben Venue Laboratories Incより提供を受けた米国における申請資料と 文献検索 [PubMed; 検索式 (Caffeine Pharmacokinetics Animals)] により検索した論文の中から試験目的 試験方法 使用された実験動物種などを考慮し選定したものをCTD 様式に編集して参考資料とした まとめ 吸収 1 ラット及びウサギに [1-methyl- 14 C]-カフェインを 25 mg/kg 単回経口投与したとき カフェインの吸収半減期は 1 時間以内であり カフェインの経口吸収は速やかであった また 血漿中カフェインの消失半減期は ラットで 2.8 時間 ウサギでは 3.7 時間であり いずれの動物においても血漿からの消失は速やかであった 2 成熟動物と幼若動物の薬物動態パラメーターを比較すると イヌ及びウサギのいずれにおいても血漿中カフェインの消失半減期は成熟動物の方が幼若動物よりも短く 見かけの分布容積は幼若動物の方が また総クリアランスは成熟動物の方がそれぞれ大きかった 分布 1 マウスに [ 3 H, 14 C]-カフェインを 25 mg/kg 単回経口投与したとき 投与後 5 分のすべての組織中に [ 14 C] 放射能が認められ その放射能の大部分がカフェインと考えられた [ 14 C] 由来の放射能は肝臓及び脾臓では投与後 5 分に最高値を示したが 他の組織では投与後 30~60 分に最高値を示し その後 [ 14 C] 由来の放射能は いずれの組織においても速やかに減少し 投与後 24 時間では最高値の約 1/8~1/30 まで低下した 組織中カフェインの消失は脳で最も遅く 投与後 3 時間において [ 14 C] 由来の放射能の約 69% がカフェインであった ( その他の組織は約 26~44%) 2 雄マウス ( 有色 ) に [1-methyl- 14 C]-カフェイン又は [2-14 C]-カフェインを 0.7 又は 11 mg/kg 単回静脈内投与し 投与後 及び 24 時間の全身オートラジオグラムを作製し生体内分布について検討した いずれの [ 14 C]-カフェインを静脈内投与したときも 嗅覚器上皮 腎臓 肝臓 涙腺 消化管 消化管内容物及びメラニン組織に放射能の分布が認められた [1-methyl- 14 C]-カフェインを投与したときにのみ 骨髄 唾液腺 膵臓 胸腺 及び脾臓に放射能の分布が認められ 1-methyl 基の有無が組織への分布に影響するものと推察された -3-

5 2.6.4 薬物動態試験の概要文 3 新生児及び成熟のイヌにカフェインを 50 mg/kg 単回静脈内投与したとき 投与後 3 時間において 新生児イヌの骨格筋及び脳中に成熟イヌのそれよりも高いカフェイン濃度を示す傾向が認められた 投与後 10 時間においては 新生児イヌのすべての組織中に成熟イヌ組織よりも高いカフェイン濃度が認められた (P<0.01) 投与後 36 時間では 新生児イヌの腎臓 脳及び骨格筋中に 投与後 10 時間の成熟イヌのそれらよりも高濃度のカフェインが残留する傾向が認められた 4 妊娠 20 日目のラットにカフェインを 5 mg/kg 単回経口投与したとき 検討した母獣及び胎児の体液及び組織のいずれにおいてもカフェインが検出された 母獣血漿 胎盤 羊水及び胎児血液中の最高カフェイン濃度は同程度であった また 母獣血漿 胎盤 羊水 胎児血液 胎児肝臓及び胎児腎臓中に 主要代謝物である dimethylxanthine 代謝物 (paraxanthine theobromine theophylline) が認められた 妊娠 12 日目のラットにカフェインを 80 mg/kg 単回経口投与したとき 投与後 24 時間の母獣血液 羊水及び胎児中にカフェイン及びその主要代謝物である dimethylxanthine 代謝物 (paraxanthine theobromine theophylline) が認められた 5 カフェインのタンパク質結合率は 成熟ウサギ血清で 24.2% 幼若ウサギ血清で11.6% であった また 主要代謝物である paraxanthine theobromine 及び theophylline の成熟ウサギ血清との結合率は それぞれ65.7% 8.0% 及び 61.6% であった 代謝 1 ラット マウス ハムスター及びウサギのいずれの動物においても主要代謝経路は N- 脱メチル化及び C-8 位での酸化代謝であった (theophylline paraxanthine theobromine 1,3,7-trimethyluric acid 等 ) これらの代謝反応には 主に CYP1A2 CYP3A 及びフラビン含有モノオキシゲナーゼ (FMO) が関与した 2 ラット肝臓切片を用いてカフェイン代謝活性の生後変化について比較した カフェイン代謝活性は 1 日齢で最も低く 21 日齢で最高値を示し その後 成獣レベルに減少した 排泄 1 ラット マウス及びハムスターに [1-methyl- 14 C]-カフェインを 4 mg/kg 単回経口投与したとき 投与後 48 時間までの尿中に いずれの動物においても投与放射能の大部分が排泄され ( 平均 67~70%) カフェインの主要排泄経路は尿中排泄と考えられた 糞中には投与量の平均 3.8~5.7% が排泄された また ラット マウス及びハムスターの呼気中に それぞれ投与量の平均 20.6% 13.9% 及び15.3% の [ 14 C]-CO 2 が排泄された 2 生後 2 7 及び 35 日齢のイヌに [1-methyl- 14 C]-カフェインを 50 mg/kg 単回経口投与したときの尿中累積排泄率を測定した 放射能の尿中排泄率は 61~92% であり 生後日齢の増加に伴い尿中への排泄は増加した 一方 未変化カフェインの尿中排泄率は 2 日齢で約 17% と最も高く 35 日齢では約 5~6% と生後日齢の増加に伴い低下した 3 出産後 17~22 日の授乳中ウサギにカフェインを 5 mg/kg 単回静脈内投与したとき カフェイン及び代謝物の乳汁中への移行が認められた 乳汁中へのカフェインの移行は速やかで 乳 -4-

6 2.6.4 薬物動態試験の概要文 汁中カフェイン濃度及びその動態は血清中カフェインのそれと近似した 一方 主要代謝物で ある dimethylxanthine 代謝物 (paraxanthine theobromine theophylline) の乳汁中濃度は 血清中濃度より低い傾向を示した 薬物相互作用 1 カフェインは反復投与によってCYP1A2 及び CYP2B 分子種が介在する肝ミクロソーム薬物代謝酵素活性を誘導した ( 薬物代謝酵素誘導 ) 2 カフェインは反復投与によってカフェイン自身の代謝を亢進した ( 自己代謝誘導 ) 3 カフェインの主要代謝経路であるN- 脱メチル化及びC-8 位での酸化代謝には主にCYP1A2 及び CYP3A のCYP 分子種が関与し また カフェインは反復投与によって CYP1A2 及び CYP2B を誘導する これらの CYP 分子種によって代謝される薬物等は カフェインとの併用によって代謝が抑制又は増強され 薬理活性や生理活性が変動することが考えられる 4 代謝に CYP1A2 及びCYP3Aが関与する薬物及びこれらのCYP 分子種の活性を阻害及び誘導する薬物は カフェインの代謝を抑制又は促進し カフェインの血中濃度を上昇又は低下させ カフェインの薬理活性や生理活性を増強又は減弱させることが考えられる 試験成績一覧表 試動物種試験目的験被験物質 吸 経口投与試 ラット 収験 ウサギ [1-methyl- 14 C] -カフェイン 成熟動物と イヌ 幼若動物の ウサギ 比較試験 カフェイン 分 組織内濃度マウス 布 [ 3 H, 14 C]- カフ ェイン 全身オート マウス ラジオグラ [1-methyl- 14 C] フィー - 又は [2-14 C]- カフェイン 成熟動物と イヌ 幼若動物の カフェイン 試験結果ラット及びウサギに [1-methyl- 14 C]-カフェインを 25 mg/kg 経口投与したとき カフェインの吸収半減期は 1 時間以内であり カフェインの経口吸収は速やかであった また 血漿中カフェインの消失半減期は ラットで 2.8 時間 ウサギでは 3.7 時間であり いずれの動物においても血漿中からの消失は速やかであった 成熟動物と幼若動物の薬物動態パラメーターを比較すると イヌ及びウサギのいずれにおいても血漿中カフェインの消失半減期は成熟動物の方が幼若動物よりも短く 見かけの分布容積は幼若動物の方が また総クリアランスは成熟動物の方がそれぞれ大きかった マウスに [ 3 H, 14 C]-カフェインを 25 mg/kg 経口投与したとき 投与後 5 分のすべての組織に [ 14 C] 由来の放射能が認められ その放射能の大部分がカフェインと考えられた [ 14 C] 由来の放射能は肝臓及び脾臓では投与後 5 分で最高値を示したが 他の組織では投与後 30~60 分に最高値を示し その後 [ 14 C] 由来の放射能は いずれの組織においても速やかに減少し 投与後 24 時間では最高値の約 1/8~1/30 まで低下した 組織におけるカフェインの消失は脳で最も遅く 投与後 3 時間において [ 14 C] 由来の放射能の約 69% がカフェインであった ( その他の組織は約 26~44%) 雄マウスに [1-methyl- 14 C]-カフェイン又は [2-14 C]-カフェインを 0.7 又は 11 mg/kg 静脈内投与し 投与後 及び 24 時間の全身オートラジオグラムを作製し生体内分布について検討した いずれの [ 14 C]-カフェインを静脈内投与したときも 嗅覚器上皮 腎臓 肝臓 涙腺 消化管 消化管内容物及びメラニン組織に放射能の分布が認められた [1-methyl- 14 C]-カフェインを投与したときにのみ 骨髄 唾液腺 膵臓 胸腺 及び脾臓に放射能の分布が認められ 1-methyl 基の有無が組織への分布に影響するものと推察された 新生児及び成熟のイヌにカフェインを50 mg/kg 単回静脈内投与したとき 投与後 3 時間において 新生児イヌの骨格筋及び脳中に成熟 -5- CTD の記載箇所 参 参 参 参 参 参

7 2.6.4 薬物動態試験の概要文 比較試験 イヌのそれよりも高いカフェイン濃度を示す傾向が認められた 投与後 10 時間においては 新生児イヌのすべての組織中に成熟イヌ組織よりも高いカフェイン濃度が認められた (P<0.01) 投与後 36 時間では 新生児イヌの腎臓 脳及び骨格筋中に 投与後 10 時間の成熟イヌのそれらよりも高濃度のカフェインが残留する傾向が認められた 胎盤通過性 ラットカフェイン 妊娠 20 日目のラットにカフェインを 5 mg/kg 単回経口投与したとき 検討した母獣及び胎児の体液及び組織のいずれにおいてもカフェインが検出された 母獣血漿 胎盤 羊水及び胎児血液中の最高カフェイン濃度は同程度であった また 母獣血漿 胎盤 羊水 及び胎児血液 胎児肝臓及び胎児腎臓中に 主要代謝物である dimethylxanthine 代謝物 (paraxanthine theobromine theophylline) が認められた 妊娠 12 日目のラットにカフェインを 80 mg/kg 単回経口投与したとき 投与後 24 時間の母獣血液 羊水及び胎児中にカフェイン及びその主要代謝物である dimethylxanthine 代謝物 (paraxanthine theobromine theophylline) が認められた 参 参 タンパク質結合 ウサギ血清カフェイン paraxanthine theobromine theophylline カフェインのタンパク質結合率は 成熟ウサギ血清で 24.2% 幼若ウサギ血清で 11.6% であった また 主要代謝物である paraxanthine theobromine 及び theophylline の成塾ウサギ血清との結合率は それぞれ 65.7% 8.0% 及び 61.6% であった 参 代謝 代謝経路 ラットマウスハムスターウサギカフェイン ラット マウス ハムスター及びウサギのいずれの動物においても主要代謝経路は N- 脱メチル化及び C-8 位での酸化代謝であった (theophylline paraxanthine theobromine 1,3,7-trimethyluric acid 等 ) これらの代謝反応には 主に CYP1A2 CYA3A 及びフラビン含有モノオキシゲナーゼ (FMO) が関与した ~ 8 参 生後変化 ラット肝臓切片カフェイン ラット肝臓切片を用いてカフェイン代謝活性の生後変化について比較した カフェイン代謝活性は 1 日齢で最も低く 21 日齢で最高値を示し その後 成獣レベルに減少した 参 排泄 尿 糞及び呼気中排泄 ラットマウスハムスター [1-methyl- 14 C] -カフェイン ラット マウス及びハムスターに [1-methyl- 14 C]-カフェインを 4 mg/kg 単回経口投与したとき 投与後 48 時間には尿中にいずれの動物においても投与放射能の大部分が排泄され ( 平均 67~70%) カフェインの主要排泄経路は尿中排泄と考えられた 糞中には投与量の平均 3.8~5.7% が排泄された また ラット マウス及びハムスターの呼気中に それぞれ投与量の 20.6±0.8% 13.9±0.9% 及び 15.1±1.5% の [ 14 C]-CO 2 が排泄された 参 成熟動物と幼若動物の比較試験 イヌ [1-methyl- 14 C] -カフェイン 生後 2 7 及び35 日齢のイヌに [1-methyl- 14 C]-カフェインを50 mg/kg 単回経口投与したときの尿中累積排泄率を測定した 放射能の尿中回収率は 61~92% であり 生後日齢の増加に伴い尿中排泄は増加した 一方 未変化カフェインの尿中排泄率は 2 日齢で約 17% と最も高く 35 日齢では約 5~6% と生後日齢の増加に伴い低下した 参 乳汁移行性 ウサギカフェイン 出産後 17~22 日の授乳中ウサギにカフェインを5 mg/kg 静脈内投与したとき カフェイン及び代謝物の乳汁中への移行が認められた 乳汁中へのカフェインの移行は速やかで 乳汁中カフェイン濃度及びその動態は血清中カフェインのそれと近似した 一方 主要代謝物である dimethylxanthine 代謝物 (paraxanthine theobromine theophylline) の乳汁中濃度は血清中濃度より低い傾向を示した 参 -6-

8 2.6.4 薬物動態試験の概要文 薬物動態学的薬 物相互作用 肝薬物代謝酵素の誘導カフェインによって影響を受ける薬物カフェインの代謝に影響する薬物 カフェインは反復投与によってCYP1A2 及びCYP2B 分子種が介在する肝ミクロソーム薬物代謝酵素活性を誘導した カフェインは反復投与によってカフェイン自身の代謝を亢進した ( 自己代謝誘導 ) カフェインの主要代謝経路であるN- 脱メチル化及びC-8 位での酸化代謝には主に CYP1A2 CYP3A 及び CYP2B の CYP 分子種が関与し また カフェインは反復投与によって CYP1A2 及び CYP2B を誘導する これらの CYP 分子種によって代謝される薬物等は カフェインとの併用によって代謝が抑制又は増強され 薬理活性や生理活性が変動することが考えられる 代謝に CYP1A2 CYP3A 及び CYP2B が関与する薬物及びこれらの CYP 分子種の活性を阻害及び誘導する薬物は カフェインの代謝を抑制又は促進し カフェインの血中濃度を上昇又は低下させ カフェインの薬理活性や生理活性を増強又は減弱させることが考えられる 参 参 参 参 参 参 参 分析方法及び試験材料 分析方法 概要表に記載した 試験材料 (1) 標識化合物 1 標識位置標識化合物 [1-methyl- 14 C]-カフェイン 標識位置 O CH 3 H 3 C * N N O N N [2-14 C]- カフェイン [ 3 H, 14 C]- カフェイン標識位置の記載はない CH 3 O H 3 C N * O N CH 3 N N CH 3 2 標識化合物の比活性 概要表中に記載した (2) 被験物質及び代謝物被験物質 1,3,7-Trimethyl xanthine ( カフェイン ) 代謝物 1,3-Dimethylxanthine (Theophylline) -7-

9 2.6.4 薬物動態試験の概要文 1,7-Dimethylxanthine (Paraxanthine) 3,7-Dimethylxanthine (Theobromine) 1-Methylxanthine 3-Methylxanthine 7-Methylxantine 1-Methyluric acid 3-Methyluric acid 7-Methyluric acid 1,3-Dimethyluric acid 1,7-Dimethyluric acid 3,7-Dimethyluric acid 1,3,7-Trimethyluric acid 1,3,8-Trimethylallantoin 6-Amino-5-(N-formylmethylamino) -3-methyluracil (1,7-DAU) 6-Amino-5-(N-formylmethylamino) -1-methyluracil (3,7-DAU) 6-Amino-5-(N-formylmethylamino) -1,3-dimethyluracil (1,3,7-DAU) -8-

