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1 PCR PCR VLUME 3 N0. 1 Index QPCR 2-Step QRT-PCR 1-Step QRT-PCR RN SideStep II T/U Easy- ne-tube RT-PCR System new new new new PCRHigh-Fidelity PCRSpecialty PCR PCRRoutine PCR Interview FQ bsolutely !!

2 QPCR & QRT-PCR Enzymes & Instruments QPCR2-Step QRT-PCR Problem PCR 2-stepPCRQRT-PCR RNcDN Solution ffinityscript TM QPCR cdn Synthesis Kit 2-stepQRT-PCR ngTotal RN 25 QRT-PCR ffinityscript TM QPCR cdn Synthesis Kit ffinityscript TM Multi Temperature Reverse Transcriptase cdn2-step PCRQRT-PCR MMLV 3755 cdn Strategies Vol.2 No.4 P1 GC RN cdn 2- steppcrqrt-pcr 1 ffinityscript TM QPCR cdn Synthesis Kit kb Ct 1 RNng NTC No Ct No Ct No Ct 1 S.D ffinityscript TM QPCR cdn Synthesis Kit cdn GC5'- 3'- ffinityscript TM QPCR cdn Synthesis Kit oligo-dt 2-stepQRT-PCRcDN cdnqpcr ffinityscript TM QPCR cdn Synthesis Kit Brilliant QPCRBrilliant II QRT-PCR, ffinityscript TM 2-Step Master Mix: #600827)SYBR GreenBrilliant SYBR Green QRT-PCR, ffinityscript TM Two-Step Master Mix: # RN QRT-PCR SideStep TM II P3 #600585QRT-PCR lien QRT-PCR Inhibitor lert# Ct (drn) ffinityscript QPCR cdn Synthesis Kit Company B Company Q Company I Initial Quantity (ng) 1 2-step QRT-PCR ffinityscript QPCR cdn Synthesis Kit ffinityscript TM Multi Temperature Reverse Transcriptase # ffinityscript TM QPCR cdn Synthesis Kit ,800 Brilliant SYBR Green QRT-PCR, ,800 ffinityscript TM Two-Step Master Mix Brilliant II QRT-PCR, ffinityscript TM ,400 Two-Step Master Mix Strategies Vol.3 No.1 p1

3 QPCR & QRT-PCR Enzymes & Instruments 1-Step QRT-PCR Problem RT-PCR Solution Brilliant IIBrilliant II CoreBrilliant II SYBR Green QRT-PCR 1-Step 1-Step QRT-PCR 1-Step QRT-PCR 1- Step QRT-PCR Taq Brilliant PCR Brilliant II Ct1 Ct (dr) Company, RSq: Company, Y = *LG(X) , Eff. = 90.5% 33 Company I, RSq: Company I, Y = *LG(X) , Eff. = 97.4% Company Q, RSq: Company Q, Y = *LG(X) , Eff. = 95.2% 28 Brilliant II, RSq: Stratagene, Y = *LG(X) , Eff. = 100.2% Initial Quantity (ng) 1 Brilliant II Brilliant II Brilliant II QRT-PCR Master Mix Kit, 1-Step Brilliant II QRT-PCR Core Reagent Kit, 1-Step RN QRT-PCR SideStep TM II SYBR Green Brilliant II SYBR Green QRT-PCR Master Mix Kit, 1-Step lien QRT-PCR Inhibitor lert 1-Step QRT-PCR Taq Brilliant II1- Step QRT-PCR MMLV 1-Step QRT- PCR 5030 GC Step QRT-PCR # Brilliant II QRT-PCR Master Mix, 1-Step ,800 Brilliant II QRT-PCR Master Mix, 1-Step(10-pack) 4, ,600 Brilliant II QRT-PCR Core Kit, 1-Step ,600 Brilliant II QRT-PCR Core Kit, 1-Step (10-pack) 4, ,400 SYBR Green Brilliant II SYBR Green QRT-PCR Master Mix, 1-Step ,400 Brilliant II SYBR Green QRT-PCR Master Mix, 4, ,000 1-Step (10-pack) Strategies Vol.3 No.1 p2

