バイオインフォマティクスⅠ

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よいかずきちや
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1 バイオインフォマティクス ( 第 2 回 ) 慶應義塾大学生命情報学科榊原康文

2 ( 朝日新聞 2003 年 4 月 15 日 ) ヒトゲノムの塩基配列 : 28 億 6 千万塩基 99% を解読精度は 99.99% 以上

3 ( 朝日新聞 2007 年 4 月 13 日 ) アカゲザルのゲノム配列 : 染色体 21 対 ( ヒト 23 対, チンプ 24 対 ) 遺伝子領域の違いヒトやチンパンジーと約 2.5% ( ヒトとチンプの間 1.2%) などなど比較ゲノム解析

4 アサガオの全ゲノム解読

5 納豆菌 (Bacillus subtilis natto ) のゲノム A A T 納豆菌ゲノム T G G C C ( 朝日新聞朝刊科学面 2010 年 5 月 14 日 ) (Nishito et al., BMC Genomics, 2010)

6 ゲノムの大きさ大腸菌出芽酵母ショウジョウバエヒト 500 万塩基対 1,200 万 1.3 億塩基対塩基対 (1.8 億塩基対 ) 2 倍 30 倍 < < < 30 億塩基対 600 倍 Ensembl Genome Browser Golden path length (reference assembly length)

7 ゲノムの配列決定 1 物理地図 (DNAマーカーの位置) の作成 2 ショットガン法 3 シークエンサーによるDNA 断片の配列 (600~ 700 塩基 ) の決定 4 コンピュータによるDNA 断片のアセンブル

8 DNAの配列

9 DNA シークエンサー

10 染色体 : ヒトゲノム配列決定のショットガン法ショットガンにより断片化 : 多重なライブラリーシーケンシングにより配列決定アセンブリ : のりしろ膨大な断片の両端を相互に比較して重なりを見つけて, 元の配列につなぎ戻していく :

11 ゲノム配列の決定法 1 大まかに分けて二種類考えられる 1. 階層的ショットガン法 2. ホールゲノムショットガン法 2 それぞれ長所と短所がある 1. 階層的ショットガン法は, 精度が高いが時間とお金と手間がかかる 2. ホールゲノムショットガン法は, お金や時間が少なくてすむが, 精度の問題や長いゲノムの配列決定に対しては問題点も多い

12 階層的ショットガン法 1

15 階層的ショットガン法 2

16 階層的ショットガン法 3

17 階層的ショットガン法 4

18 階層的ショットガン法によるゲノムの配列決定の手順ゲノムDNAを染色体ごとに分けた後, 制限酵素を用いて GC GGCCGC 10 万 CGCCGG CG ~20 万塩基対の断片に切断断片を BAC( 細菌人工染色体 ) にクローニング後,BAC クローンの BAC ライブラリを作成物理地図を用いて, 各 BAC クローンのゲノム ( 染色体 ) 上での位置を決定 BAC クローンの配列を決定するため, 約 2000 塩基対の長さの断片, ショットガンクローン, に切断 ( 超音波などにより切断 ) 5 ショットガンクローンの両端約 600 塩基の配列を多数決定し, それをコンピュータを用いてつなぎ合わせて, もとの BAC クローンの配列を決定するアセンブリ 6 NotI の制限酵素サイト : BAC クローンの配列と, 整列順の情報を使って染色体の配列を決定する

19 階層的ショットガン法の特徴 1 精度の高いゲノム配列が決定できる 2 手間と時間とお金がかかる大きなクローン (BAC) は作成に時間がかかる BACを並べ, マップを作るのが大変手作業で並べなくてはならない

20 1 制限酵素マッピング : 物理地図作成の方法制限酵素の切断部位を DNA 分子に位置づける 2 蛍光 in situ ハイブリダイゼーション : 標識したDNA 分子をプローブとして, 無傷な染色体にハイブリダイゼーションさせることにより, そのマーカーの位置を決める (DNAの標識: 蛍光, 放射性, その他のマーカーをDNA 分子に付着させる ) 3 配列タグ部位 (STS) マッピング : STSは100~500 塩基対の短いDNA 配列で, その塩基配列がわかっていて, 対象の染色体やゲノム上にただ1 度しか存在しないもの. このように定義されたSTSの位置を, 多数のDNA 断片の集合とPCRにより決定する

21 さまざまな物理地図

22 ホールゲノムショットガン法 1 ( 次世代シークエンサーでは, サブクローニングも行わない!)