10 2.6.4 薬物動態試験の概要文 吸収 ( 添付資料 ~3 参 ) ラット及びウサギに [1-methyl- 14 C]-カフェインを 25 mg/kg 経口投与したときの薬物動態パラメーターを表 に示した カフェインの吸収半減期は 1 時間以内であり カフェインの経口吸収は速やかであった 血漿中カフェインの消失半減期は ラットで2.8 時間 ウサギでは3.7 時間であり いずれの動物においても血漿中からの消失は速やかであった また 放射能の吸収はカフェインと同様に速やか [ 吸収半減期 :0.1 時間 ( ラット ) 0.7 時間 ( ウサギ )] であったが 消失半減期は ラットで 5.4 時間 及びウサギで 11 時間であり 消失はカフェインよりも遅延した 表 ラット及びウサギに [1-methyl- 14 C]-カフェインを25 mg/kg 経口投与したときの 薬物動態パラメーター 薬物動態パラメーター ラットウサギカフェイン放射能カフェイン放射能 T 1/2 ( 時間 ) T 1/2ab ( 時間 ) C max (μg/ml) T 1/2 : 消失半減期 T 1/2ab : 吸収半減期 C max : 最高血漿中濃度 新生児 (1 日齢 ) 幼若( ~45 日齢 ) 及び成熟イヌにカフェインを 50 mg/kg また幼若 ( 生後 19~21 日 ) 及び成熟ウサギにカフェインを5 mg/kg をそれぞれ静脈内投与したときの血漿中カフェイン濃度を測定した 薬物動態パラメーターを表 に また 血漿中カフェイン濃度推移及び消失半減期の生後変化を図 にそれぞれ示した 成熟動物と幼若動物の薬物動態パラメーターを比較すると イヌ及びウサギのいずれにおいても血中カフェインの消失半減期 (T 1/2 ) は成熟動物の方が幼若動物よりも短く 見かけの分布容積 (V d ) は幼若動物の方が また総クリアランス (Cl) は成熟動物の方がそれぞれ大きかった これらのことから カフェインの薬物動態は 生後発達にともない変動するものと推察された 表 カフェインを成熟 幼若及び新生児イヌに50 mg/kg 又は成熟及び幼若ウサギに 5 mg/kg それぞれ静脈内投与したときの薬物動態パラメーター イヌウサギ薬物動態成熟生後 1 日生後 7 日成熟生後 19~21 日パラメーター n=6 n=9 n=13 n=10 n=10 1) T 1/2 ( 時間 ) 6.66± ± ± ± ±3.9 * 2) V d (L/kg) 0.78± ± ± ±0.06 4) 0.83±0.07 4)* Cl 3) (ml/kg/ 分 ) 1.38± ± ± ± ±0.80 * 平均値 ±SD 1): 消失半減期 2): 見かけの分布容積 3): 総カフェインの全身クリアランス 4): 定常状態における見か けの分布容積 *: 成熟ウサギと幼若ウサギ間の有意差 (P<0.05 対応のない t 検定 ) -9-

11 2.6.4 薬物動態試験の概要文 (A) (B) 図 種々の生後日齢のイヌにカフェインを 50 mg/kg 静脈内投与したときの血漿中カフェイン濃度推移 (A) 及び消失半減期 (B) (A): 生後 1 日齢 ( ) 生後 7 日齢 ( ) 生後 14 日齢 ( ) 生後 45 日齢 ( ) (B) における各プロットは個々の動物における半減期 分布 組織内濃度 ( 添付資料 ~3 参 ) カフェインは全身組織に広く分布し 組織分布は 組織の水分含量に比例すると報告されている マウスに [ 3 H, 14 C]-カフェインを 25 mg/kg 経口投与し 脳 心臓 腎臓 肝臓 肺 脾臓 睾丸 筋肉 血漿及び赤血球への分布について検討した 組織中 [ 14 C] 由来の放射能及びカフェインの分布を投与量に対する百分率 (%) で表 に示した 投与後 5 分ではすべての組織において [ 14 C] 由来の放射能が認められ その放射能の大部分がカフェインと考えられた 投与後 30 分では 大部分の組織中 [ 14 C] 由来の放射能は投与後 5 分より増加する傾向を示したが その差は大きくはなかった この間 カフェイン量は ほぼ一定で推移した [ 14 C] 由来の放射能は肝臓及び脾臓では投与後 5 分に最高値を示したが 他の組織では投与後 30~60 分に最高値を示し その後いずれの組織においても速やかに減少し 投与後 24 時間では最高値の約 1/8~ 1/30 まで低下した カフェインの代謝等による組織中 [ 14 C] 由来の放射能に対するカフェインの比率の低下は脳で最も遅く 投与後 3 時間において [ 14 C] 由来の放射能の約 69% がカフェインであった ( その他の組織は約 26~44%) -10-

12 2.6.4 薬物動態試験の概要文 表 マウスに [ 3 H, 14 C]-カフェインを25 mg/kg 単回経口投与したときの組織内分布 組織中放射能濃度 (% 投与 [ 14 C] 由来の放射能 ) 組織投与後 5 分投与後 30 分投与後 1 時間 ( 組織重量 ) 1) 14 C 放射能カフェイン 14 C 放射能カフェイン 14 C 放射能カフェイン 脳 (0.40 g) 心臓 (0.15 g) 腎臓 (0.47 g) 肝臓 (1.70 g) 肺 (0.23 g) 脾臓 (0.17 g) 睾丸 (0.22 g) 0.14 (0.13) 2) 筋肉 (12.9 g) 13.1 (12.5) 2) 血漿 (1.46 ml) 赤血球 (0.87 ml) 投与後 3 時間 投与後 8 時間 投与後 24 時間 14 C 放射能 カフェイン 14 C 放射能 カフェイン 14 C 放射能 カフェイン 脳 (0.37 g) 心臓 (0.15 g) (0.02) 2) 0.02 (0.01) 2) 腎臓 (0.47 g) (0.19) 2) 肝臓 (1.50 g) (0.44) 2) 肺 (0.23 g) (0.03) 2) 0.07 (0.01) 2) 脾臓 (0.16 g) (0.03) 2) 0.05 (0.02) 2) 睾丸 (0.25 g) (0.09) 2) 0.03 (0.01) 2) 筋肉 (12.9 g) 13.4 (13.4) 2) 血漿 (1.46 ml) 赤血球 (0.87 ml) ): 平均重量を示した 2): カフェインを含む非酸性画分中 [ 14 C] 由来の放射能を示した -: 測定値なし 全身オートラジオグラム ( 添付資料 参 ) 雄マウスに [1-methyl- 14 C]-カフェイン又は [2-14 C]-カフェインを0.7 又は11 mg/kg 静脈内投与し 投与後 及び24 時間の全身オートラジオグラムを作製し生体内分布について検討した 図 に [1-methyl- 14 C]-カフェイン投与後 1 3 及び24 時間の全身オートラジオグラムを代表例として示した 検討した全期間を通じて肝臓及び腎臓に高い放射能が認められた 投与後の早い時点においては 涙腺 鼻腔及び口腔内上皮 網膜メラニン細胞に多くの放射能が認められた 中程度の放射能が投与後 0.33 及び 1 時間の精嚢に認められた 中枢神経系 (CNS) 及び脂肪組織への放射能の分布は他組織に比較して低い傾向が認められた 投与後 24 時間では 肝臓及び腎臓以外では鼻及び口腔上皮 骨髄 消化管上皮 毛包及び震毛包 及び網膜メラニン細胞 次いでハーダー氏腺 唾液腺 脾臓 胸腺 肺 胆嚢 精巣上体 ( 副睾丸 ) 及び膵臓に放射能の残留が認められた 肝臓における放射能は 主に小葉中心部 ( 中心静脈部 ) に認められた 図 に [2-14 C]-カフェイン投与後 1 3 及び 24 時間の全身オートラジオグラムを代表例で示した 投与後の早い時点では 涙腺 嗅覚器の上皮 及び網膜メラニン細胞に高い放射能の分布が認められた 精嚢液には投与初期に中程度の放射能の分布が認められた その他の組織への放射能の分布は CNS 及び脂肪組織では低かったことを除いて均一であった 投与後 24 時間では 主に 嗅覚器上皮 毛包 涙腺 網膜メラニン細胞 及び消化管及び消化 -11-

13 2.6.4 薬物動態試験の概要文 管内容物に 次いで 肝臓の中心静脈部 胆嚢 口腔上皮 及び気管に放射能の残留が認められた いずれの [ 14 C]- 標識カフェインを静脈内投与したときも 嗅覚器上皮 腎臓 肝臓 涙腺 消化管 消化管内容物及びメラニン組織に放射能の分布が認められた [1-methyl- 14 C]-カフェインを投与したときにのみ 骨髄 唾液腺 膵臓 胸腺 及び脾臓に放射能の分布が認められ 1-methyl 基の有無が組織への分布に影響するものと推察された 投与後 1 時間 胸腺心臓中血液肝臓脾臓 Chatter 膵臓 鼻腔上皮唾液腺胃及び胃内容物腸管精嚢 投与後 3 時間 メラニン胸腺心臓中血液脾臓腎臓尿管 ハーダー氏腺骨髄肝臓膵臓精嚢陰茎 投与後 24 時間 鼻腔及び口腔上皮骨髄肺消化管脾臓腎臓 震毛唾液腺胸腺肝臓膵臓副睾丸 図 マウスに [1-methyl- 14 C]- カフェインを 0.7 mg/kg 静脈内投与したときの全身オートラジオグラム -12-

14 2.6.4 薬物動態試験の概要文 投与後 1 時間 食道肺精嚢 嗅覚器上皮胃精巣 投与後 3 時間 目気管支メラニン腎臓 涙腺肝臓膵臓消化管 投与後 24 時間 メラニン気管食道 口腔上皮胆嚢肝臓メラニン 図 マウスに [2-14 C]- カフェインを 11 mg/kg 静脈内投与したときの全身オートラジオグラム 幼若動物と成熟動物における分布の差異 ( 添付資料 参 ) 新生児イヌ ( 生後 2 日 ) 及び成熟イヌにカフェインを 50 mg/kg 単回静脈内投与し 投与後 3 10 及び 36 時間の組織中のカフェイン濃度を測定した 組織中のカフェイン濃度を図 に示した 投与後 3 時間において 新生児イヌの筋肉及び脳中に成熟イヌのそれよりも傾向的に高いカフェイン濃度が認められた 投与後 10 時間においては 新生児イヌのすべての組織中に成熟イヌ組織よりも高いカフェイン濃度が認められ (P<0.01) 新生児イヌの筋肉及び脳中カフェイン濃度は 投与後 3 時間の成熟イヌのそれよりも高い傾向が示された 投与後 36 時間では 新生児イヌの腎臓 脳及び筋肉中に 投与後 10 時間の成熟イヌのそれらよりも高濃度のカフェインが残留する傾向が示された -13-

15 2.6.4 薬物動態試験の概要文 3 時間 10 時間 3 時間 10 時間 36 時間投与後の時間成熟イヌ新生児イヌ ( 生後 2 日 ) 図 新生児及び成熟のイヌにカフェインを 50 mg/kg 単回静脈内投与したときの組織中カフェイン濃度 *: 各対応する時間の成熟イヌ組織との比 (P<0.01 スチューデントの t 検定 ) このような新生児イヌと成熟イヌにおける分布の差異は 表 に示したように 新 生児及び幼若のイヌ及び幼若ウサギにおいて 見かけの分布容積が成熟動物のそれに比較して より大きいことでも支持された 胎盤通過性 ( 添付資料 ~7 参 ) 妊娠 20 日目のラットにカフェインを5 mg/kg 単回経口投与したときの母獣血漿 胎盤 羊水 胎児血液及び胎児組織中のカフェイン及び代謝物濃度の対時間曲線及び最高カフェイン濃度を図 及び表 に示した カフェインは速やかに循環血中に吸収され 検討した母獣及び胎児の体液及び組織のいずれにおいてもカフェインが検出された 体液及び組織中最高カフェイン濃度は 母獣で投与後 30~60 分に また胎児で投与後 30 分 ~3 時間に到達し 母獣血漿 胎盤 羊水及び胎児血液中の最高カフェイン濃度は同程度であった また 母獣血漿 胎盤 羊水 胎児血液 胎児肝臓及び胎児腎臓中に カフェインの主要代謝物である dimethylxanthine 代謝物 (theophylline theobromine paraxanthine) が認められた 妊娠 12 日目のラットにカフェインを 80 mg/kg 単回経口投与したとき 表 に示したように 投与後 24 時間の母獣血漿 羊水及び胎児中にカフェイン及び主要代謝物である dimethylxanthine 代謝物 (theophylline theobromine paraxanthine) が認められた これらのことから カフェイン及びその代謝物は 妊娠中期及び後期のいずれにおいても胎盤を通過し 胎児に移行するものと考えられた -14-

16 2.6.4 薬物動態試験の概要文 図 妊娠 20 日目の母獣にカフェインを 5 mg/kg 単回経口投与したときの 母獣及び胎児の体液及び組織中カフェイン及び代謝物濃度推移 (a): 母獣血漿 (b): 胎盤 (c): 羊水 (d): 胎児血液 (e): 胎児肝臓 (f): 胎児腎臓 : カフェイン :theophylline :theobromine :paraxanthine 平均値 ±SE ( 母獣 :n=4 胎児 : n=2~6/ 母獣 1 腹 ) (a) 及び (e) は HPLC ピークが試料中の未知ピークと重なったため paraxanthine は測定されなかった 表 妊娠 20 日目のラットにカフェインを5 mg/kg 単回経口投与したときの 体液及び組織中最高カフェイン濃度 体液及び組織 カフェインの最高濃度 (μ mol/l 又は g) 母獣血漿 20±6 (30) 胎盤 19±2 (60) 羊水 21±5 (30) 胎児血液 19±4 (180) 胎児肝臓 15±2 (180) 胎児腎臓 15±3 (30) ( ) 内の数値は最高濃度到達時間 ( 分 ) を示す 平均値 ±SE (n=4~6) -15-

17 2.6.4 薬物動態試験の概要文 表 妊娠 12 日目のラットにカフェインを80 mg/kg 単回経口投与後 24 時間におけ るカフェイン及び代謝物の血液 羊水及び胎児中濃度 化合物 カフェイン及び代謝物濃度 (n mol/mg 又は ml) 血液羊水胎児 カフェイン 1.1± ± ±1.4 Theophylline 3.0± ± ±1.1 Paraxanthine 0.59± ± ±0.7 Theobromine 1.1± ± ±0.5 平均値 ±SE (n=5) タンパク質結合性 ( 添付資料 参 ) カフェインのタンパク質結合率は 成熟ウサギ血清で 24.2%( 遊離体 75.8±2.6%) 幼若ウサギ血清で 11.6%( 遊離体 88.4±7.1%) であった また 主要代謝物である paraxanthine theobromine 及びtheophylline の成熟ウサギ血清との結合率は それぞれ 65.7%( 遊離体 34.3 ±3.2%) 8.0%( 遊離体 92.0±1.5%) 及び 61.6%( 遊離体 38.4±2.9%) であった 代謝 代謝経路 ( 添付資料 ~8 参 ) 動物におけるカフェインの代謝経路を図 に示した いずれの動物においても主要代謝経路は N- 脱メチル化及び C-8 位での酸化代謝であった ラットにおける N- 脱メチル化代謝反応には 主に CYP1A2 及び FMOが また C-8 位での酸化代謝には 主に CYP3A がそれぞれ関与するものと推察された -16-

18 2.6.4 薬物動態試験の概要文 1,3,7-DAU Caffeine 1,3,7-Trimethyluric acid 3,7-DAU 1,3,8-Trimethyl allantoin N-Methylurea N,N'-Dimethylurea Theophylline Theobromine 1,7-DAU 1,3-Dimethyluric acid 1-Methylxanthine Paraxanthine 7-Methylxanthine 3,7-Dimethyluric acid 3-Methylxanthine 1,7-Dimethyluric acid 1-Methyluric acid 7-Methyluric acid 3-Methyluric acid 1,7-DAU:6-amino-5-(N-formylmethylamino)-3-methyluracil 3,7-DAU:6-amino-5-(N-formylmethylamino)-1-methyluracil 1,3,7-DAU:6-amino-5-(N-formylmethylamino)-1,3-dimethyluracil 図 カフェインの代謝経路 代謝物 ( 添付資料 参 ) ラット マウス及びハムスターに [1-methyl- 14 C]-カフェインを 4 mg/kg 経口投与したときの 投与後 24 時間までの尿中に排泄された代謝物の組成率を表 に示した 未変化カフェインの尿中排泄率は ラット及びマウスが ハムスターに比較して高い傾向を示した ラット尿中には マウス及びハムスターよりも多い theophylline( 尿中放射能に占める割合 : ラット 8.1% マウス 0.8% ハムスター 0.7%) 及びトリメチル化合物 [ カフェイン 1,3,7-trimethyluric acid 1,3,8-trimethylallantoin 6-amino-5-(N-formylmethylamino) -1,3-dimethyluracil]( 尿中放射能に占める割合 : ラット 40.8% マウス 19.7% ハムスター 21.1%) の排泄が認められた マウス尿中には ラット及びハムスターよりも多い極性代謝物 X 3 ( 尿中放射能の 22.2%) の排泄が認められた 一方 ハムスター尿中には ラット及びマウスよりも多い paraxanthine 1-methylxanthine 及び 6-amino-5-(N-formylmethylamino)-3 -methyluracil の排泄が認められた -17-