4 Nucleic cid Sample Preparation RNSideStep TM II Problem PCRcDN Solution SideStep TM RNQRT-PCR RN SideStep TM II DNase QRT-PCR SideStep TM II SideStep TM Lysis and Stabilization Buffer Quantos TM QPCR Normalization Primer SetsDNase DNase SideStep TM Lysis and Stabilization Buffer RN RN PCR PCRDN RN Quantos TM QPCR Normalization Primer Sets DNnon-coding region 3 DNase RNDN DN QPCR SideStep TM QRT-PCR DN DNase SideStep TM SideStep TM II SideStep TM II Cell Lysis nalysis Kit SideStep TM Lysis and Stabilization Buffer Quantos TM QPCR Normalization Primer Sets DNaseDNase SideStep TM II SideStep TM II Cell Lysis nalysis Kit# SideStep TM II QPCR cdn Synthesis Kit #400908PCR ffinityscript TM QPCR cdn Synthesis Kit# kb cdn252-step RT-PCR SideStep TM II QRT-PCR Master Mix, 1-step #400917Brilliant II QRT-PCR Master Mix Kit, 1-step# stepRT-PCR SideStep TM II QRT-PCR Master Mix Kit, 2- step#400918brilliant II QRT-PCR, ffinityscript TM Two-Step Master Mix# stepRT-PCR SideStep TM II SYBR Green QRT-PCR Master Mix Kit, 2-step# SYBR Green IBrilliant SYBR Green QRT-PCR, ffinityscript TM Two-Step Master Mix# stepRT-PCR SideStep TM Quantos TM QPCR Normalization Primer SetsDNaseDNase SideStep TM Lysis and Stabilization Buffer, 10ml#400900RT-PCR Total RNDN SideStep TM mrn Enrichment Kit # bsolutely RN mrn Purification Kit# mRN RT-PCR RN Brilliant SYBR Green SideStep TM QPCR Master Mix#400904SYBR Green I Brilliant QPCR Master Mix #600548# PCR # SideStep TM II Cell Lysis nalysis Kit ,400 SideStep TM II QPCR cdn Synthesis Kit ,600 SideStep TM II QRT-PCR Master Mix Kit, 1-Step ,200 SideStep TM II QRT-PCR Master Mix Kit, 2-Step ,200 SideStep TM II SYBR Green QRT-PCR Master Mix Kit, 2-Step ,200 SideStep TM Lysis and Stabilization Buffer 10 ml ,400 SideStep TM mrn Enrichment Kit ,000 Brilliant SYBR Green SideStep TM QPCR Master Mix ,600 Strategies Vol.3 No.1 p3

5 PCR Enzymes & Instruments T/UEasy- ne-tube RT-PCR System Problem RT-PCRT/UPCR 3'--d TaqPfu PCR3'- -d Solution Easy- ne-tube RT-PCR System PfuTurbo Taq 3'--dne- TubeRT-PCRPCRStrataClone TM PCR Cloning KitT-/U-PCR T/U 2 Easy- ne- Tube RT-PCR SystemEasy- High- Fidelity PCR Cloning Enzymene- TubeRT-PCREasy- PCR T/UDN PCR StrataClone TM PCR Cloning KitT-/U- PCR 1 Easy- Taq DN PCR3'-d Taq 3'5' Pfu PfuTurbo PCR PCR PCR-dPCR PCR DN I StrataClone TM PCR Cloning Kit Easy- rchaemaxx Polymerase- Enhancing Factor 10200ngTotal RN 0.110ngpoly()+ RN 0.16kb 2 MMLVRN 45301kb 15 GC 48 4kb42 ne-tube Easy- ne-tube RT-PCR System PCR RNase M loxp PCRStrataClone Vector Mix 5 Topoisomerase I puc ori P lac lac Z' MCS PCR Product U* U* MCS lac Z' ampicillin loxp 2 Easy- ne-tube RT-PCR System 100ngRN 1: 514bp Mouse -actin2: 1.8kb Human Dystrophin3: 4.1kb Mouse Complement4: 5.9kb Human Dystrophin Topoisomerase I 1 Easy- ne-tube RT-PCR System PCRT/U Easy- # Easy- ne-tube RT-PCR System ,600 Easy- High-Fidelity PCR Cloning Enzyme 100U , U ,400 1,000U ,000 Easy- High-Fidelity PCR Master Mix , ,000 StrataClone TM PCR Cloning Kit ,000 Strategies Vol.3 No.1 p4