23 ホールゲノムショットガン法 2

24 ドラフト配列カバー率 :10 万塩基の BAC クローンの配列決定を 10 万塩基分行った場合, カバー率 1 という. シークエンサーの一度の決定塩基数を 600 とすると,10 万塩基のカバー率 1 の場合には, 約 167(100,000/600) 回のシークエンスをすることになる確率論的に, 正確な配列決定を行うには,10~20 のカバー率が必要とされる完全配列ドラフト配列 : 全ゲノム配列に対して, カバー率 4~5 で配列を決定したもの. カバー率 4~5 では不完全で,7 万 5 千ヶ所もの穴があいている, 向きや順番が正しくないものもある次世代シークエンサー ( リード長数十塩基 ) の場合, ドラフト配列でカバー率 40~50 が必要.

25 セレラ社によるヒトゲノム配列決定 1 セレラ社がヒトゲノム配列決定を 1 年と見積もった理由 : 1 ドラフト配列はカバー率 4~5 なので,30 億の長さのヒトゲノムの全配列に対して, シークエンサーの決定塩基数 600 を使って, 3,000,000, =22,500,000 回のシークエンスを行うことになる 2 96 穴シークエンサーは, 約 800 回 /1 台 1 日シークエンスできる 22,500, ,000 台日 3 セレラ社は,270 台のシークエンサーを持っていた 4 シークエンス約 110 日, アセンブリに残りの日数

26 次世代シークエンサーの登場従来のシークエンサー (ABI 社 3730xl) 処理能力 Mbp / 日 ~2 リード長 bp ~800 次世代シークエンサー (Illumina 社 HiSEQ4000) ~400,000 ~150 従来のゲノム解読数ヵ国のプロジェクトが協力数億円の規模の莫大な費用個人ゲノムを 1000 ドルで読む時代へ

27 コンピュータによる DNA 断片のアセンブル部分文字列をヒントにして, 全文字列を決定する ( 最短共通超文字列 (Shortest Common Superstring)) ターゲット : 再構築によって得られる長い配列フラグメント :2 重鎖のどちらかの鎖のある長さ分だけ 5 3 の方向に配列決定したもの対象とする配列の長さを 10% 程度以内の誤差で大まかに知ることができるショットガン法から得られた多くのフラグメント間の重なりをもとにターゲット分子の塩基配列を再構築するフラグメントをつなぎ合わせる作業を, アセンブルとよぶ

28 理想的なアセンブルの例 1 4 つのフラグメント, ターゲットの長さ 10 塩基 ACCGT CGTGC TTAC TACCGT 配列の重複の情報を利用して, アライメント --ACCGT CGTGC TTAC TACCGT-- ========= TTACCGTGC コンセンサス配列

29 実際のアセンブルにおける問題 1 部分文字列の誤り ( ベースコールエラー ) 2 部分文字列の向き 3 繰り返し配列の存在 4 全体が被覆されていない場合

30 部分文字列の誤り 1 ベースコールエラー : 塩基の置換, 挿入, 欠失 100 塩基につき 1 から 5 塩基程度の頻度で起こる置換エラー ACCGT CGTGC TTAC TGCCGT --ACCGT CGTGC TTAC TGCCGT-- ========= TTACCGTGC

31 部分文字列の誤り挿入エラー ACCGT CAGTGC TTAC TACCGT --ACC-GT CAGTGC TTAC TACC-GT-- ========== TTACC-GTGC