19 2.6.4 薬物動態試験の概要文 表 ラット マウス及びハムスターに [1-methyl- 14 C]-カフェインを 4 mg/kg 経口投 与したときの 投与後 24 時間までの尿中に排泄された代謝物 代謝物 % 尿中放射能ラットマウスハムスター 極性代謝物 X 1 3.8± ± ±0.5 極性代謝物 X 2 3.2± ± ±0.3 極性代謝物 X 3 0.9± ± ±0.3 1-Methyluric acid 6.5± ± ±0.7 1,3-Dimethyluric acid 5.3± ± ±0.3 1,7-Dimethyluric acid 4.1± ± ±0.5 1,3,7-Trimethyluric acid 9.7± ± ±0.7 1,3,8-Trimethylallantoin 5.4±0.7 < ±0.2 1,7-DAU 1) 3.0± ± ±0.6 1,3,7-DAU 2) 22.6± ± ±0.8 1-Methylxanthine 5.8± ± ±0.9 Theophylline 8.1± ± ±0.2 Paraxanthine 18.2± ± ±2.3 カフェイン 3.1± ± ±0.2 1):6-amino-5-(N-formylmethylamino)-3-methyluracil 2):6-amino-5-(N-formylmethylamino)-1,3-dimethyluracil ラット マウス及びハムスターに [1-methyl- 14 C]- カフェインを 4 mg/kg 経口投与したとき 投与後 48 時間までの呼気中に [ 14 C]-CO 2 が排泄され 1-methyl の脱メチル化を経由した CO 2 へ の酸化代謝が示唆された ( 表 ) 代謝活性の生後変化 ( 添付資料 参 ) 生後 及び 120 日齢のラットの肝臓切片を用いてカフェイン代謝活性の生後変化について比較した 表 に示したように カフェイン代謝活性は 1 日齢で最も低く 21 日齢で最高値を示し その後 成獣レベルに減少した N- 脱メチル化はカフェインの主要代謝経路であり 1 35 及び 120 日齢のラット肝臓切片では総代謝物の 70% が また 及び 28 日齢のラット肝臓切片では総代謝物の80% がそれぞれN- 脱メチル代謝物であった ( 図 表 ) N-1の脱メチル化 (theobromine が生成 ) は すべての日齢において カフェインの主要な脱メチル化代謝経路であった -18-

20 2.6.4 薬物動態試験の概要文 図 ラット肝臓切片によるカフェイン代謝の生後変化 1,3,7-DAU:6-amino-5-(N-formylmethylamino)-1,3-dimethyluracil 表 ラット肝臓切片におけるカフェイン代謝活性 日齢 比活性 N- 脱メチル代謝物生成率 (% Dimethylxanthine) (n mol/g 肝臓 / 時間 ) Theobromine Theophylline Paraxanthine ± % (25%) * 33% (23%) * 30% (21%) * ± ) 50% (40%) * 20% (16%) * 30% (24%) * ± ) 50% (35%) * 20% (14%) * 30% (21%) * 1): 図 から読み取り作製 *: 総カフェイン代謝物に対する比率 (% 総カフェイン代謝物 ) 排泄 尿 糞及び呼気中排泄 ( 添付資料 ~2 参 ) ラット マウス及びハムスターに [1-methyl- 14 C]-カフェインを 4 mg/kg 経口投与したときの投与後 48 時間の組織中放射能及び投与後 48 時間までの排泄物中の放射能の回収率を表 に示した いずれの動物においても投与放射能の大部分は尿中に排泄され ( 平均 67 ~70%) カフェインの主要排泄経路は尿中排泄と考えられた 糞中には ラット マウス及びハムスターでそれぞれ投与量の平均 及び 5.7% が排泄された また ラット マウス及びハムスターの呼気中に それぞれ投与量の 20.6±0.8% 13.9±0.9% 及び 15.3±1.5% の [ 14 C]-CO 2 が排泄された -19-

21 2.6.4 薬物動態試験の概要文 表 ラット マウス及びハムスターに [1-methyl- 14 C]-カフェインを4 mg/kg 経口 投与後 48 時間の組織中及び投与後 48 時間までの排泄物中の放射能濃度 放射能の回収率 (% 投与放射能量 ) ラット マウス ハムスター 呼気 ([ 14 C]-CO 2 ) 20.6± ± ±1.5 尿 68.2± ± ±4.3 糞 3.8± ± ±1.3 臓器 3.1±0.9 1) 3.3±0.5 2) 2.4±0.2 2) カーカス - 3.6± ±0.3 総回収率 94.0± ± ±6.0 1): 胃 小腸 盲腸及び結腸 2): 心臓 肺 肝臓 腎臓 睾丸 脳 脾臓 胃 小腸 盲腸及び結腸 生後 2 7 及び 35 日齢のイヌに [1-methyl- 14 C]-カフェインを 50 mg/kg 単回経口投与したときの尿中排泄終了時の尿中累積排泄率を表 に示した 放射能の尿中回収率は 61~ 92% であり 生後日齢の増加に伴い尿中排泄率は増加した 一方 未変化カフェインの尿中排泄率は 2 日齢で約 17% と最も高く 35 日齢では約 5~6% と生後日齢の増加に伴い低下した これらのことから カフェインの尿中排泄は カフェイン代謝に関わる酵素の生後発達に伴い 上昇したものと推察された 表 及び 35 日齢のイヌに [1-methyl- 14 C]-カフェインを 50 mg/kg 単回経口投与 したときの尿中排泄終了時の未変化体及び代謝物の尿中累積排泄率 % 投与放射能量 総排 1,7-1,3, TMU Ca 1) 1MU 2) 17MU 3) 13MU 6) 泄率 DAU 4) DAU 5) TMA 7) 8) PX 9) TP 10) 2 日齢 日齢 日齢 tr. 11) tr 日齢 tr. tr tr ): カフェイン 2):1-methyluric acid 3):1,7-dimethyluric acid 4): 6-amino-5-(N-metylformylamino)-3-methyluracil 5):6-amino-5-(N-methylformylamino)-1,3 -dimethhyluracil 6):1,3-dimethyluric acid 7): 1,3,8-trimethylallantoin 8):1,3,7-trimethyluric acid 9):paraxanthine 10):theophylline 11):trace 尿中排泄終了時間 : 投与後 168 時間 (2 日齢 ) 投与後 101 時間 (7 日齢 ) 投与後 46 時間 (35 日齢 ) 乳汁移行性 ( 添付資料 参 ) 出産後 17~22 日の授乳中ウサギにカフェインを 5 mg/kg 単回静脈内投与したとき 図 に示したように 乳汁中へのカフェイン及び代謝物の移行が認められた 乳汁中へのカフェインの移行は速やかで 乳汁中カフェイン濃度及びその動態は血清中カフェインのそれと近似した 一方 カフェインの主要代謝物である dimethylxanthine 代謝物 (theophylline theobromine paraxanthine) の乳汁中濃度は血清中濃度より低い傾向を示した -20-

22 2.6.4 薬物動態試験の概要文 カフェイン ( ) 濃度 paraxanthine( ) 濃度 theobromine( ) 濃度 theophylline( ) 濃度 図 ウサギにカフェインを 5 mg/kg 単回静脈内投与したときの血清及び乳汁中カフェイン及び代謝物濃度 : 血清中濃度 : 乳汁中濃度 薬物動態学的薬物相互作用 薬物代謝酵素誘導 ( 添付資料 ~2 参 ) (1) 肝薬物代謝酵素の誘導ラットにカフェインを飲料水中 及び 0.3% の濃度で 2 週間経口投与し 薬物代謝酵素誘導について検討した 薬物代謝酵素量及び活性を表 に示した カフェイン投与によって ethoxyresorfin O-deethylase(CYP1A 分子種 ) 活性は用量依存的に顕著に上昇し また より程度は小さいが pentoxyresorufin O-depentylase(CYP2B 分子種 ) 活性が上昇した カフェイン投与によってerythromycin N-demethylase(CYP3A 分子種 ) 活性 p-nitrophenol hydroxylase(cyp2e1) 活性 lauric acid hydroxylase(cyp4a1) 活性 総チトクローム P450 含量及びミクロソームタンパク質量は いずれも変動しなかった また SDS 電気泳動とイムノブロットを組み合わせた分析において カフェイン投与によって CYP1A2 の用量依存的な増加 (CYP1A1 は対照群及びカフェイン投与群のいずれにおいても検出されない ) と高投与量における CYP2B アポタンパク質レベルの上昇が示されたが CYP3A 及び CYP2E1 のアポタンパク質レベルは変動しなかった また ラットにカフェインを150 mg/kg/ 日 (3 日間 ) 経口投与したとき 肝ミクロソーム CYP1A2 及び CYP2B1/2B2 含量が約 2 倍に増加し これらのチトクローム P450 分子種が関与する薬物代謝酵素活性が上昇した CYP3A1 及び CYP2E1 量は変動しなかった これらの結果から カフェインは反復投与によって CYP1A2 及びCYP2B 分子種が介在する肝ミクロソーム薬物代謝酵素活性を誘導するものと考えられた -21-

23 2.6.4 薬物動態試験の概要文 表 ラットにおける肝チトクローム P450 依存性薬物代謝酵素活性への カフェイン投与の影響 酵素活性 投与カフェイン濃度 (% w/v) Ethoxyresorufin O-deethylase 1) 100±15 674±150 *** 1101±176 *** 1170±525 ** Pentoxyresorufin O-depentylase 1) 44±10 203±85 * 271±94 ** 268±146 * p-nitrophenol hydroxylase 2) 1.20± ± ± ±0.08 Erythromycin N-demethylase 2) 3.50± ± ± ±0.20 Lauric acid hydroxylase 2) 1.57± ± ± ±0.43 総チトクローム P450 (nmol/mg protein) 0.62± ± ± ±0.09 ミクロソームタンパク質量 (mg/g 肝臓 ) 20±1 22±3 27±3 ** 23±4 カフェインは 及び 0.3% カフェイン水を 2 週間給水することで投与した 各値は平均値 ±SD (n=5) 1):p mol/min/mg protein 2): n mol/min/mg protein *: P<0.05 **: P<0.01 ***: P<0.001 ( 対カフェイン濃度 0% スチューデントの t 検定 ) (2) 自己代謝誘導前項 (1) において記述したように カフェインの反復投与によって CYP1A2 及び CYP2B 分子種が誘導され これらのCYP 分子種が関与する薬物代謝酵素活性が上昇した また ラットにカフェインを 150 mg/kg/ 日 (3 日間 ) 経口投与したとき肝 CYP1A2 及び CYP2B1/2B2 含量が約 2 倍増加し CYP1A2 が関与するカフェインの脱メチル化 (theobromine paraxanthine 及び theophylline) 及びCYP3A が関与する C-8 位の酸化代謝物 (1,3,7-trimethyluric acid) の生成量 ( 表 ) が約 2 倍増加した これらのことは カフェイン投与によってカフェイン自身の代謝が亢進することを示している 表 対照群及びカフェイン処理ラットの肝ミクロソーム画分における カフェイン代謝 代謝物酵素活性 代謝物生成速度 (pm/min/mg タンパク質 ) 対照群 (n=6) カフェイン処理群 (n=8) N-1 脱メチル化 (theobromine) 47±10 116±14 N-3 脱メチル化 (paraxanthine) 41±8 93±12 N-7 脱メチル化 (theophyline) 67±12 121±18 C-8 酸化 (1,3,7-trimethyluric acid) 531± ±115 総代謝活性 680± ±189 カフェイン :1 mm 平均値 ±SD カフェインによって影響を受ける薬物 ( 添付資料 ~4 参 ) カフェインは反復投与によってCYP1A2 及び CYP2B を誘導するため これらの CYP 分子種によって代謝される薬物 ( キサンチン系薬剤等 ) などの代謝を抑制又は増強し 薬理活性や生理活性を変動させることが考えられる カフェインの代謝に影響する薬物 ( 添付資料 参 ) いずれの動物においてもカフェインの主要代謝経路はN- 脱メチル化及びC-8 位での酸化代謝 -22-

24 2.6.4 薬物動態試験の概要文 であり これらの代謝反応には 主に CYP1A2 及び CYP3A らの CYP 分子種が関与していることから 代謝に CYP1A2 及び CYP3A が関与する薬物 これらのCYP 分子種の活性を阻害する薬物 ( シメチジン等 ) 及びこれらの CYP 分子種を誘導する薬物は カフェインの代謝を抑制及び増強し カフェインの血中濃度を上昇又は低下させるため これらの薬物との併用は カフェインの薬理活性や生理活性を増強又は減弱させることが考えられる 考察 カフェインの経口吸収及び血中からの消失は いずれの動物においても速やかであった また ヒトにおいてもカフェインの消化管からの吸収は速やかでほぼ完全であり その薬物動態は投与経路に依存しないと報告されている ( 添付資料 参 ) マウスに [ 3 H, 14 C]-カフェインを 25 mg/kg 経口投与したとき 投与後 5 分においてすべての組織中に 14 C 放射能が認められ その放射能の大部分がカフェインと考えられた 14 C 放射能は肝臓及び脾臓では投与後 5 分で その他の組織では投与後 30~60 分でそれぞれ最高値を示した その後 いずれの組織中放射能も速やかに減少し 投与後 24 時間では最高値の約 1/8~1/30 まで低下し 放射能の高い残留を示す臓器は認められなかった 組織におけるカフェインの放射能比率の低下は薬効発現の標的組織である脳で最も遅く 投与後 3 時間において 14 C 放射能の約 69% がカフェインであり ( その他の組織は約 26~44%) 薬効発現との関連が示唆された カフェインを投与した妊娠中期及び後期のウサギのいずれにおいても胎児体液及び胎児組織中にカフェイン及びその代謝物が検出されたことから カフェイン及びその代謝物は 胎盤を通過し 胎児に移行するものと考えられた カフェインの血清タンパク質との結合率は 成熟ウサギ及び幼若ウサギ血清で 24.2% 及び 11.6% であった また カフェインの血漿タンパク質との結合率はヒト及び種々の動物において 10~35% と報告されている ( 添付資料 参 ) これらのことから カフェインのタンパク質結合は低いと推察された ラット マウス ハムスター及びウサギのいずれの動物においても主要代謝経路はN- 脱メチル化及び C-8 位での酸化代謝であった (theophylline paraxanthine theobromine 1,3,7-trimethyluric acid 等 ) これら N- 脱メチル化代謝には 主に CYP1A2 及びFMO が また C-8 位での酸化代謝には 主にCYP3A がそれぞれ関与するものと推察された ラットにカフェイン150 mg/kg/ 日を反復経口投与 (3 日間 ) したとき 肝ミクロソーム CYP1A2 及び CYP2B1/2B2 含量が約 2 倍に増加し これらの CYP 分子種が関与する薬物代謝酵素活性が上昇した これらの結果から カフェインは反復投与によって CYP1A2 及び CYP2B が介在する肝ミクロソーム薬物代謝酵素活性を誘導するものと考えられた また CYP1A2 は カフェインの主要代謝経路である N- 脱メチル化代謝に関与することから カフェインは 反復投与によってカフェイン自身の代謝を促進する自己代謝誘導をもたらすものと考えられた ラット マウス及びハムスターに [1-methyl- 14 C]-カフェインを 4 mg/kg 単回経口投与したとき 投与後 48 時間までの尿中にいずれの動物においても投与放射能の大部分が排泄され ( 平均 67~70%) カフェインの主要排泄経路は尿中排泄と考えられた また ラット マウス及びハ -23-