6 PCR Enzymes & Instruments PCRHigh-Fidelity Problem PCR Solution Pfu Pfu PCR PfuUltra TM II Fusion HS DN Polymerase PfuUltra TM High-Fidelity DN Polymerase PfuTurbo DN Polymerase PfuTurbo Cx Hotstart DN Polymeras Pfu DN Polymerase, Cloned Pfu DN Polymerase, Native Herculase II Fusion DN Polymerase Easy- High-Fidelity PCR Cloning Enzyme * DN Taq 20X 18X 6X 6X 6X 6X 6X 6X 19Kb 19Kb 17Kb 17Kb 19Kb 19Kb 10Kb 10Kb 12Kb 12Kb 5Kb 5Kb 3 / -d -d rchaemaxx D** PCR 100U 500U 100U 500U 100U 500U 100 1,000U 5,000U 1,000U 5,000U 1,000U 5,000U PCR GC Pfu Pyrococcus furiosus High-FidelityDN 100 Pfu DN95 195% PCR PfuPCR 5'3' DN3' 5' Exonuclease PCR 1991Native Pfu DN Polymerase ClonePfu DN Polymerase 1998 rchaemaxx PfuTurbo 2002PfuTurbo 3 PfuUltra TM 2006 PfuUltra TM DN 1kb15PCR PfuUltra TM IIDN PfuTurbo Herculase II PCR PCR PCR PCR laclac I PCRlac I lac Z lac I Taq DN 1 PCR Cline, J., Braman, J.C. and Hogrefe, H.H. (1996), Nucleic cids Res. 24: PCR rchaemaxx rchaemaxx Factor Pyrococcus furiosus PCR PCR dctpdutp DNdUTP Pfu DN rchaemaxx FactordUTPdUMP DNdUTP PCR rchaemaxx Factor PCR 1 Strategies Vol.3 No.1 p5

7 PCR Enzymes & Instruments PCRSpecialty Problem PCR PCRTaq DN PCRPCR Solution 20kb PCR PCR Herculase DN Polymerase EXL DN Polymerase Yieldce DN Polymerase PicoMaxx High Fidelity PCR System * DN Taq 37Kb 4X 48Kb 37Kb 4X 50Kb 4X 10Kb 2X 10Kb 3 / -d -d -d -d -d rchaemaxx D** PCR 100U 500U 100U 500U 100U 500U 100 1,000U 5,000U 1,000U 5,000U 1,000U 5,000U *** *** PCR GC BlendPCR DN PolPol Thermus aquaticus Taq Pyrococcus furiosus Pfu Pol 3'5' Exonuclease Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT)PCR3'- -d TdT 3'- 2 Blend PCR BlendPCR rchaemaxx Polymerase-Enhancing FactorP5 BlendTaq DN 3'- -d GC Herculase DN PolymeraseGC PCR Taq2000 TM DN Polymerase rchaemaxx Polymerase- Enhancing Factor PfuTurbo DN Polymerase GC 80% DN37kb48kb Taq DN4 DMS GC PCR DMS Perfect Match PCR Enhancer P9 2x EXL DN Polymerase PCR50kb Taq2000 TM DN Polymerase PfuTurbo DN PolymeraseTaq DN 4 DMS Yieldce DN PolymeraseTaq2000 TM DN PolymerasePfuTurbo DN Polymerase PCR Taq4 PicoMaxx High-Fidelity PCR System Taq2000 TM DN Polymerase PfuTurbo DN Polymerase Taq2 2x Strategies Vol.3 No.1 p6

