Non-protein-coding RNAs (ncRNAs)

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えつまのえ
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1 RITSUMEIKAN 1 立命館大学新技術説明会 7 インターフェロン -α を制御する分子医薬の開発立命館大学薬学部薬学科教授木村富紀

2 RITSUMEIKAN 2 従来技術核酸を用いた遺伝子発現の制御方法 : リボザイム法 RNA 干渉法アンチセンス DNA オリゴヌクレオチド法デコイ核酸法並びに RNA アプタマー法があるこれらの方法は発現の抑制 ( 低下 ) のみを可能にする

3 RITSUMEIKAN 3 新技術の特徴内在性のアンチセンス RNA を用いるわれわれの制御方法は SODN により IFNA1 遺伝子の発現を抑制できるだけでなく ASORN の使用によりその発現の増強を可能にするすなわちこれまで不可能であった双方向性の遺伝子の発現制御が可能となる点で独創的であり従来法にない新規性並びに優位性を有する

RITSUMEIKAN 4 ゲノムからの転写産物の大部分はタンパク質をコードしない非コード

consortium, 03 Protein-coding genes Rest

4 RITSUMEIKAN 4 ゲノムからの転写産物の大部分はタンパク質をコードしない非コード RNA であるヒトゲノム (ca 3 Gb) 3% (20,687 遺伝子 ) ヒトトランスクリプトーム ENCODE project Consortium (2012) ( 制御性, 非コードRNA) 90%< Human genome sequencing consortium, 03 Protein-coding genes Rest Protein-coding genes Rest Transcripts Rest Transcripts Rest

5 内因性の遺伝子転写産物はタンパク質非コード性である Messenger RNA (mrna) Protein Gene Exon 1 Exon 7 AAAAA Antisense transcript Natural antisense transcript (NAT) = AS( アンチセンス ) RNA: ヒトを含む多数の哺乳類遺伝子から転写される RITSUMEIKAN 5

6 ヒト細胞におけるアンチセンス鎖の転写頻度 Classification of genes by the asymmetric strand-specific analysis of gene expression in PBMC All genes Coding genes Noncoding genes S genes % AS genes 2.50 % SAS genes 15.9 % S genes % AS genes SAS genes 2.50 % 16.1% S genes % AS genes 1.80 % SAS genes 2.7 % 殆どのアンチセンス転写産物の機能は解明されていない Yiping et al., Science, 322: 1855, 2008 RITSUMEIKAN 6

7 何故インターフェロン -α1 (IFNA1) 遺伝子に着目したか IFN-α mrna AUG 208 BSL UAA AREs 5 An SL1 SL Nuclear export of IFN-α1 mrna BSL SL2 IFN-α mrna IFN-α mrna ΔSL2 SL IFN-α mrna ΔSL1 IFN-α mrna ΔBSL RITSUMEIKAN 7 CSS Kimura et al., J.Cell Sci., 2004 Kimura et al., Med.Mol.Morp.,2010 Matsui, Kimura et al., Hepatology, 2008

8 ヒト Interferon-α1 antisense RNA (IFN-α1 AS) の同定 SeV-infected Namalwa cells Total cellular RNA IFNA1 5 UTR 1 68 CDS ARE * motifs Polyadenylation site 3 UTR +188 Strand-specific RT-PCR PCR1: PCR2: PCR3: PCR4: IFN-α1 AS PCR5: RT primer: PCR: IFN-α1 AS RT-minus IFN-α1 AS はポリ A 鎖を有するが, タンパク質をコードしない (tblastx). RITSUMEIKAN 8

9 センスオリゴヌクレオチド (seodns) による IFN-α1 AS 発現の抑制 S4 IFN-α1 mrna IFN-α1 AS AAA S3 S2 Sense ODN RNase H による IFN-α1 AS 発現の抑制 Nc2 S1 Time after transfection S1 S2 S3 S4 Nc1 Nc2 hr IFN-α1 AS Nc1 18S rrna RT-minus RITSUMEIKAN 9

10 seodn と sirna との発現抑制効果の比較 inos mrna (%) ( ) S4 Scr4 sie26 sie27 siscr Sense ODN sirna S4, sense oligonucleotide (ODN); Scr4, a scrambled control of S4; sie26 and sie27, sirna; and siscr, a scramble control of sie27. センスオリゴと sirna は同程度に inos mrna の発現を抑制する (Nishizawa et al., IBA news letter, 2009) 10 RITSUMEIKAN 10

11 IFN-α1 AS 発現抑制が同 mrna 発現に及ぼす効果 IFN-α mrna (fold) Time after SeV infection (hr) hr 0.25 KD(-)/18S KD(+)/18S 5.1hr KD(-)/mRNA KD(+)/mRNA Actinomycin D treatment (hr) T 1/2 of IFN-α1 mrna (<80% ) IFN-α1 mrna 発現レベルの低下 RITSUMEIKAN 11

IFN-α concentrations (pg/ml) RTminus Time after SeV infection (hr)

12 AHCC は IFN-α1 AS 発現を抑制し同 mrna/ タンパク質の発現低下をもたらす Time after infection AHCC (-) AHCC (+) hr IFN-α1 AS IFN-α1 mrna 18S rrna IFN-α concentrations (pg/ml) RTminus Time after SeV infection (hr) Matsui et al., JPEN.,2007 Matsui et al., Eur. Surg. Res.,2011 RITSUMEIKAN 12