25 2.6.4 薬物動態試験の概要文 ムスターの呼気中に それぞれ投与量の約 14~21% に相当する [ 14 C]-CO 2 が排泄され 1 位の脱メチル化による CO 2 の生成が示唆されるとともに 呼気中排泄もカフェインの主要な排泄経路の 1 つであることが示された また カフェインを投与したウサギにおいて乳汁中にカフェイン及び代謝物が検出され カフェイン及びその代謝物は乳汁中へ移行するものと考えられた 成熟動物と幼若動物におけるカフェインの薬物動態には以下の差異が認められた 成熟動物と幼若動物の薬物動態パラメーターを比較すると イヌ及びウサギのいずれにおいても血中カフェインの消失半減期は成熟動物の方が幼若動物よりも短く 分布容積は幼若動物の方が また 総クリアランスは成熟動物の方がそれぞれ大きかった また 新生児及び成熟のイヌにカフェインを 50 mg/kg 単回静脈内投与したとき 新生児イヌにおいて成熟イヌよりも高いカフェインの組織中分布と残留が認められた さらに 生後 2 日齢 7 日齢及び 35 日齢のイヌに [1-methyl- 14 C]-カフェインを 50 mg/kg 単回経口投与したとき 放射能の尿中累積排泄率は 61~92% であり 生後日齢の増加に伴い尿中排泄は増加したのに対して 未変化カフェインの尿中排泄率は 2 日齢で約 17% と最も高く 35 日齢では約 5~6% と生後日齢の増加に伴い低下し カフェインの尿中排泄は カフェイン代謝に関わる酵素の生後発達に伴い上昇したものと推察された 一方 ラット肝臓切片を用いて カフェイン代謝活性の生後変化について比較したところ カフェイン代謝活性は 1 日齢で最も低く 21 日齢で最高値を示し その後 成熟レベルに減少した これらのことから カフェインの薬物動態は 肝薬物代謝酵素の生後発達に伴い変動するため 新生児と成熟動物では異なるが 出生後の時間経過とともに成熟動物レベルに近づくものと推察された なお イヌにおいて新生児と成熟動物で認められたカフェインの組織内分布の差異は 新生児イヌの組織含水量が成熟イヌのそれよりも多いことも一因と推察されている カフェインの主要代謝経路に関与する CYP 分子種は N- 脱メチル化では主に CYP1A2 であり C-8 位の酸化代謝では主に CYP3A であった また カフェインは反復投与によってCYP1A2 及び CYP2B を誘導した このため これらの CYP 分子種によって代謝される薬物等は カフェインとの併用によって代謝が抑制又は増強され 薬理活性や生理活性が変動することが考えられる また 代謝に CYP1A2 及び CYP3A が関与する薬物及びこれらの CYP 分子種の活性を阻害する薬物 ( シメチジン等 ) は カフェインの代謝を抑制するため カフェインの血中濃度を上昇させ カフェインの薬理活性を増強させることが考えられる また CYP1A2 及び CYP3A らの CYP 分子種を誘導する薬物はカフェインの代謝を増強するためカフェインの薬理活性を減弱することが考えられる このため これらの薬物との併用には注意喚起が必要である -24-

26 製造販売承認申請書添付資料 第 2 部 ( モジュール 2) 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 ノーベルファーマ株式会社

27 目次 薬物動態試験一覧表 吸収 分布 代謝 排泄 薬物動態的薬物相互作用

28 略語一覧 略語 内容 AAMU 5-acetylamino-6-amino-3-methyluracil AC acetone AUC 血中濃度 - 時間曲線下面積 (area under the blood concentration time curve) Ca カフェイン (caffeine) [ 14 C]-CO 2 14 C 標識二酸化炭素 Cl クリアランス (clearance) C max 最高血漿中濃度 CNS 中枢神経系 (central nervous system) cpm counts per minute CSF 脳脊髄液 (cerebrospinal fluid) CYP チトクローム P450 (cytochrome P450) 1,7-DAU 6-amino-5-(N-formylmethylamino)-3-methyluracil 3,7-DAU 6-amino-5-(N-formylmethylamino)-1-methyluracil 1,3,7-DAU 6-amino-5-(N-formylmethylamino)-1,3-dimethyluracil DEX dexamethasone dpm disintegrations per minute FMO flavin containing monooxygenase [ 3 H, 14 C]-カフェイン 3 H, 14 C 二重標識カフェイン HPLC 高速液体クロマトグラフィー (high performance liquid chromatography) ip 腹腔内投与 iv 静脈内 K m ミカエリス定数 MC 3-methylcholanthrene min 分 1MU 1-methyluric acid 3MU 3-methyluric acid 13MU 1,3-dimethyluric acid 17MU 1,7-dimethyluric acid 137MU 1,3,7-trimethyluric acid 1MX 1-methylxanthine 3MX 3-methylxanthine 7MX 7-methylxanthine 37MX 3,7-dimethylxanthine (theobromine) n 例数 NADPH nicotinamide adenine dinucleotide phosphate PB phenobarbital PBS リン酸緩衝生理食塩液 (phosphate-buffered saline) po 経口 PX paraxanthine R 2 相関係数 rpm 回転数 T 1/2ab 吸収半減期 T 1/2 消失半減期 P450 チトクローム P450 TB theobromine 138TMA 1,3,8-Trimethylallantoin TP theophylline -2-

29 V V max 分布容積酵素の最大初速度 -3-

30 験po 1975/Arthur D. Little, Inc. アメリカ 参吸収分布 参 代謝 参 排泄イヌ po 1982/Ben Gurion 大学 イスラエル 参 薬物相互作用 参 薬物動態試験一覧表試試験目的動物種投与方法報告年 / 研究機関 CTD における記載箇所 経口投与試験 成熟動物と幼若 動物の比較試験 組織内濃度 全身オートラジ オグラフィー 成熟動物と幼若 動物の比較試験 ラット ハムス ター ウサギ サル イヌ ウサギ マウス マウス iv po iv 1977/Ben Gurion 大学 イスラエル 1992/Kentucky 大学 アメリカ 1972/Arthur D. Little Inc. アメリカ 1983/Louisville 大学 アメリカ 参 参 参 参 イヌ iv 1981/Ben Gurion 大学 イスラエル 参 胎盤通過性 ラット po 1993/Macquarie 大学 オーストラリア 1985/Istituto di Ricercher Farmacologiche Mario Negri イタリア 参 タンパク質結合ウサギ血清 1992/Kentucky 大学 アメリカ 参 代謝経路 ラット ヒト ラット マウス ハムスター ウサギ ラット ラット ラット ラット ラット po iv in vitro in vitro in vitro in vitro in vitro 1988/Laboratoire de Biochimie-Faculté de M edecine フランス 1985/Research Department of Nestec Ltd. スイス 1985/Ohio 州立大学 アメリカ 1998/Inha 大学 韓国 2007/Polish Academy of Sciences ポーラン ド 2001/Polish Academy of Sciences ポーラン ド 1997/Inha 大学 韓国 1986/Ben Gurion 大学 イスラエル 生後変化ラット in vitro 1993/Hôpital Saint Vincent de Paul フラ 単回投与 成熟動物と幼若 動物の比較試験 ラット マウス ハムスター ンス po 1985/Research Department of Nestec Ltd. スイス 参 参 参 参 参 参 参 参 参 乳汁移行性ウサギ iv 1992/Kentucky 大学 アメリカ 参 薬物代謝酵素誘 導 自己代謝誘導 カフェインによ って影響を受け る薬物 カフェインの代 謝に影響する薬 物 ラット ラット ラット ラット ラット ラット ラット ラット po po po po in vitro in vitro po po 1995/Surrey 大学 イギリス 1995/Labratoire de Biochimie-Nutrition, Faculté de Médecine フランス 1995/Surrey 大学 イギリス 1995/Labratoire de Biochimie-Nutrition, Faculté de Médecine フランス 1998/Inha 大学 韓国 2007/Polish Academy of Sciences ポーラン ド 1995/Surrey 大学 イギリス 1995/Labratoire de Biochimie-Nutrition, Faculté de Médecine フランス 参 参 参 参 参 参 参 -4-

31 吸収 添付資料 参 総説のため詳細な実験方法の記載がない 被験薬物 [1-methyl- 14 C]- カフェイン 動物種 投与方法 投与量 試料 分析方法 ラット ハムスター ウサギ サル po 投与 25 mg/kg 血漿 放射能又はカフェインを測定 各種動物に [1-methyl- 14 C]-カフェインを 25 mg/kg po 投与したときの薬物動態パラメータ 薬物動態パラメータ ラット ハムスター ウサギ サル T 1/2 ( 時間 ) 放射能 カフェイン T 1/2ab ( 時間 ) 放射能 カフェイン C max (μg/ml) カフェイン T 1/2 : 消失半減期 T 1/2ab : 吸収半減期 C max : 最高血漿中濃度 概要文 の表 に一部を転載 添付資料 参被験薬物カフェイン動物種 / 体重 / 動物数雑種イヌ ( 生後 及び 30~45 日 及び成熟イヌ ) / 生後 1 日 :260 ~275 g 生後 3~45 日 : 記載なし 成熟 :11~15 kg / 生後 1 日 :9 匹 生後 3 日 :( 記載なし ) 生後 7 日 :13 匹 生後 14 日 :( 記載なし ) 生後 30 ~45 日 :5 匹及び成熟 :6 匹性別 / 週齢雌雄 / 生後 及び 30~45 日 及び成熟イヌ投与形態カフェイン (10 mg/ml) 水溶液投与方法 iv 投与投与量 50 mg/kg 試料血漿分析方法分光光度計 (273 nm) を用いて測定 (Axelrod 1953) Axelrod J et al J Parmac Exp Ther 1953; 107: 新生児 幼若及び成熟イヌにカフェインを 50 mg/kg iv 投与したときの薬物動態パラメータ T 1/2 ( 時間 ) V d (L/kg) Cl (L/kg/ 分 ) ) 生後 1 日 47.58± ± ±0.73 2) 生後 1 週間 24.09± ± ±0.47 3) 生後 30~45 日 3.70± ± ±0.7 4) 成熟 6.66± ± ±1.5 1):n=9 2):n=13 3):n=5 4):n=6 平均値 ±SE 概要文 の表 に転載 -5-

32 種々の生後日齢のイヌにカフェインを 50 mg/kg iv 投与したときの血漿中カフェインの消失曲線イヌ生後 1 日齢 ( ) 生後 7 日齢 ( ) 生後 14 日齢 ( ) 生後 45 日齢 ( ) いずれの日齢群においても カフェインは 1 相性の消失を示した 消失係数 (Kel) は / 分 ( 生後 1 日齢 ) / 分 ( 生後 7 日齢 ) / 分 ( 生後 14 日齢 ) 及び / 分 ( 生後 45 日齢 ) であった 概要文 の図 に転載 種々の生後日齢のイヌにカフェインを 50 mg/kg iv 投与したときの血漿中カフェインの消失半減期と生後日齢との関係イヌ生後 1 日齢生後 3 日齢生後 7 日齢生後 14 日齢生後 30 日齢生後 45 日齢成熟 各ポイントは個々の動物における半減期を示した T 1/2 : 消失半減期 ( 時間 ) 概要文 の図 に転載 添付資料 参被験薬物カフェイン動物種 / 体重 / 動物数 New Zealand White ウサギ授乳ウサギ ( 出産後 17~22 日 )/ 3.92~5.34 kg/10 匹受乳ウサギ ( 幼若ウサギ 生後 19~21 日 )/ 0.180~0.374 kg/10 匹投与形態カフェインを生理食塩液に溶解 (2 mg/ml 投与当日に調製) 投与方法授乳ウサギに耳静脈から iv 投与投与量 5 mg/kg 試料成熟ウサギ血清 : 投与後 及び 8 時間 (n=10) paraxanthine theobromine theophylline 測定は投与後 及び 24 時間乳汁 : 投与後 及び24 時間 (paraxanthine theobromine theophylline 測定 ) 幼若ウサギ血清 : 投与後 及び 120 時間 (n=10) 分析方法血清及び乳汁の ph 測定は clinical blood gas analyzer を用いて測定 -6-

33 タンパク質結合は plexiglass cells 中で Spectrapor 2 透析膜を用いて M リン酸緩衝液 (ph 7.2) で透析して測定 血清及び乳汁中カフェイン paraxanthine theobromine theophylline 濃度は HPLC 法 * を用いて測定 HPLC 条件カラム :C18 カラム ( 粒子径 :10 μm mm) 移動相 :tetrahydrofuran:methanol:0.01 M KH 2 PO 4 (1:9:90 ph 3.5) 流速 :1.2 ml/ 分検出 :214 nm 溶出時間 : theobromine;5.2 分 paraxanthine;8.5 分 theophylline;9.4 分 β-hydroxyethyltheophylline;10.9 分 カフェイン ;16.5 分 *:Dorrbecker BR et al, J Chromatogr Biomed Appl 1984; 336: 授乳期間中のウサギにカフェインを 5 mg/kg iv 投与したときの血清及び乳汁中カフェイン及び代謝物濃度カフェインの消失が a: 急速な例 b: 緩徐な例における : 血清カフェイン : 乳汁 : 血清 paraxanthine : 乳汁 paraxanthine カフェインの消失が c: 急速な例 d: 緩徐な例における : 血清 theobromine : 乳汁 theobromine : 血清 theophylline : 乳汁 theophylline : カフェイン :theophylline :paraxanthine :theobromine M/S( 乳汁 / 血清薬物濃度比 ) 値の予測値と実測値の相関関係 R 2 =0.953 M/S 予測値 -7-

34 幼若ウサギにカフェインを 5 mg/kg iv 投与したときの血清中カフェイン及び代謝物濃度推移幼若ウサギカフェイン 5 mg/kg iv 投与 : カフェイン :theophylline :paraxanthine :theobromine カフェイン [ ] a Paraxanthine [5.35 -] Theobromine c [ ] 時間 ( 時間 ) 授乳ウサギにカフェインを 5 mg/kg iv 投与したときの f s f m M/S pred 及び M/S obs 乳汁 / 血清 ( 予血清中脱脂乳中脱脂乳 / 全乳乳汁 / 血清 ( 実測測 ) 例数遊離形分率遊離形分率薬物濃度比値 ) 薬物濃度比薬物濃度比 (f s ) (f m ) S/W M/S pred M/S obs ±0.026 b 0.842± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.038 Theophylline [ ] ± ± ± ± ±0.054 a:values in brackets represent pk a,log P (CHCl 3 :water)constants b:values are the standard deviations. c:in vitro measurements for theobromine and theophylline (f s,f m, and S/W)were determined from four animals; M/S obs values were calculated as the ratio of milk to serum AUC values over a discrete time interval for seven(theobromine) and six (theophylline) rabbits. 授乳ウサギ及び幼若ウサギにカフェインを 5 mg/kg iv 投与したときの薬物動態パラメータ パラメータ 成熟ウサギ 幼若ウサギ 差異 体重 (kg) 4.49±0.539(3.92~5.34) 0.273±0.060(0.180~0.374) * d) a) Cl s (ml/min/kg) 3.83±1.94(1.32~8.18) 1.14±0.80(0.61~2.82) * b) Cl u (ml/min/kg) 5.09±2.60(1.66~10.78) 1.41±0.71(0.70~2.69) * c) V ss (L/kg) 0.679±0.058(0.583~0.802) 0.825±0.074(0.712~0.948) * T 1/2 (min) 156±88(54~358) 562±232(210~826) * f s 0.758± ±0.071 * a): 総カフェインの全身クリアランス b): 遊離形カフェインの全身クリアランス c): 定常状態における見 かけの分布容積 d): 成熟ウサギと幼若ウサギ間の有意差 (P<0.05 対応のない t 検定 ) ( ) 内の数値はデータの範囲 概要文 の表 に一部を転載 分布 添付資料 参 教科書のため実験方法の記載がない 添付資料 参添付資料 と同一資料考察を引用 -8-