32 部分文字列の誤り欠失エラー ACCGT CGTGC TTAC TACGT (TACCGT) --ACCGT CGTGC TTAC TA-CGT-- ========= TTACCGTGC

33 部分文字列の向き 1 フラグメントは DNA2 重鎖の両方からくるので, 通常はどちらの鎖に含まれるかわからない. 相補鎖からの 2 つのフラグメントは, 向きが反対でかつ塩基は相補的となる CACGT ACGT ACTACG GTACT ACTGA CTGA CACGT ACGT CGTAGT AGTAC ACTGA CTGA ============= CACGTAGTACTGA

34 繰り返し配列の存在繰り返し配列 : ターゲット分子内に,2 回以上現れる配列

35 Double Barreled ショットガン法

36 Mate Pair ( Double Barreled ショットガン法 )

37 ゲノムアセンブラ用語

38 アセンブルのアルゴリズム 1 エラーがなく, かつ向きが分かっていることを仮定 2 最短共通超文字列 (Shortest Common Superstring) 3 ハミルトン経路アルゴリズム ( グラフ問題 ) 最短共通超文字列 (SCS): 入力 : 文字列の集合 F 出力 : 次の条件を満たす最短の文字列 S: S は, すべての w F に対して,w の超文字列である例 ) F = {ACCGT,CGTGC,TTAC,TACCGT} S = TTACCGTGC は F の最短共通超文字列

39 有向マルチグラフ集合 F の有向マルチグラフとは : 1 各ノードには, 集合 F の要素がラベル付けされている. 2 ノード a からノード b に伸びる重み t の有向辺が存在する : suffix(a, t ) = prefix(b, t ) TGGCAAT 2 1 CTTT AATGGC 5 4 有向マルチグラフ上での最大重みをもつハミルトン経路は, 最短共通超文字列を与える TAG GGCC

40 欲張りアルゴリズムハミルトン経路とは : すべてのノードをただ一度だけ通過する経路 ( 二度通過はダメ, 一度も通らないのもダメ ) ハミルトン経路を求める問題は, 計算量的に難しい (NP 困難 ) 欲張りアルゴリズム : それまでに選ばれた経路をそのままにして, ハミルトン経路の性質を乱さないように最大の重みの辺を追加していく必ずしも最大重みをもつハミルトン経路を見つけるわけではない

41 欲張りアルゴリズムの例 AATGGC TGGCAAT GGCC CTTT TAG 欲張りアルゴリズム : 重み :7 最大重みハミルトン経路 : 重み :8

42 ハミルトン経路から算出されるアセンブリ TGGCAAT CTTT AATGGC TAG 欲張りアルゴリズム : 重み :7 GGCC AATGGCAATAGGCCTTT ( 長さ 17) 最大重みハミルトン経路 : 重み :8 TGGCAATGGCCTTTAG ( 長さ 16)

43 ハミルトン経路から算出されるアセンブリ最大重みハミルトン経路によるアセンブリ : TGGCAAT AATGGC GGCC CTTT TAG ================ TGGCAATGGCCTTTAG コンセンサス配列

44 アセンブリの演習問題学籍番号 : 名前 : 下記のフラグメント配列から, 1 有向グラフを作成 2 欲張りアルゴリズムによりハミルトン経路を計算 3 最短共通超文字列を求めて, ターゲット配列を決定

Microsoft PowerPoint - bioinformatics-2-p

Microsoft PowerPoint - bioinformatics-2-p バイオインフォマティクス ( 第 2 回 ) 慶應義塾大学生命情報学科榊原康文 ( 朝日新聞 200 年 4 月 5 日 ) ヒトゲノムの塩基配列 : 28 億 6 千万塩基 99%を解読精度は99.99% 以上 ( 朝日新聞 2007 年 4 月日 ) アカゲザルのゲノム配列 : 染色体 2 対 (ヒト2 対,チンプ24