8 Strategies Vol.3 No.1 p7 Strategies Vol.3 No.1 p8

9 PCR Enzymes & Instruments PCRRoutine Problem PCRTaq DN Taq Solution Paq5000 TM DN Polymerase PyrococcusPCR1U10 TaqPCR PCR Paq5000 TM DN Polymerase SureStart Taq DN Polymerase Taq2000 TM DN Polymerase * DN Taq 1X 1X 5Kb 5Kb 3 / -d -d -d rchaemaxx D** PCR 100U 500U 100U 500U 100U 500U 100 1,000U 5,000U 1,000U 5,000U 1,000U 5,000U PCR GC Pyrococcus PCR Paq5000 TM DN PolymerasePyrococcus PCRTaq PCR Pfu PCR Exo3'5'5'3' Taq PCR1kb 60 1kb30 Taq PCR4kb 1kb30 6kb PCR Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) TdT3'--dExo PCR Exo PCR3'--d Paq5000 TM DN Polymerase3 # ,000U1U10 PCR Taq DN Taq2000 TM DN Polymerase Thermus aquaticus Taq DN PCR NativeTaq DN Polymerase Taq DN Taq DN SureStart Taq DN Polymerase Taq2000 TM DN Polymerase Taq DN Polymerase PCR Taq Extender TM PCR dditivetaq PCR PCR Taq DN 10kb PCR PCR 10xTaq DN Polymerase PCR Taq Extender TM PCR dditiveperfect Match PCR Enhancer Perfect Match PCR EnhancerPCR 3'- 5' /PCR PCRPCR # Taq Extender TM PCR dditive 1,000 U ,800 Perfect Match PCR Enhancer 100 U , U ,400 Strategies Vol.3 No.1 p9

10 PCR Cloning PCR Problem PCR 3' T3'dT PCR Solution StrataClone TM PCR Cloning Kit dt -PCR PCR3kb StrataPrep DN Gel Extraction Kit PCR StrataClone TM PCR StrataClone TM PCR Cloning KitVaccinia DN I P1 Cre PCR StrataClone TM TBlunt PCR PCRVector Mix 5 StrataClone TM SoloPack Competent Cells 1 PCR 20 10μgDN StrataClone TM PCR Cloning Kit psc-psc-bmcs EcoRI M13T3/T7 StrataPrep Plasmid Miniprep Kit 1.53ml20μg 2.9kb45kb PCR Paq5000 TM DN Polymerase9 6kb PCR StrataClone TM PCR Cloning Kit PCR 2 PCR 1 PCR 9kbPCR 3kbPCR PCR3kb PCR DN PCR StrataPrep DN Gel Extraction Kit PCR100bp 23kbDN DN DN loxp 1 PCRStrataClone TM Vector Mix5 puc ori P lac lac Z' Topoisomerase I PCR Product MCS MCS lac Z' Topoisomerase I ampicillin loxp StrataClone TM Blunt PCR Cloning Kit Cre StrataClone Competent Cells StrataClone TM PCR Cloning KitStrataPrep DN Purification Kit # StrataClone TM Blunt PCR Cloning Kit ,000 StrataClone TM PCR Cloning KitT ,000 StrataClone Ultra TM Blunt PCR Cloning Kit ,200 StrataPrep DN Gel Extraction Kit , ,600 StrataPrep Plasmid Miniprep Kit , ,800 Paq5000 TM DN Polymerase 500U ,200 puc ori <loxp> P lac lac Z' MCS StrataClone PCR Cloning Vector psc-b f1 ori PCR Product MCS lac Z' ampicillin Strategies Vol.3 No.1 p10

11 Q. SMP Lead Vocal Vocalist Vocalist Vocalist Mx3000P PCR30SNPSMP SMart mplification ProcessMitani et.al., Nature Methods Vol.4, No.3, EGFREpidermal Growth Factor ReceptorEGFR Mutation Detection Test Kit LDH2SNPLDH2 Typing Kit SMP () SMPSMart mplification ProcessPCR SNP1 5 Keynotes1 DN ac DN Polymerase60 30 self-primingpcr100 Keynotes2 Keynotes SMPSMart mplification Process P1 (outer primer 1) Ec (45 55) B? 5 3 E 1 TP (turn-back primer) c (50 60) Bc (40 50) B (45 55) BP (boost primer) 0 20 bp bp bp bp SMP C Cc D (50 60) Dc FP (folding primer) 0 20 bp Tm Self-priming DN FP TP P1 P2 3 FP TP F 3 5 Fc (45 55) P2 (outer primer 2 Self-priming DN60 2 SMP ac DN Polymerase: licyclobacillus acidocardarius DN. acidocardarius ph 26, μm μm 11 cdnfntm DNBook SMP Strategies Vol.3 No.1 p11