35 添付資料 参 被験薬物 [ 3 H, 14 C]-カフェイン 動物種 / 体重 組織中放射能の測定 :CD-1 系マウス / 約 30 g 性別 / 週齢 / 動物数 雄 / 記載なし /36 匹 (1 群 3 匹 ) 投与形態 100 g/ml 溶液 ( 3 H/ 14 C 比 :15.6:1) 投与方法 po 投与 投与量 5 又は 25 mg/kg 試料 脳 心臓 腎臓 肝臓 肺 脾臓 睾丸 筋肉 血漿及び赤血球 各組織は生理食塩液で 9% ホモジネートを調製 分析法 放射能の測定 各ホモジネート (0.05 ml) に Amersham/Searle NCS solubilizer(0.5 ml) を添加し 1 晩加水分解後 測定 マウスに [ 3 H, 14 C]-カフェインを 25 mg/kg 単回 po 投与したときの組織内分布 (1) 14 組織中放射能濃度 (% 投与 C 放射能 ) 組織投与後 5 分投与後 30 分投与後 1 時間 ( 組織重量 ) * 14 C 放射能カフェイン 14 C 放射能カフェイン 14 C 放射能カフェイン 脳 (0.40 g) 心臓 (0.15 g) 腎臓 (0.47 g) 肝臓 (1.70 g) 肺 (0.23 g) 脾臓 (0.17 g) 睾丸 (0.22 g) 0.14 (0.13) ** 筋肉 (12.9 g) 13.1 (12.5) ** 血漿 (1.46 ml) 赤血球 (0.87 ml) *: 平均重量を示した **: カフェインを含む非酸性画分中 14 C 放射能を示した -: 測定値なし マウスに [ 3 H, 14 C]-カフェインを 25 mg/kg 単回 po 投与したときの組織内分布 (2) 14 組織中放射能濃度 (% 投与 C 放射能 ) 組織投与後 3 時間投与後 8 時間投与後 24 時間 ( 組織重量 ) * 14 C 放射能カフェイン 14 C 放射能カフェイン 14 C 放射能カフェイン 脳 (0.37 g) 心臓 (0.15 g) (0.02) ** 0.02 (0.01) ** 腎臓 (0.47 g) (0.19) ** 肝臓 (1.50 g) (0.44) ** 肺 (0.23 g) (0.03) ** 0.07 (0.01) ** 脾臓 (0.16 g) (0.03) ** 0.05 (0.02) ** 睾丸 (0.25 g) (0.09) ** 0.03 (0.01) ** 筋肉 (12.9 g) 13.4 (13.4) ** 血漿 (1.46 ml) 赤血球 (0.87 ml) *: 平均重量を示した **: カフェインを含む非酸性画分中 14 C 放射能を示した -: 測定値なし 概要文 の表 に転載 マウスに [ 3 H, 14 C]-カフェインを 5 mg/kg 単回 po 投与したときの組織内分布組織中放射能濃度 (% 投与 14 C 放射能 ) 組織投与後 5 分投与後 1 時間投与後 8 時間 ( 組織重量 ) * 14 C 放射能カフェイン 14 C 放射能カフェイン 14 C 放射能カフェイン 脳 (0.37 g) (0.04) ** 心臓 (0.15 g) (0.02) ** 腎臓 (0.47 g) (0.18) ** 肝臓 (1.77 g) (0.76) ** 肺 (0.26 g) (0.03) ** 脾臓 (0.17 g) (0.03) ** 睾丸 (0.24 g) 0.17 (0.14) ** (0.06) ** -9-

36 筋肉 (12.9 g) (2.3) ** 血漿 (1.46 ml) 赤血球 (0.87 ml) *: 平均重量を示した **: カフェインを含む非酸性画分中 14 C 放射能を示した -: 測定値なし 添付資料 参 被験薬物 [1-methyl- 14 C]-カフェイン (48.96 mci/mmol) [2-14 C]-カフェイン (7.70 mci/mmol) 動物種 / 体重 / 動物数 C57B1/6J 系マウス /17~34 g/ 記載なし 性別 / 週齢 雄 / 記載なし 投与形態 生理食塩液に溶解 投与方法 iv 投与 投与量 [1-methyl- 14 C]-カフェイン (48.96 mci/mmol):0.7 mg/kg [2-14 C]-カフェイン (7.70 mci/mmol):11 mg/kg 試料 全身 分析方法 全身オートラジオグラフィー (Ullberg 1954) 1) 1):Ullberg S,Acta Radiol 1954; 118: マウスに [1-methyl- 14 C]-カフェインを 0.7 mg/kg iv 投与したときの全身オートラジオグラム 投与後 1 時間 胸腺 心臓中血液 肝臓 脾臓 Chatter 膵臓 鼻腔上皮唾液腺胃及び胃内容物腸管精嚢 投与後 3 時間 メラニン胸腺 心臓中血液脾臓 腎臓尿管 ハーダー氏腺骨髄肝臓膵臓精嚢陰茎 投与後 24 時間 鼻腔及び口腔上皮骨髄 肺胃腸管脾臓 腎臓 震毛唾液腺胸腺肝臓膵臓副睾丸 -10-

37 概要文 の図 に転載マウスに [2-14 C]- カフェインを 11 mg/kg iv 投与したときの全身オートラジオグラム投与後 1 時間食道肺精嚢 嗅覚器上皮胃精巣 投与後 3 時間 目気管支メラニン腎臓 涙腺肝臓膵臓消化管 投与後 24 時間メラニン 気管食道 口腔上皮 胆嚢 肝臓 メラニン 概要文 の図 に転載 添付資料 参被験薬物カフェイン動物種 / 体重 / 動物数雑種成熟イヌ / 記載なし /8 匹雑種新生児イヌ / 記載なし /17 匹無呼吸によりカフェイン投与を受けていたヒト早産新生児 / 記載なし性別 / 週齢成熟イヌ : 記載なし / 記載なし新生児イヌ : 記載なし / 生後 2 日投与形態水溶液 (10 mg/ml) 投与方法 iv 投与投与量 50 mg/kg 試料各種臓器分析法カフェインは分光光度計を用いて測定 (Axelrod 1953) Axelrod J,et al, J Pharmacol Exp Ther 1953; 107: 無呼吸によりカフェイン投与を受けていたヒト早産新生児から得た死後組織 におけるカフェイン濃度 カフェイン濃度 組織 μg/g (% 組織中含水量 ) 組織水分中濃度 / 血漿水分中濃度の比 新生児 A 新生児 B 新生児 A 新生児 B 血漿 (92)

38 脳脊髄液 (99) 胆汁 nd 1) 21.1 (90) nd 0.5 大脳 nd 19.4 (88) nd 0.5 左心室 84.0 (81) 75.1 (82) 右心室 nd 54.9 (81) nd 1.4 肺 59.0 (83) 24.8 (79) 肝臓 66.1 (78) 26.9 (79) 腎臓 44.1 (82) 26.3 (84) 膵臓 nd 40.0 (75) nd 1.1 脾臓 40.4 (80) 19.6 (80) 回腸 nd 17.7 (70) nd 0.5 大腸 43.5 (70) 25.4 (71) 横隔膜 nd 17.6 (82) nd 0.5 骨格筋 55.3 (80) 19.1 (80) 甲状腺 nd 35.3 (80) nd 0.9 副腎 nd 44.5 (77) nd 1.1 卵巣 nd 30.7 (87) nd 0.7 赤血球 70.0 (89) nd 1.0 nd nd: 測定せず 又は算出せず 新生児イヌ及び成熟イヌにカフェインを 50 mg/kg iv 投与したときのカフェインの 組織水分中濃度 / 血漿水分中濃度比 組織 カフェインの組織水分中濃度 / 血漿水分中濃度比 投与後の時間 3 時間 10 時間 36 時間 成熟イヌ 新生児イヌ 成熟イヌ 新生児イヌ 新生児イヌ 肝臓 1.1±0.0 (4) 1.1±0.0 (5) 0.9±0.1 (4) 1.1±0.1 (6) 0.6±0.0 (6) 脳 0.9±0.1 (2) 0.8±0.0 (5) 0.6±0.1 (4) 0.8±0.1 * (6) 0.5±0.0 (5) 心臓 1.1±0.1 (2) 1.0±0.1 (4) 1.0±0.1 (4) 1.0±0.1 (6) 0.6±0.0 (5) 骨格筋 0.9±0.1 (4) 1.2±0.1 * (5) 0.5±0.2 (4) 1.0±0.1 * (6) 0.8±0.0 (5) 肺 1.0±0.1 (4) 0.8±0.1 (5) 0.9±0.1 (4) 0.9±0.1 (6) 0.6±0.0 (5) 腎臓 1.0±0.0 (4) 1.0±0.1 (5) 0.8±0.1 (4) 0.9±0.1 (6) 0.7±0.0 (5) 脾臓 1.0±0.1 (4) 1.1±0.1 (2) 0.9±0.1 (4) 1.1±0.1 (5) 0.7±0.0 (5) *:P=0.05( それぞれの成熟イヌにおける数値と比較 スチューデントの t 検定 ) 各値は平均値 ±SE ( ) 内の数値は使用したイヌの数 -12-

39 新生児イヌ及び成熟イヌにカフェインを 50 mg/kg 単回 iv 投与したときの組織中カフェイン濃度新生児イヌ成熟イヌカフェイン 50 mg/kg 単回 iv 投与 3 時間 10 時間 3 時間 10 時間 36 時間 投与後の時間 成熟イヌ新生児イヌ ( 生後 2 日 ) *: 各対応する時間の成熟イヌ組織との比較 (P<0.01 スチューデントの t 検定 ) 概要文 の図 に転載 添付資料 参被験薬物カフェイン動物種 / 体重 / 動物数 Wistar 系ラット /250~300 g/ 記載なし性別 / 年齢雌 ( 妊娠 20 日及び非妊娠 )/80~90 日齢給餌餌 (20% タンパク質 6% 脂質 ) 及び水は自由摂取投与形態水溶液投与方法 po 投与投与量 5 及び 25 mg/kg 妊娠 20 日目及び非妊娠ラット試料投与後 5 及び 30 分 及び 24 時間の母獣血漿 羊水 胎盤 胎児血液 胎児肝臓及び胎児腎臓 胎児数 :13±2.7 匹 /1 腹体液及び組織中のカフェイン及び代謝物 (theophylline theobromine paraxanthine) は Klassen 及び Stavric (1983) 及び Pollard (1988) の方法を応用して HPLC 法で測定した HPLC 法分析法カラム :Regis Hi-Chrom reversible HPLC カラム移動相 : 水 - 酢酸 -アセトニトリル-イソプロパノール;91:1:4:4 v/v) 検出 :276 μm 検出感度 :0.05 μmol/l 又は kg 再現性 :>90% -13-

40 妊娠 20 日目の母獣にカフェインを 5 mg/kg 単回 po 投与したときの 母獣及び胎児の体液及び組織中カフェイン及び代謝物濃度推移妊娠 20 日目のラットカフェイン 5 mg/kg po 投与 (a) 母獣血漿 (b) 胎盤 (c) 羊水 (d) 胎児血液 (e) 胎児肝臓 (f) 胎児腎臓 : カフェイン :theophylline :theobromine :paraxanthine 平均値 ±SE ( 母獣 n=4 胎児 n=2~6/ 母獣 1 腹 (a) (e):paraxanthine は未知ピークとの重なりのため表示せず 概要文 の図 に転載 妊娠 20 日目及び非妊娠のラットにカフェインを 5 又は 25 mg/kg 単回 po 投与したときの 体液及び組織中最高カフェイン濃度 体液及び組織 カフェインの最高濃度 (μmol/l 又は kg) 5 mg/kg 25 mg/kg 血漿 非妊娠ラット 20±2 (30) 104±12 (60) 妊娠ラット 20±6 (30) 102±14 (30) 胎盤 妊娠ラット 19±2 (60) 128±17 (30) 羊水 妊娠ラット 21±5 (30) 101±10 (30) 血液 19±4 (180) 100±27 (60) 胎児 肝臓 15±2 (180) 72±10 a (180) 腎臓 15±3 (30) 86±9 a (30) ( ) 内の数値は最高濃度到達時間 ( 分 ) を示す 平均値 ±SE (n=4~6) a):p<0.05 一元配置分散分析( 胎盤 濃度との比較 ) 概要文 の表 に一部を転載 妊娠 20 日目及び非妊娠のラットにカフェインを 5 又は 25 mg/kg 単回 po 投与したときの 体液及び組織中カフェイン及び代謝物の AUC 体液及び組織 AUC (μmol h/l 又は kg) カフェイン Theophylline Theobromine Paraxanthine 5 mg/kg 血漿 非妊娠ラット 133±24 104±25 138±26 24±4 妊娠ラット 139±34 51±8 15±1 nd 胎盤 妊娠ラット 178±27 87±11 51±20 nd 羊水 妊娠ラット 229±49 101±12 112±20 21±4 血液 188±73 45±8 39±9 9±4 胎児 肝臓 132±71 45±32 46±28 2±2 腎臓 109±19 100±9 56±13 6±4-14-

41 25 mg/kg 血漿 非妊娠ラット 764±73 372±39 236±22 160±26 妊娠ラット 1011± ±94 182±37 173±53 胎盤 妊娠ラット 1069± ±18 227±24 84±8 羊水 妊娠ラット 940± ±23 182±21 86±9 血液 456±87 36±1 34±5 30±7 胎児 肝臓 581±79 214±48 137±18 38±3 腎臓 833± ±27 340±81 29±6 平均値 ±SEM (n=4~6) nd: 非検出 添付資料 参被験薬物 [2-14 C]-カフェイン (7.8 Ci/mol) CD-COBS 系ラット /250~300 g/10 匹 (5 匹 / 群 妊娠 12 日目に動物種 / 体重 / 動物数使用 ) 性別 / 年齢雌 / 記載なし食餌 給水自由摂取投与形態記載なし po 投与投与方法単回投与及び 3 時間ごとの 4 分割投与投与量 80 mg/kg ( dpm/ 匹 ) 試料血液 羊水 胎児 尿カフェイン及び代謝物濃度は内部標準物質を用いた HPLC 法で測定した 1 2) 1):Rodriguez F,et al. Therapie, 1981; 36: 659 2):Bonati M,et al. Clin Pharmac Ther 1982; 32: 98 HPLC 条件血液 : 抽出後以下の条件で分析内部標準物質 :1,9-dimethylxanthine カラム : 逆相カラム (Lichrosorb RP-8) 移動相 :formamide-methanol-0.05 M monobasic potassium phosphate (12:18:70 v/v) 検出 :280 nm 分析法流速 :0.6 ml/min 胎児及び羊水 : 胎児ホモジネート (10%w/v 水) 及び羊水を血液と同様に分析尿 : 抽出後以下の条件で分析内部標準物質 :1,9-dimethylxanthine カラム : 逆相カラム移動相 : 0.5 % acetic acid (100) ~ 0.5 % acetic acid-acetonitrile (95:5 v/v) の濃度勾配流速 :1.3 ml/min 検出 : 各代謝物ピークの溶出液を採取し 放射能を液体シン 3) チレーター中で測定 3):Bonati M, et al. Toxic Lett 1980; 7: 1-15-

42 妊娠 12 日目のラットにカフェインを 80 mg/kg po 投与したときのカフェイン及びその代謝物の血液中濃度推移カフェイン妊娠 12 日目のラット単回 po 投与分割 po 投与 (4 分割 /3 時間ごと ) 80 mg/kg 上段図 : 単回 po 投与下段図 : 分割 po 投与 カフェイン : Theophylline: Paraxanthine: Theobromine : -16- 投与後の時間 ( 分 ) 妊娠 12 日目のラットにカフェインを 80 mg/kg po 投与したときのカフェインの最高血液中濃度及び その時の代謝物濃度 カフェイン及びその代謝物の最高血液中濃度 (nmol/ml) 化合物 単回投与 分割投与 180 分 600 分 180 分 600 分 カフェイン 230.0± ± ±4.1** 104.0±7.0 Theophylline 6.8± ± ± ±1.5 Paraxanthine 7.5± ± ± ±2.0 Theobromine 5.6± ± ± ±2.3 平均値 ±SEM (n=5) t test: 単回投与対分割投与 **:P 0.01 妊娠 12 日目のラットにカフェインを 80 mg/kg po 投与後 24 時間におけるカフェイン及び代謝物の血液 羊水及び胎児中濃度 カフェイン 1.1±0.5 Theophylline 3.0±1.3 Paraxanthine 0.59±0.05 単回投与 カフェイン及び代謝物濃度 (nmol/mg 又は ml) 分割投与 血液羊水胎児血液羊水胎児 2.3±0.8 (2.1±0.2) 5.3±1.5 (1.9±0.1) 1.5±0.2 (2.5±0.3) 4.6±1.4 (4.4±0.8) 7.5±1.1 (3.2±0.5) 3.8±0.7 (6.3±0.7) 3.8±0.3 ** 17.0±0.4 ** 22.4± ± ±0.5 Theobromine 1.1± ±2.3 ** (2.1±0.04) (4.0±0.3) 平均値 ±SE (n=5) ( ) 内数値は羊水 / 血液比及び胎児 / 血液比を示す t 検定 : 単回投与対分割投与 *:P 0.05 **:P 0.01 概要文 の表 に一部を転載 4.2±0.4 (1.1±0.02) ** 19.7±0.7 ** (1.2±0.02) ** 22.1±1.5 ** (1.0±0.05) ** 19.2±2.1 ** (0.9±0.02) 3.8±0.3 (1.0±0.06) * 19.4±2.1 ** (1.1±0.1) * 22.1±2.2 ** (1.0±0.06) ** 20.6±3.0 ** (1.0±0.05) ** 妊娠 12 日目のラットにカフェインを 80 mg/kg po 投与したときのカフェイン及び 代謝物の尿中排泄率 カフェイン及び代謝物の尿中排泄率 (% 投与量 ) 単回投与 分割投与 カフェイン 3.8± ±0.5 Theobromine 8.7± ±1.3