13 IFN-α1 AS の過剰発現が同 mrna の発現に及ぼす効果 CMV pro 876 IFNA1 ATG 1.4 Control AS over-expression Time after inf. IFN-α1 AS 1.2 IFN-α mrna (fold) hr Actinomycin D treatment (hr) Over-expression(+)/ 18S Control/ 18S 8.1 hr Over-expression(+)/ mrna Control/ mrna T 1/2 of IFN-α1 mrna (290% ) IFN-α1 mrna 発現レベルの増大 RITSUMEIKAN 13

14 mrna を安定化する IFN-α1 AS 機能ドメインの決定 Overexpression of truncated IFN-α1 AS mutants Cont AREs 5 3 UAA Cont IFN-α1 AS DS AUG 5 UTRR SL2 CSS BSL Relative IFN- 1 mrna expression (fold) DS Relative IFN-α1 mrna expression (fold) IFN-α1 AS BSLR ドメインが IFN-α1 mrna の安定性制御のための中心領域である RITSUMEIKAN 14

15 25 塩基長の BSLR 塩基配列からなるアンチセンスリボオリゴヌクレオチド (asorn) は全長の AS RNA と同程度に IFN-α1 mrna の発現量を増加する IFN- 1 mrna AAA asorn (corresponding to BSLR) asorn ncorn IFN-α1 AS (fold) IFN-α1 AS IFN-α mrna (fold) IFN-α1 mrna Time after SeV infectin (hr) fold increase asorn ncorn mock RITSUMEIKAN 15

16 asorn は細胞質において IFN-α1mRNA を安定化する 2.5 IFN-α1 AS 2.5 IFN-α1 mrna Relative IFN-α1 AS expression (fold) Relative IFN-α1 mrna expression (fold) total nucl 0 0 cytoplasmic RITSUMEIKAN 16

17 RITSUMEIKAN 17 想定される用途アンチセンスリボオリゴヌクレオチド現行 INF 製剤では適応がなく又抗ウイルス薬が存在しない呼吸器ウィルス感染症の治療 : 1. コロナウイルスパラインフルエンザウイルスや RSV による乳幼児冬期感冒 2. ライノウイルスやコロナウイルス等による風邪症候群等 3. 抗ノイラミニダーゼ阻害薬抵抗性のインフルエンザウイルスによるインフルエンザセンスリボオリゴヌクレオチド IFN-a の過剰産生に起因する自己免疫疾患 (SLE 皮膚筋炎等 )

18 POC 実験 :ASORN 効果の生体内における検証モルモットマウス機能性の Mx 遺伝子を持つので IFN-a 応答を遺伝子レベルで検討できるインフルエンザに罹患しても死亡せず感染を水平伝播するため実験結果をヒトに外挿可能 Balb/c や C57BL/6 等のマウスは IFN-a 刺激応答遺伝子の主体となる Mx 遺伝子が変異しているインフルエンザウイルスに感染すると死ぬ RITSUMEIKAN 18

19 ヒトインフルエンザ A 型ウイルス * 感染モルモット気道における IFN-α1 候補遺伝子 mrna/as の発現候補遺伝子 1 候補遺伝子 2 候補遺伝子 3 Relative RNA expression (fold) Days after virus inoculation mrna AS *Influenza A virus:pr/8/32 (E) H1N1 候補遺伝子 1/2 においてウイルス接種後に mrna/as の発現誘導とその消退が観察された RITSUMEIKAN 19

20 RITSUMEIKAN 20 実用化に向けた課題 POC 実験 :ASORN 効果の生体内における検証インフルエンザウイルス感染動物モデルの構築 1. モルモット IFNA1 遺伝子が決定済み (AB671739) 2. モルモットIFN-α1 AS RNAの発現確認 ( 気道組織 ) 3. モルモットIFN-α1 ASORNの効果判定 << 検討中 >> DDSの開発

21 IFN-α1 AS は BSL 領域において mir-1270 の結合と拮抗することにより IFN-α1 mrna を安定化する (BiBiServ RNAhybrid) RITSUMEIKAN 21

22 RITSUMEIKAN 22 企業への期待モルモット感染実験系を用いてIFN-α1 AS のmRNA 発現制御効果を生体中で検証する研究に対し共同実験を行える企業の参加を希望します

23 RITSUMEIKAN 23 本技術に関する知的財産権発明の名称 : インターフェロン - モジュレーター出願番号 : 特願出願人発明者 : 学校法人立命館学校法人関西医科大学株式会社アミノアップ化学 : 木村富紀西澤幹雄蒋時文西川正雄発表論文 : Kimura et al., CMLS in press (DOI _s x)

24 RITSUMEIKAN 24 お問い合わせ先立命館大学研究部リサーチオフィス (BKC) 産学官連携コーディネーター松田文雄 TEL : FAX : bma22013@se.ritsumei.ac.jp

論文題目　　腸管分化に関わるmiRNAの探索とその発現制御解析

論文題目　　腸管分化に関わるmiRNAの探索とその発現制御解析論文題目腸管分化に関わる microrna の探索とその発現制御解析氏名日野公洋 1. 序論 microrna(mirna) とは細胞内在性の 21 塩基程度の機能性 RNA のことであり部分的相補的な塩基認識を介して標的 RNA の翻訳抑制や不安定化を引き起こすことが知られている mirna は細胞分化や増殖ガン化やアポトーシスなどに関与していることが報告されておりこれら以外にも様々な細胞諸現象に関与していると考えられている