12 Q. Mx3000P PCR310 Mx3000P. Mx3000P PCR Raw Data Plots SMP DN Q.. SMP 2 SMP 3 Mx3000P PCR SMP Q. SMPSNP?. SNP GM SMPDN SMPEGFREpidermal Growth Factor Receptor: Smartmp EGFR Mutation Detection Test Kit LDH2 SNPSmartmp LDH2 Typing Kit EGFR EGFR Fluorescence (dr) mplification Plots 50% 10% 1% 30 SMP PrimerDesign.do CD Q. SMPPR. SMP SMPhttp:// SMP Nucleic cid-based Technologies Baltimore: : : 72728) : : : 1189 : % 4 Strategies Vol.3 No.1 p12

13 FQ RN RN RN SideStep TM RN bsolutely SideStep TM 1 SideStep TM Lysis and Stabilization BufferQuantos TM QPCR Normalization Primer SetsDNaseDNase SideStep TM II SideStep TM II RN QPCRQRT-PCR bsolutely Total RN mrnmirn SideStep TM II bsolutely RN Kitsbsolutely RN Q SideStepTM SideStep TM II SideStep TM II SideStep TM Buffer Quantos TM QPCR Normalization Primer SetsDNase DNaseSideStep TM Buffer SideStep TM Lysis and Stabilization Buffer P3 Q QuantosTM QPCR Normalization Primer Sets Quantos TM QPCR Normalization Primer SetsDNnoncoding region 3SideStep TM RNDN DNQuantos TM QPCR Normalization Primer SetsQPCR SideStep TM QRT-PCR Q SideStepTM II SideStep TM SideStep TM II DNase RN bsolutely RN bsolutely RN bsolutely RN 96 bsolutely RN bsolutely RN bsolutely RN mircle Miniprep Kit Microprep Kit Microprep Kit Nanoprep Kit mrn Kit FFPE Kit mirn Isolation Kit mg mg Total RN 5150mg FFPE oligo-dt RN 1mg(RN)/mg 200g RN 50g RN 50g RN 200ng RN 50g RN 200g RN () 50l 30l 30l 10l 1050l 30l 50100l # ,800 31,200 72, ,000 39,600 58,800 39,600 45,200 Strategies Vol.3 No.1 p13

14 Q RN Q bsolutely RN KitsLysis BufferDNase RNRN Total RN bsolutely RN Miniprep Kit bsolutely RN Microprep Kit bsolutely RN 96 Microprep Kit bsolutely RN Nanoprep Kit bsolutely RN FFPE Kit mrn bsolutely mrn TM Purification Kit mirn mircle TM mirn Isolation Kit bsolutely RN KitsTotal RN bsolutely RN Miniprep Kit Total RN bsolutely mrn TM Purification KitTotal RNmRN oligo(dt) mrn mircle TM mirn Isolation KitRN RN RN Q RN RN Q bsolutely RN Kits RN Lysis BufferDNase RN Lysis Buffer # mlDNase # ,000U# ,000U 8.67U/μl10U/μl DNase Q bsolutely RN Miniprep Kit RN RN RN Mouse Liver 5mg 14µg 20mg 37µg 40mg 100µg NIH/3T cells 2µg 10 6 cells 19µg 10 7 cells 142µg Rodent Brain 1mg 0.7µg Rodent Kidney 1mg 2µg Rodent Spleen 1mg 3µg Rodent Testis 1mg 2µg Q bsolutely mrn TM Purification Kit mrn RNrRN 100μgTotal RN3.45μgmRN Total RN15mRN rrnrn1rrn Q mircletm mirn Isolation Kit RN RN mircle TM mirn Isolation Kit2223nt200nt RNrRNtRN mirnsirnbsolutely RN Kits RN RN Strategies Vol.3 No.1 p14

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