43 Theophylline 4.7± ±0.6 Paraxanthine 7.1± ±0.9 1-Methylxanthine 4.9± ±0.7 3-Methylxanthine 0.6± ±0.1 7-Methylxanthine 3.5± ±0.7 1,3,7-Trimethyluric acid 4.8± ±1.0 3,7-Dimethyluric acid 0.5± ±0.1 1,3-Dimethyluric acid 7.0± ±0.8 1,7-Dimethyluric acid 3.4± ±0.8 1-Methyluric acid 0.5± ±0.1 3-Methyluric acid 1.9± ±0.4 7-Methyluric acid 0.5± ±0.1 6-Amino-5-(N-formylmethylamino)1,3-dimethyluracil 3.1± ±1.3 回収率 (%) 54.5± ±7.9 平均値 ±SE (n=5) 添付資料 参被験薬物カフェイン動物種 / 体重 / 動物数 New Zealand White ウサギ授乳ウサギ ( 出産後 17~22 日 )/ 3.92~5.34 kg/10 匹受乳ウサギ ( 幼若ウサギ 生後 19~21 日 )/ 0.180~0.374 kg/10 匹投与形態カフェインを生理食塩液に溶解 (2 mg/ml 投与当日に調製) 投与方法授乳ウサギに耳静脈から iv 投与投与量 5 mg/kg 試料成熟ウサギ血清 : 投与後 及び 8 時間 (n=10) paraxanthine theobromine theophylline 測定は投与後 及び 24 時間乳汁 : 投与後 及び 24 時間 (paraxanthine theobromine theophylline 測定 ) 幼若ウサギ血清 : 投与後 及び 120 時間 (n=10) 被験薬物カフェインタンパク質結合の測血清及び脱脂乳中タンパク質とカフェイン paraxanthine theophylline 定及び theobromine のタンパク質結合は透析法を用いて測定 血清及び乳汁の ph 測定は clinical blood gas analyzer を用いて測定 タンパク質結合は plexiglass cells 中で Spectrapor 2 透析膜を用いて M リン酸緩衝液 (ph 7.2) で透析して測定 血清及び乳汁中カフェイン paraxanthine theobromine theophylline 濃度は HPLC 法 * を用いて測定 HPLC 条件カラム :C18 カラム ( 粒子径 :10 μm mm) 分析法移動相 :tetrahydrofuran:methanol:0.01 M KH 2 PO 4 (1:9:90 ph 3.5) 流速 :1.2 ml/ 分検出 :214 nm 溶出時間 : theobromine;5.2 分 paraxanthine;8.5 分 theophylline;9.4 分 β-hydroxyethyltheophylline;10.9 分 カフェイン ;16.5 分 *:Dorrbecker BR et al, J Chromatogr Biomed Appl 1984; 336:

44 出産後 17~22 日のウサギにカフェイン 5 mg/kg を iv 投与したときの 血清及び脱脂乳中遊離のカフェイン及び代謝物濃度 薬物 n 血清中遊離脱脂乳中遊離形分率 (%) 形分率 (%) 1) 乳汁 / 血清薬物濃度比 カフェイン ± ± ±0.052 paraxanthine ± ± ±0.019 theobromine 4 2) 7 3) 0.920± ± ±0.038 theophylline 4 2) 6 3) 0.384± ± ±0.054 平均値 ±SD 1): 乳汁薬物の AUC/ 血清薬物の AUC 2): 血清中遊離形分率及び脱脂乳中遊離形分率 (n=4) 3): 乳汁 / 血清薬物濃度比 (n=7 6) 概要文 の文中に引用 代謝 添付資料 参被験薬物 動物種 / 体重 / 動物数 性別 / 週齢又は年齢 [8-14 C]-カフェイン ( 比放射能 :1.8 mci/mmol) 又は非標識カフェイン [8-14 C]-theophylline ( 比放射能 : 3.72 mci/mmol) 又は非標識 theophylline SD 系ラット /200~300 g/ 記載なしヒト : 交通事故死の成人記載なし / 成人 /18~41 歳 /8 人死後の新生児 (3 週齢以下 ): 記載なし / /3 人ラット : 雄 / 記載なし成人 : 記載なし / 成人 /18~41 歳新生児 : 記載なし /3 週齢以下 培養遊離肝細胞の調製ラット肝細胞は collagenase perfusion により調製 1) ヒト肝細胞は two-step collagenase perfusion により調製 2) 1):Guguen-Guillouzo C, et al. In:Hepatocytes Isoles et en Culture, p1-12 2):Guguen-Guillouzo C, et al. Cell Biol Int Rep 1982; 6: 細胞への取り込み [8-14 C]-カフェイン又は [8-14 C]-theophylline を 及び 10-3 の濃度で培養遊離肝細胞と 24 時間インキュベート インキュベート終了後 細胞と溶液を分離し それぞれの放射能を測定し インキュベーション混液中総放射能と細胞中放射能の比較によって計算試料インキュベーション終了後のインキュベーション溶液及び細胞分析方法細胞は HEPES 緩衝液 (ph 7.4) で洗浄後 凍結保管し 分析当日に融解して 0.1 M リン酸緩衝液 (ph 7.4) に懸濁 30 秒間超音波処理した インキュベーション溶液及び超音波処理した細胞は ammonium sulfate で飽和後 2 倍量の chloroform-isopropanol(85:15 v/v) 混液で振とう抽出した 2500 rpm で遠心分離し有機溶媒層を除去後 水溶液層を濃縮乾固し 残渣を HPLC 移動相液に溶解 HPLC 法を用いて代謝物を測定した HPLC 条件カラム :Nucleosil C-18( 粒子径 5 μm 25 cm 4.6 mmi.d.) 移動相 : 濃度勾配溶出法溶媒系 A:tetrahydrofuran-acetic acid-acetonitrile- 水 (5:4:15:976 v/v) 溶媒系 B:tetrahydrofuran-acetonitorile-acetic acid- 水 (7.5:150:4:838.5 v/v) 20 分間は溶媒系 A で溶出 その後 30 分間は 30% 溶媒系 B まで直線濃度勾配で溶出 検出 :280 nm(uv) -18-

45 培養遊離肝細胞による Theophylline 及びカフェインの取り込み 細胞源 基質濃度 (M) Theophylline (%) カフェイン (%) ±0.6 (5) 1) 1.1±0.1 (4) ラット ±0.7 (5) 1.3±0.7 (6) ±0.7 (6) 1.8±0.6 (9) ヒト新生児 ±0.8 (5) 3.6±0.2 (5) ±0.9 (10) 4.0±1.0 (11) ±0.5 (6) 2.2±0.6 (8) ヒト成人 ±0.6 (3) 1.7±1.0 (3) ±0.8 (4) 1.3±0.1 (4) 結果は インキュベーション混液中基質濃度に対する細胞中濃度の割合 (%) で示す 平均値 ±SD(n=3~11) 1): 例数 (n) ヒト新生児 ヒト成人 ラット 培養遊離肝細胞による Theophylline 及びカフェインの総合的代謝患者カフェイン Theophylline 性年齢 (No) 基質濃度 (M) % 代謝速度 % 代謝速度 10-3 N3 * N2 * N1 M 1 day NM N A1 F 18 yr A2 M 41 yr A4 F 35 yr A5 M 18 yr A7 M 36 yr A8 F 32 yr NM A4 F 35 yr NM A6 M 34 yr A3 F 32 yr A6 M 34 yr (n=1) ND (n=3) 1.1± ± ± ± (n=4) 5.5± ± ± ±0.2 Results are expressed as the percentage of transformed substrate(%) or as nmole of transformed substrate/10 6 cells/24 hr.values represent the mean of three replicates for each experiment. ND, not determined: NM, not measurable: *, details not available. -19-

46 カフェインを ヒト新生児 ヒト成人及びラット培養肝細胞とインキュベーションしたときの代表的な HPLC クロマトグラム CA: カフェイン TMU:1,3,7-trimethyluric acid TP:theophylline PX:paraxanthine X: 未同定代謝物 TB:theobromine 1,3,7-DAU:6-amino-5-(N-formylmethylamino) -1,3-dimethyluracil (a) 17 の代謝物候補化合物を含む標準溶液 (b) 培養肝細胞なしでカフェインとインキュベートした培養液 (c) ヒト新生児 (N2) 培養肝細胞をカフェインとインキュベートした培養液 (d) ヒト成人 (A2) 培養肝細胞をカフェインとインキュベートした培養液 (e) ヒト成人 (A5) 培養肝細胞をカフェインとインキュベートした培養液 (f) ラット培養肝細胞をカフェインとインキュベートした培養液 カフェインをヒト新生児 ヒト成人及びラット培養肝細胞とインキュベーションしたときの 3 種 dimethylxanthine 代謝物 (theobromine paraxanthine theophylline) の生成比ヒト新生児培養肝細胞ヒト成人培養肝細胞ラット培養肝細胞カフェイン 24 時間インキュベーション TB:theobromine PX:paraxanthine TP:theophylline -20-

47 添付資料 参被験薬物動物種 / 体重 / 動物数 性別 / 週齢投与形態投与方法投与量試料 分析法 [1-methyl- 14 C]-カフェイン SD 系ラット /150~200 g/ 記載なし NMRI 系マウス /20~30 g/ 記載なし HAMC 系チャイニーズハムスター /80~100 g/ 記載なしいずれも雄 / 記載なし水溶液 po 投与 4 mg/kg (7~10 μci) 投与後 48 時間までの呼気 尿 糞投与後 48 時間の血液 各種臓器 組織及びカーカス尿以外の試料は 呼気 (CO 2 ) を除き燃焼法で放射能測定試料を調製し 液体シンチレーションカウンターで測定尿は 2 次元 TLC( 薄層クロマトグラフィー ) 又は HPLC により代謝物を測定 2 次元 TLC 条件 TLC プレート :silica plate(0.25 mm Merck) 展開溶媒 1:chloroform/methanol 4:1(v/v) 展開溶媒 2:chroroform/acetone/butan-1-ol/ 濃アンモニア水 3:3:4:1(v/v) 検出 ( 定性 ):X 線フィルムによるオートラジオグラフィー検出 ( 定量 ):Automatic Linear Analyzer(Berthold) による放射能測定 HPLC 条件カラム :C18 逆相カラム移動相 :8% methanol-0.05% 酢酸 - 水検出 :flow cell detector と multic hannel analyzer を組み合わせて放射能を測定 [1-methyl- 14 C]-カフェインを po 投与したときの呼気中 [ 14 C]-CO 2 の累積排泄率ラット マウス及びハムスター呼気中 [ 14 C]-CO 2 の累積排泄率 [1-methyl- 14 C]- カフェイン po 投与 4 mg/kg 投与後の時間 ( 時間 ) -21-

48 ラット マウス及びハムスターに [1-methyl- 14 C]- カフェインを 4 mg/kg po 投与したときの尿中代謝物の HPLC ラジオクロマトグラムラット マウス及びハムスター [1-methyl- 14 C]- カフェイン 4 mg/kg po 投与 H: ハムスター M: マウス R: ラット ラット マウス及びハムスターにおけるカフェインの代謝経路 -22-

49 動物におけるカフェインの代謝経路 ( 上図より作成 ) 1,3,7-DAU Caffeine 1,3,7-Trimethyluric acid 3,7-DAU 1,3,8-Trimethyl allantoin N-Methylurea N,N'-Dimethylurea Theophylline 1,7-DAU Theobromine 1,3-Dimethyluric acid 1-Methylxanthine Paraxanthine 7-Methylxanthine 3,7-Dimethyluric acid 3-Methylxanthine 1,7-Dimethyluric acid 1-Methyluric acid 7-Methyluric acid 3-Methyluric acid 1,3,7-DAU:6-amino-5-(N-formylmethylamino)-1,3-dimethyluracil 1,7-DAU:6-amino-5-(N-formylmethylamino)-3-methyluracil 3,7-DAU:6-amino-5-(N-formylmethylamino)-1-methyluracil 概要文 中の図 に転載 ラット マウス及びハムスターに [1-methyl- 14 C]-カフェインを 4 mg/kg po 投与したときの 投与後 48 時間の組織中及び投与後 48 時間までの排泄物中の放射能濃度 放射能の回収率 (% 投与放射能量 ) ラット マウス ハムスター 呼気 ([ 14 C]-CO 2 ) 20.6± ± ±1.5 尿 68.2± ± ±4.3 糞 3.8± ± ±1.3 臓器 3.1±0.9 1) 3.3±0.5 2) 2.4±0.2 2) カーカス - 3.6± ±0.3 総回収率 94.0± ± ±6.0 1): 胃 小腸 盲腸及び結腸 2): 心臓 肺 肝臓 腎臓 睾丸 脳 脾臓 胃 小腸 盲腸及び結腸 概要文 中の表 に転載 ラット マウス及びハムスターに [1-methyl- 14 C]-カフェインを 4 mg/kg po 投与したときの 投与後 24 時間までの尿中に排泄された代謝物 代謝物 % 尿中放射能ラットマウスハムスター 極性代謝物 X 1 3.8± ± ±0.5 極性代謝物 X 2 3.2± ± ±0.3 極性代謝物 X 3 0.9± ± ±0.3 1-Methyluric acid 6.5± ± ±0.7 1,3-Dimethyluric acid 5.3± ± ±0.3 1,7-Dimethyluric acid 4.1± ± ±0.5 1,3,7-Trimethyluric acid 9.7± ± ±0.7 1,3,8-Trimethylallantoin 5.4±0.7 < ±0.2 1,7-DAU 1) 3.0± ± ±0.6 1,3,7-DAU 2) 22.6± ± ±0.8 1-Methylxanthine 5.8± ± ±0.9 Teophylline 8.1± ± ±0.2 Paraxanthine 18.2± ± ±2.3 カフェイン 3.1± ± ±0.2 1):6-amino-5-(N-formylmethylamino)-3-methyluracil -23-

50 2):6-amino-5-(N-formylmethylamino)-1,3-dimethyluracil 概要文 中の表 に転載 添付資料 参カフェイン被験薬物 [2-14 C]-カフェイン (7.7 mci/mmol 放射化学的純度:97%<) 動物種 / 体重 / 動物数 New Zealand White ウサギ /3.0~4.0 kg/3 匹性別 / 週齢雄 / 記載なし給餌食餌及び水は自由摂取投与形態生理食塩液に溶解 (0.2 ml/kg) 投与方法 iv 投与投与量 4 mg/kg(35 μci) 試料尿尿中カフェイン及び代謝物の分離定量は HPLC 法を用いて行った HPLC 条件カラム :Nucleosil C18(5 μm mm) 移動相 : 溶媒系 A:10 mm sodium acetate-5 mm tetrabutylammonium hydrogen sulfate( 脱イオン水中 glacial acetic acid で ph 5.5 に調分析法整 ) 溶媒系 B:10 mm sodium acetate-5 mm tetrabutylammonium hydrogene sulfate[ 水 /methanol(50/50) ph 5.5 に調整 ] 溶出 : 濃度勾配法 ( 溶媒系 B:10~60% 40 分間 ) カフェインの溶出(38 分 ) 後 濃度勾配を継続し 溶媒系 B が 100% となるまで溶出 溶出速度 :1.5 ml/ 分検出 : 放射能及び UV 吸収 (273 nm) ウサギに 14 C- カフェインを 4 mg/kg iv 投与したときの尿中代謝物 ( 投与後 24 時間まで ) の HPLC クロマトグラム AAMU:5-Acetylamino-6-amino-3-methyluracil UA/XAN:Uric acid/xanthine 3MU: 3-Methyluric acid 7MX: 7-Methylxanthine 3MX: 3-Methylxanthine 1MX: 1-Methylxanthine 1MU: 1-Methyluric acid 37MU: 3,7-Dimethyluric acid TB: 3,7-Dimethylxanthine (theobromine) 13MU: 1,3-Dimethyluric acid PX: 1,7-Dimethylxanthine (paraxanthine) TH: 1,3-Dimethylxanthine (theophylline) 17MU: 1,7-Methyluric acid 137MU: 1,3,7-Trimethyluric acid CA: カフェイン ウサギに 14 C-カフェインを 4 mg/kg iv 投与したときの尿中代謝物 ( 投与後 24 時間まで ) 代謝物 尿中排泄量 μmol % 尿中回収総代謝物 5-Acetylamino-6-amino-3-methyluracil(AAMU) 2.36± Methyluric acid(3mu) 2.12± Methylxanthine(7MX) 7.55± Methylxanthine(3MX) 1.82± Methylxanthine(1MX) 10.73± Methyluric acid(1mu) 9.25± ,7-Dimethylxanthine (TB theobromine) 1.92±

51 1,3-Dimethyluric acid(13mu) 1.27± ,7-Dimethylxanthine (PX paraxanthine) 6.85± ,3-Dimethylxanthine (TH theophylline) 0.76± ,7-Dimethyluric acid(17mu) 1.85± ,3,7-Trimethyluric acid(137mu) 0.95± カフェイン 0.43± Total 47.87± 回収率 (%) 代謝物 (24 時間尿中 ) 放射能 (24 時間尿中 ) 放射能 ( 投与後 4 日間の尿中 ) *:5-acetylamino-6-amino-3-methyluracil 添付資料 参被験薬物動物種 / 体重 / 動物数性別 / 年齢給餌 CYP 分子種の誘導剤 誘導剤の投与方法 誘導剤の投与量 ミクロソームの調製 インキュベーション条件 分析法 カフェイン SD 系ラット /150~180 g/ 記載なし雄 / 記載なし屠殺前 24 時間絶食 acetone (CYP2E1 誘導剤 ):25% 水溶液 dexamethasone (CYP3A1 誘導剤 ):corn oil に溶解 3-methylcholanthrene (CYP1A1/2 誘導剤 ): corn oil に溶解 phenobarbital (CYP2B1/2 誘導剤 ):corn oil に溶解 acetone:po 投与 dexamethasone:ip 投与 (3 日間 ) 3-methylcholanthrene: ip 投与 (3 日間 ) phenobarbital:ip 投与 (4 日間 ) acetone:5 ml/kg dexamethasone:75 mg/kg/0.5 ml 3-methylcholanthrene:25 mg/kg phenobarbital:80 mg/kg/0.75 ml 各誘導剤を投与したラットの肝臓を採取し Chung (1994) に準じてミクロソームを調製した Chung WG. Toxicol Appl Pharmacol 1994; 127: mg ミクロソームタンパク質 0.1 M potassium phosphate buffer (ph:7.4) 1 mm NADPH 10 mm カフェイン 最終インキュベーション溶液量 :0.5 ml 37 で 1 時間インキュベート カフェイン代謝物の定量は HPLC 法で行った HPLC 条件カラム :Nova-pak C-18 ( mm 4 μm) 移動相 : 溶媒系 A:5% methanol (0.05% 酢酸を含む ) 溶媒系 B:70%ethanol 溶出 : 溶媒系 A で 8 分間溶出後 溶媒系 B (0~30%) 直線的濃度勾配で溶出 その後 30% 溶媒系 B で 18 分間溶出 流速 :0.6 ml/min 検出 :280 nm 各代謝物は合成標品との比較で分析した 種々の誘導剤前処理によるラット肝ミクロソームにおけるチトクローム P450 含量及び Thiobenzamide S-oxidase 活性に対する影響 P450 含量 Thiobenzamide S-oxidase 誘導剤 (nmol/mg ミクロソーム ) (nmol/min/mg ミクロソーム ) 対照 0.56± ±

52 Acetone 0.60± ±0.21 Dexamethasone 0.66± ± Methylcholanthrene 0.92±0.16 * 4.10±0.23 ** Phenobarbital 1.44±0.19 ** 1.72±0.23 *:P<0.05 **:P<0.01 ラット肝ミクロソームによる testosterone 代謝に対する誘導剤処置の影響 Testosterone 代謝物 (nmol/min/ mg ミクロソームタンパク質 ) 対照 AC DEX MC PB 7α- a) 0.96± ± ±0.03 ** 3.56±0.42 ** 0.85±0.23 6β- 5.87± ±1.43 * 10.2±2.67 * 8.04±1.70 * 19.8±1.01 ** 16α- 7.72± ±0.55 ** 0.99±0.25 ** 2.17±0.33 ** 3.87±0.50 ** 16β- 0.05± ± ± ± ±0.20 ** 2α- 2.95± ±0.12 ** 0.25±0.05 ** 0.67±0.10 ** 0.28±0.09 ** 2β- 0.27± ±0.10 * 1.18±0.12 ** 0.61±0.09 * 1.13±0.05 ** Androstendione 1.34± ± ±0.44 * 1.66± ±0.24 Total 平均値 ±SD AC:Acetone DEX:Dexamethasone MC:3-Methylcholanthrene PB:Phenobarbital a):the abbreviation designated the regio- and stereochemistry of hydroxylated testosterone metabolite (i.e. 7α-denotes 7α-hydroxytestosterone) *:P<0.05 **:0.01 ( 対照に対して スチューデントの t 検定 ) ラット肝ミクロソームによるカフェイン代謝に対する誘導剤処置の影響 代謝物 カフェイン代謝物 (pmol/min/mg ミクロソームタンパク質 ) 対照 AC DEX MC PB Theobromine 24±4 32±2 6±2 * 165±30 ** 24±2 Paraxanthine 51±6 59±2 20±3 * 201±30 ** 50±10 Theophylline 57±14 48±1 12±3 * 148±20 ** 48±4 1,3,7-Trimethyluric acid 202±61 343±38 * 343±16 * 623±90 ** 527±80 ** 総計 平均値 ±SD (n=4) *:P<0.05 **:0.01 ( 対照に対して スチューデントの t 検定 ) ラット肝ミクロソームによって触媒されるカフェイン代謝経路及び代謝酵素 添付資料 参被験薬物動物種 / 体重 / 動物数性別 / 年齢給餌誘導剤 カフェイン Wistar 系ラット /230~260 g/ 記載なし雄 / 記載なし記載なし β-naphthoflavone( 主に CYP1A 誘導剤 CYP2C11 阻害剤 ): corn oil に溶解 -26-

53 誘導剤の投与方法 誘導剤の投与量 ミクロソームの調製 インキュベーション条件 分析法 phenobarbital (CYP2B 及び他の CYP 分子種の誘導剤 CYP2C11 阻害剤 ): 水に溶解 pregnenolone 16α-carbonitrile( 主に CYP3A 誘導剤 CYP2C11 阻害剤 ): corn oil に溶解 15% ethanol( 主に CYP2E1 誘導剤 ): 水に溶解対照 : 水及び corn oi β-naphthoflavone:ip 投与 phenobarbital:ip 投与 pregnenolone 16α-carbonitrile:ip 投与 15% ethanol:po 投与 ( 飲料水 ) β-naphthoflavone:100 ml/kg(4 日間 ) phenobarbital:10 mg/kg(6 日間 ) 100 mg/kg(4 日間 ) pregnenolone 16α-carbonitrile: 100 mg/kg(4 日間 ) 15% ethanol:11 g/kg (6 日間 ) 誘導剤最終投与後 16 時間に肝臓を採取し 一般法に準じてミクロソームを調製した 1 mg ミクロソームタンパク質 0.15 M phosphate buffer (ph:7.4) 6 mm MgCl 2 6H 2 O 及び NADPH generating system (1.2 mm NADP 6 mm DL-isocitric acid 1.2 U/mL isocitric dehydrogenase) 最終インキュベーション溶液量 1 ml カフェイン 100 又は 800 μm を添加して反応を開始 37 で 50 分間インキュベーション 反応は 2% ZnSO μl 及び 2M HCl 50 μl を添加して停止 カフェイン代謝物の定量は HPLC 法で行った P450 分子種の活性測定 CYP1A2: カフェインの 8 位水酸化速度で測定 CYP2C6:Daniel (2006) 1) に準じて warfarin の 7 位水酸化速度で測定 CYP2A CYP2B CYP2C11 及びCYP3A2:Haduch (1996) 2) に準じてtestosterone の 7α- 16β- 2α- 2β- 及び 6β- 水酸化活性で測定 カフェイン代謝物の定量はRasmussen (1996) 3 4) に準じてHPLC 法で行った HPLC 条件カラム :Supelcosil LC-18 ( mm 5 μm) 移動相 : 0.01 M acetate buffer(ph 3.5)-methanol (91:9 v/v) 流速 :1.0 ml/min (0~26.5 分 ) 3.0 ml/min (26.5~35 分 ) 検出 :254 nm 各代謝物は合成標品との溶出時間の比較で分析した theobromine (9.7 分 ) paraxanthine (15.8 分 ) theophylline (16.9 分 ) 1,3,7-trimethyluric acid (23.4 分 ) 及びカフェイン (30.5 分 ) 1)Daniel WA, et al. Eur Neuropsychopharmacol 2006; 16: )Haduch A, et al. Eur Neuropsychopharmacol 1996; 16: )Rasmussen BB, et al. J Chromatogr B Biomed App 1996; 676: )Daniel WA, et al. Pol J Pharmacol 2003; 55: ラット肝ミクロソームにおけるカフェイン酸化反応速度に対する β-naphthoflavone 前処理の影響 -27-

54 ラット肝ミクロソームにおけるカフェイン酸化反応速度に対する pregnenolone 16α-carbonitrile 前処理の影響 ラット肝マイクロソームにおけるカフェイン酸化反応速度に対する phenobarbital 前処理の影響 ラット肝マイクロソームにおけるカフェイン酸化反応速度に対する ethanol 前処理の影響 -28-

55 ラット肝臓におけるカフェインの酸化代謝への CYP 分子種の寄与[Kot(2005)*ら] * Kot M,et al. Pharmacol Rep 2005; 57: 283 各種 CYP 誘導剤で前処理したラット肝ミクロソームによる testosterone 水酸化代謝 BNF:β-naphthoflavone PCN pregnenolone 16α -carbonitrile PB-10 phenobarbital (10 mg/kg) PB-100 phenobarbital (100 mg/kg) C2H5OH 15% ethanol 各種 CYP 誘導剤で前処理したラット肝ミクロソームによる warfarin 7-水酸化代謝 BNF:β-naphthoflavone PCN pregnenolone 16α -carbonitrile PB-10 phenobarbital (10 mg/kg) PB-100 phenobarbital (100 mg/kg) C2H5OH 15% ethanol 添付資料 参 被験薬物 動物種/体重/動物数 性別/週齢 カフェイン Wistar 系ラット/ g/6 匹 雄/記載なし -29-

56 肝ミクロソームの調製 In vitro 試験 分析法 6 匹のラットの肝臓をプールし 20 mm Tris/KCl 緩衝液 (ph 7.4) 中でホモジネートし 分画遠心分離して調製 プール肝ミクロソームを使用した インキュベーション混液 : カフェイン ( nmol/ml) 神経遮断薬(0~800 nmol/ml) 肝ミクロソーム (1 mg タンパク質 /ml) リン酸緩衝液(0.1 M ph 7.4) MgCl 2 6H 2 O(6 mm) 及び NADPH generating system[nadp(1.2 mm) DL-isocitric acid(6 mm) 及び isocitric dehydrogenese(1.2 U/mL)] 最終インキュベーション反応液量 0.5 ml 2 分間プレインキュベーション後 NADPH generating system を添加し反応を開始 インキュベート時間 50 分間 反応は 2% ZnSO 4 を 350 μl 及び 2 M HCl を 25 μl 添加し停止 カフェイン及び代謝物は Rasmussen(1996) * による HPLC 法を用いて測定した *: Rasmussen B B, et al. J. Chromatogr. B., 1996; 676: カフェイン代謝に対する phenothiazine 神経遮断薬の影響 カフェイン代謝の阻害 神経遮断薬 Paraxanthine 1) K i [μm] Theobromine 2) K i [μm] Theophylline 3) K i [μm] 1,3,7-trimethyluric acid 4) K i [μm] Chlorpromazine Levomepromazine Thioridazine Perazine ):caffeine-3-N-demethylation 2):caffeine-1-N-demethylation 3):caffeine-7-N-demethylation 4): caffeine C-8-hydroxylation ラット肝ミクロソームにおけるカフェイン代謝に対する levomepromazine の影響 A:3-N-demethylation B:1-N-demethylation C:7-N-demethylation D:8-hydroxylation V= 反応速度 I= 神経遮断薬濃度 -30-

57 ラット肝ミクロソームにおけるカフェイン代謝に対する perazine の影響 A:3-N-demethylation B:1-N-demethylation C:7-N-demethylation D:8-hydroxylation V= 反応速度 I= 神経遮断薬濃度 ラット肝ミクロソームにおけるカフェイン代謝に対する thioridazine の影響 A:3-N-demethylation B:1-N-demethylation C:7-N-demethylation D:8-hydroxylation V= 反応速度 I= 神経遮断薬濃度 -31-

58 ラット肝ミクロソームにおけるカフェイン代謝に対する chlorpromazine の影響 A:3-N-demethylation B:1-N-demethylation C:7-N-demethylation D:8-hydroxylation V= 反応速度 I= 神経遮断薬濃度 添付資料 参被験薬物動物種 / 体重 / 動物数性別 / 週齢給餌肝ミクロソームの調製反応系分析方法 カフェイン SD 系ラット /150~180 g/ 記載なし雄 / 記載なし 24 時間絶食 Chung (1994) の方法に準じて調製した Chung W.G.,et al. Toxicol. Appl Pharmacol 1994; 27: 代表的なインキュベーション条件 0.5 mg ミクロソームタンパク質 0.1 M リン酸緩衝液又は Trizma 緩衝液 (ph 7.4) 1 mm EDTA 及び 1mM NADPH 10 mm カフェインと添加することで反応を開始 反応液の最終容量は 0.5 ml 37 で 1 時間インキュベート 反応は急速氷冷により停止 g で 45 分間遠心分離 (4 ) し除タンパク質 上清を HPLC 分析に供した 阻害剤の影響 SKF525A(1 mm) 及び methimazole(0.25 mm) は カフェイン添加前 20 分に添加し 37 で 20 分間プレインキュベートした 至適 ph の検討 ph 範囲 7.0~8.8 は 0.1 M Trizma 緩衝液を使用 ph 範囲 9.2~9.6 は 0.1 M glycine 緩衝液を使用 カフェイン代謝物は HPLC 法を用いて測定 HPLC 条件カラム :Novapak C-18 カラム ( mm 4 μm) 検出器 :photo diode array detector 移動相溶媒系 A:0.05%acetic acid 含有 5%methanol 溶媒系 B:70%methanol 溶媒系 A と溶媒系 B の直線濃度勾配により溶出溶媒系 A のみで溶出 (8 分間 ) 直線濃度勾配 (4 分間 溶媒系 B 30% まで ) 溶媒系 B(30%) で 18 分間溶出 ] 溶出速度 :0.6 ml/min 検出 :200~300 nm( 定性 ) 280 nm( 定量 ) -32-

59 ラット肝ミクロソームによるカフェイン代謝に対する ph の影響 ph 7.0~8.8: M Trizma 緩衝液中で実施 ph 9.2 及び 9.6: 0.1 M glycine 緩衝液中で実施 PX:paraxanthine TP:theophylline TB:theobromine ph 7.4 におけるラット肝ミクロソームによるカフェイン代謝に対する SKF525A 及び Methimazole による阻害 阻害剤 * pmol 代謝物 /min/mg ミクロソームタンパク質 Theobromine Paraxanthine Theophylline 対照 ( 阻害剤なし ) 16.6 (17%) a 46.7 (47.8%) a 34.0 (35%) a SKF525A 11.3 ( 32%) b 14.9 ( 68%) b 19.7 ( 42%) b Methimazole 5.6 ( 66%) b 24.3 ( 48%) b 10.6 ( 73%) b SKF525A+Methimazole 0.8 ( 95%) b 7.4 ( 84%) b 2.0 ( 94%) b *:2 回測定の平均値 a:3 種の代謝物の生成比 b: 対照に対する阻害率 ph 8.6 におけるラット肝ミクロソームによるカフェイン代謝に対する SKF525A 及び Methimazole による阻害 阻害剤 * pmol 代謝物 /min/mg ミクロソームタンパク質 Theobromine Paraxanthine Theophylline 対照 ( 阻害剤なし ) 22 (21%) a 27 (26%) a 55 (53%) a SKF525A 13.9 ( 37%) b 16.5 ( 39%) b 36.3 ( 34%) b Methimazole 4 ( 82%) b 18.4 ( 32%) b 2.8 ( 95%) b SKF525A+Methimazole 0 ( 100%) b 10.2( 62%) b 0 ( 100%) b *:2 回測定の平均値 a:3 種の代謝物の生成比 b: 対照に対する阻害率 提案された代謝経路 添付資料 参被験薬物 [1-methyl- 14 C]-カフェイン動物種 / 体重 / 動物数ラット / 記載なし / 記載なし性別 / 週齢記載なし / 記載なし In vitro 試験肝臓の切片を調製 ( 厚さ約 0.5 mm) [1-methyl- 14 C]-カフェインと肝切片とのインキュベーションは Warszawski(1981) の方法に準じて実施した 反応終了後インキュベーション混液を choloroform-isopropanol(85:15 v/v) で抽出 抽出物は 代謝物測定のため TLC に供した Warszawski D., et al. Biochem Pharmacol 1981; 30:

60 分析方法 代謝物の分析は 2 次元 TLC[silica gel plates( 厚さ 0.25 mm)] を用いて実施した 2 次元 TLC 条件展開溶媒 1) chloroform:methanol(4:1 v/v) 2) chloroform:acetone:butane-1-ol- 濃アンモニア水 (3:3:4:1 v/v) 検出放射能検出 (Automatic Linear Analyser) ラット肝切片による放射能標識カフェイン代謝物の定量 CA: カフェイン TP:theophylline PX:paraxanthine 1,3,8-TMA: 1,3,8-trimethylallantoin 1,3,7-DAU:6-amino-5-(N-formylmethylamino) -1,3-dimethyluracil ラット肝切片におけるカフェインの代謝経路 CA: カフェイン TP:theophylline PX:paraxanthine 1,3,7-DAU:6-amino-5-(N-formylmethylamino)- 1,3-dimethyluraci TMU: 1,3,7-trimethyluric acid 1,3,8-TMA:1,3,8-trimethylallantoin 添付資料 参被験薬物カフェイン動物種 / 体重 / 動物数 SD 系ラット / 記載なし / 記載なし性別 / 週齢雄 / 及び 120 日齢肝切片の調製断頭後直ちに肝臓を摘出し 氷冷 Krebs-bicarbonate 緩衝液 (ph 7.4) 中に置き McIlwain tissue chopper を用いて厚さ 0.3~0.5 mm の肝切片を作製 In vitro 試験肝切片 (150 mg) は Krebs-bicarbonate 緩衝液 (ph 7.4) 2.7 ml 中でカフェイン (20 μm) と 95% O 2-5% CO 2 下 37 で 2 時間インキュベートした 反応は氷冷することで停止した 反応終了後肝切片は 2000 rpm で遠心分離し除去した 分析方法カフェイン及び代謝物は Berthou(1988)* らの HPLC 法を使用して測定した *:Berthou F., et al. Biochem Pharmacol 1988; 37:

61 ラット肝切片によるカフェイン代謝の生後変化 及び 120 日齢ラットの肝切片 1,3,7-DAU:6-amino-5-(N-formylmethylamino)-1,3-dimethyluracil 概要文 中の図 に転載 新生児 ~ 成熟ラットの肝臓切片におけるカフェインのジメチル代謝物の生成比較 ジメチル代謝物 新生児ラット (1 日齢 ) 幼若 ~ 成熟ラット (7~120 日齢 ) Theobromine 36% (25%) * 50% (40%) * Paraxanthine 30% (21%) * 30% (24%) * Theophyline 33% (23%) * 20% (16%) * *: 総カフェイン代謝物に対する比率 ラット肝臓切片におけるカフェイン代謝活性 日齢 比活性 N- 脱メチル代謝物生成率 (%Dimethylxanthine) (nmol/g 肝臓 / 時間 ) Theobromine Theophylline Paraxanthine ± % (25%) * 33% (23%) * 30% (21%) * ± ) 50% (40%) * 20% (16%) * 30% (24%) * ± ) 50% (35%) * 20% (14%) * 30% (21%) * 1): 上図からの読み取り値 *: 総カフェイン代謝物に対する比率 (% 総カフェイン代謝物 ) 概要文 中の表 に転載 排泄 添付資料 参被験薬物動物種 / 体重 / 動物数性別 / 週齢投与形態投与方法投与量 [1-methyl- 14 C]-カフェイン SD 系ラット /150~200 g/ 記載なし NMRI 系マウス /20~30 g/ 記載なし HAMC 系チャイニーズハムスター /80~100 g/ 記載なしいずれも雄 / 記載なし水溶液 po 投与 4 mg/kg (7~10 μci) -35-

62 試料分析法 投与後 48 時間までの尿 糞及び呼気尿中カフェイン及び代謝物 2 次元 TLC( 薄層クロマトグラフィー ) 又は HPLC により代謝物を測定した 2 次元 TLC 条件 TLC プレート :silica plate(0.25 mm Merck) 展開溶媒 1:chloroform/methanol 4:1(v/v) 展開溶媒 2:chroroform/acetone/butan-1-ol/ 濃アンモニア水 3:3:4:1(v/v) 検出 ( 定性 ):X 線フィルムによるオートラジオグラフィー検出 ( 定量 ): 放射能測定 (Automatic Linear Analyzer Berthold) HPLC 条件カラム :C18 逆相カラム移動相 :8% methanol-0.05% 酢酸 - 水検出 :flow cell detector と multic hannel analyzer を組み合わせて放射能を測定糞中放射能燃焼法で放射能測定試料を調製し 液体シンチレーションカウンターで測定呼気中 [ 14 C]-CO 2 呼気中 [ 14 C]-CO 2 は 12% ethanolamine(methanol) に吸収させ その一部を液体シンチレションカウンターを用いて放射能を測定 [1-methyl- 14 C]-カフェインを po 投与したときの呼気中 [ 14 C]-CO 2 の累積排泄率ラット マウス及びハムスター呼気中 [ 14 C]-CO 2 の累積排泄率 [1-methyl- 14 C]-カフェイン po 投与 4 mg/kg 投与後の時間 ( 時間 ) ラット マウス及びハムスターに [1-methyl- 14 C]-カフェインを 4 mg/kg po 投与後 48 時間の 組織中及び投与後 48 時間までの排泄物中の放射能濃度 放射能の回収率 (% 投与放射能量 ) ラット マウス ハムスター 呼気 ([ 14 C]-CO 2 ) 20.6± ± ±1.5 尿 68.2± ± ±4.3 糞 3.8± ± ±1.3 臓器 3.1±0.9 1) 3.3±0.5 2) 2.4±0.2 2) カーカス - 3.6± ±0.3 総回収率 94.0± ± ±6.0 1): 胃 小腸 盲腸及び結腸 2): 心臓 肺 肝臓 腎臓 睾丸 脳 脾臓 胃 小腸 盲腸及び結腸 概要文 中の表 に転載 -36-

63 添付資料 参被験薬物 [1-methyl- 14 C]-カフェイン動物種 / 体重 / 動物数雑種イヌ ( 生後 2 日 7 日及び 35 日 ) 生後 2 日 /320 及び 465 g/2 匹生後 7 日 / 及び 680 g/3 匹生後 35 日 / 及び 2065 g/3 匹性別 / 年齢雌雄 / 生後 2 日 1 週間 及び 5 週間給餌胃径管による給餌投与形態 [1-methyl- 14 C]-カフェインを非標識カフェインで希釈 (8.92~83.38 μ Ci/mmol) 投与方法 po 投与投与量 50 mg/kg 試料尿 ( 分析に供するまで-20 で保管 ) 分析法尿は減圧下に室温で蒸発乾固し 残渣を chloroform-methanol(9:1 v/v)20 ml 抽出 N 2 気流下 室温で濃縮 silica gel 60F 254 TLC シートに塗布し代謝物を分析した 展開溶媒溶媒系 A:chloroform-ethanol(9:1 v/v) 溶媒系 B:chloroform-acetone-1-buthanol- 濃アンモニア水 (30:30: 40:10 v/v) 溶媒系 C:chloroform:methanol(4:1 v/v) TLC プレートは 0.25~0.5 cm の幅で silica gel をかきとり 水 1 ml 及び triton/toluene scintillation mixture 10 ml を加えて 放射能を測定した 放射能の測定放射能は液体シンチレーションカウンターを用いて測定 計数効率は 70%( 外部標準法 ) 2 7 及び 35 日齢のイヌに [1-methyl- 14 C]- カフェインを 50 mg/kg 単回 po 投与後のカフェイン及び総放射能の尿中累積排泄率 2 7 及び 35 日齢のイヌ [1-methyl- 14 C]- カフェイン po 投与 50 mg/kg -37-

64 2 7 及び 35 日齢のイヌに [1-methyl- 14 C]- カフェイン po 投与後の尿中代謝物の排泄率 2 7 及び 35 日齢のイヌに [1-methyl- 14 C]- カフェイン 50 mg/kg 単回 po 投与後の尿中排泄終了時の代謝物の累積排泄率 ( 上表から一部を抜粋し作製 ) 総排 泄率 Ca 1) 1MU 2) 17MU 3) 1,7- DAU 4) % 投与放射能量 1,3,7- DAU 5) 13MU 6) 138 TMA 7) 137TMU 8 ) PX 9) TP 10) 2 日齢 日齢 日齢 tr. 11) tr 日齢 tr. tr tr ): カフェイン 2):1-methyluric acid 3):1,7-dimethyluric acid 4):6-amino-5-( N-formylmethylamino)-3-methyluracil 5):6-amino-5-( N-formylmethylamino)-1,3 -dimethhyluracil 6):1,3-dimethyluric acid 7):1,3,8-trimethylallantoin 8):1,3,7-trimethyluric acid 9):paraxanthine 10):theophylline 11):trace 尿中排泄終了時間 : 投与後 168 時間 (2 日齢 ) 投与後 101 時間 (7 日齢 ) 投与後 46 時間 (35 日齢 ) 概要文 中の表 に転載 添付資料 参被験薬物カフェイン動物種 / 体重 / 動物数 New Zealand White ウサギ授乳ウサギ ( 出産後 17~22 日 )/ 3.92~5.34 kg/10 匹受乳ウサギ ( 幼若ウサギ 生後 19~21 日 )/ 0.180~0.374 kg/10 匹投与形態カフェインを生理食塩液に溶解 (2 mg/ml 投与当日に調製) 投与方法授乳ウサギに耳静脈から iv 投与 -38-

65 投与量試料 分析法 出産後 17~22 日のウサギカフェイン iv 投与 5 mg/kg : 血清中濃度 : 乳汁中濃度 a: カフェイン及び paraxanthine c:theobromine 及び theophylline 5 mg/kg 授乳ウサギ血清 : 投与後 及び 8 時間 (n=10) paraxanthine theobromine theophylline 測定は投与後 及び 24 時間乳汁 : 投与後 及び 24 時間 (paraxanthine theobromine theophylline 測定 ) 幼若ウサギ血清 : 投与後 及び 120 時間 (n=10) 血清及び乳汁の ph 測定は clinical blood gas analyzer を用いて測定 タンパク質結合は plexiglass cells 中で Spectrapor 2 透析膜を用いて M リン酸緩衝液 (ph 7.2) で透析して測定 血清及び乳汁中カフェイン paraxanthine theobromine theophylline 濃度は HPLC 法 * を用いて測定 HPLC 条件カラム :C18 カラム ( 粒子径 :10 μm mm) 移動相 :tetrahydrofuran-methanol-0.01 M KH 2 PO 4 (1:9:90 ph 3.5) 流速 :1.2 ml/ 分検出 :214 nm 溶出時間 : theobromine;5.2 分 paraxanthine;8.5 分 theophylline;9.4 分 β-hydroxyethyltheophylline;10.9 分 カフェイン ;16.5 分 *:Dorrbecker BR et al, J Chromatogr Biomed Appl 1984; 336: 血清及び乳汁中カフェイン及び代謝物濃度 カフェイン ( ) 濃度 paraxanthine( ) 濃度 theobromine( ) 濃度 theophylline( ) 濃度 概要文 の図 に転載 薬物動態的薬物相互作用 添付資料 参 被験薬物 カフェイン 動物種 / 体重 / 動物数 ラット /150~190 g/20 匹 (5 匹 / 群 ) 性別 / 週齢 雄 / 記載なし 給水 カフェイン含有水 投与形態 給水中に溶解 ( カフェイン含有量は 1~5 日目 : 及び 1.0% 6~ 14 日目 : 及び 0.3%) 投与方法 po 投与 (2 週間給水投与 ) 投与量 1 1~5 日目 :0.1% 0.5% 及び 1.0% カフェイン含量の飲料水 2 6~14 日目 :0.2% 及び 0.3% カフェイン含量の飲料水 試料 肝ミクロソーム 1) 1)Ioannides C, et al, J Pharm Pharmacol 1975; 68: 分析法 ethoxyresorufin O-deethylase 2) pentoxyresorufin O-depentylase 3) -39-

66 p-nitrophenol hydroxylase 4) erythromycin N-demethylase 5) lauric acid hydroxylase 6) 総チトクローム P450 7) 及びミクロソームタンパク質量 8) を測定可溶化ミクロソーム ( タンパク質 ) を SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後イムノブロットで CYP 分子種を分析 9) 2)Burke MD, et al, Drug Metab Dispos 1974; 2: )Luber RA, et al, Arch Biochem Biophys 1985; 238: )Koop DR, et al, Drug Metab Rev 1989; 20: )Wrighton SA, et al, Biochemistry 1985; 24: )Parker GL, et al, Biochemistry, Biophysics and Pegulation of Cytochrome P )Omura T, et al, J Biol Chem 1964; 239: )Lowry OH, et al, J Biol Chem 1951; 193: )Towbin H, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1979; 76: ラットにおける肝チトクローム P450 依存性薬物代謝酵素活性へのカフェイン投与の影響 酵素活性 投与カフェイン濃度 (% w/v) Ethoxyresorufin O-deethylase 1) 100±15 674±150 *** 1101±176 *** 1170±525 ** Pentoxyresorufin O-depentylase 1) 44±10 203±85 * 271±94 ** 268±146 * p-nitrophenol hydroxylase 2) 1.20± ± ± ±0.08 Erythromycin N-demethylase 2) 3.50± ± ± ±0.20 Lauric acid hydroxylase 2) 1.57± ± ± ±0.43 総チトクローム P450 (nmol/mg protein) 0.62± ± ± ±0.09 ミクロソームタンパク質量 (mg/g 肝臓 ) 20±1 22±3 27±3 ** 23±4 平均値 ±SD (n=5) 1):pmol/min/mg protein 2):nmol/min/mg protein *:<0.05 **:P<0.01 ***:P<0.001( 対 カフェイン濃度 0% スチューデントの t 検定 ) 概要文 中の表 に転載 カフェイン投与によるラット肝 CYP1A アポタンパク質の誘導ヒツジ抗 CYP1A1 抗体 C: 対照 F1:0.1% カフェイン F2:0.2% カフェイン F3:0.3% カフェイン Ar:Aroclor 1254 誘導ミクロソーム ウサギ抗 CYP2B 抗体 カフェイン投与のラット肝 CYP2B アポタンパク質レベル C: 対照 F1:0.1% カフェイン F2:0.2% カフェイン F3:0.3% カフェイン PB:phenobarbital 誘導ミクロソーム -40-

67 カフェイン投与によるラット肝 CYP2E1 及び CYP3A アポタンパク質への影響 A: ヒツジ抗 CYP2E1 抗体 B: ウサギ抗 CYP3A1 抗体 C: 対照 F1:0.1% カフェイン F2:0.2% カフェイン F3:0.3% カフェイン I:isoniazid 処理ミクロソーム D:dexamethasone 処理ミクロソーム 添付資料 参被験薬物カフェイン動物種 / 体重 / 動物数 Wistar 系ラット /200~220 g/8 匹 (1 群 ) 性別 / 週齢雄 / 記載なし給水食餌及び給水は自由摂取投与形態 0.9% 食塩水に溶解投与方法 po 投与投与量 150 mg/kg/day (9 am 及び 4 pm の 2 回に分けて投与 ) 3 日間試料肝ミクロソーム総 P450 量は Omura(1964) 1) の方法を用いて測定 7-methoxyresorufin O-demethylase 7-ethoxyresorufin O-deethylase 7-pentoxyresorufin O-depenthylase 7-benzyloxyresorufin O-debenzylase は Burke(1994) 2) の方法 6-OH-chlorzoxazone は分析法 Peter(1990) 3) の方法に 及び Nifedipine oxidation は Kerlann(1992) 4) の方法に それぞれ準じて測定した 1)Omura T, et al, J Biol Chem 1964; 239: )Burke MD, et al. Biochem Pharmacol 1994; 48: )Peter R, et al. Chem Res Toxicol 1990; 3: )Kerlann V, et al. Biochem Pharmacol 1992; 44: 対照群及びカフェイン処理ラットの肝ミクロソームにおける代謝酵素活性 酵素活性 (pmol/min/mg タンパク質 ) 1) 対照群 2) カフェイン処理群 総 P450 (n mol/mg タンパク質 ) 1.33± ± methoxyresorufin O-demethylase 253± ±827 7-ethoxyresorufin O-deethylase 697± ± pentoxyresorufin O-depenthylase 99± ±200 7-benzyloxyresorufin O-debenzylase 282± ± OH-chlorzoxazone 1890± ±384 Nifedipine oxidation 7210± ±1470 平均値 ±SD 1):n=6 2):n=8 対照群及びカフェイン処理ラットの肝ミクロソーム画分におけるカフェイン代謝 代謝物生成速度 (pmol/min/mg タンパク質 ) 1) 対照群 2) カフェイン処理群 N-1 脱メチル化 (theobromine) 47±10 116±14 N-3 脱メチル化 (paraxanthine) 41±8 93±12 N-7 脱メチル化 (theophylline) 67±12 121±18 C-8 酸化 (1,3,7-trimethyl urate) 531± ±115 総代謝活性 680± ±