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いっけいなぐも
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NGS をはじめよう! これだけは知っておきたい MiSeq ~ 解析原理と必要な試薬キット装置の使い方 ~ June 27, 2014 米田瑞穂イルミナ株式会社テクニカルアプリケーションサイエンティスト 2012 Illumina, Inc. All rights reserved.

1 NGS をはじめよう! これだけは知っておきたい MiSeq ~ 解析原理と必要な試薬キット装置の使い方 ~ June 27, 2014 米田瑞穂イルミナ株式会社テクニカルアプリケーションサイエンティスト 2012 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, illuminadx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cbot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, Infinium, iselect, MiSeq, Nextera, Sentrix, SeqMonitor, Solexa, TruSeq, VeraCode, the pumpkin orange color, and the Genetic Energy streaming bases design are trademarks or registered trademarks of Illumina, Inc. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners.

2 本日の Outline MiSeq の概要 MiSeq のワークフロー必要な試薬類解析原理データ解析 MiSeq Reporter 2

3 MiSeq とは? 1 ng~1 µg の DNA(RNA) サンプルから調製したライブラリーイルミナ社のデスクトップ型の次世代シーケンサー (NGS) 相補鎖 DNA を合成しながら読み取りを行う Sequencing By Synthesis (SBS 法 ) を用いる最大 15 Gbases の塩基が解析可能! 2013 年 6 月時点 3

MiSeq で対応可能なアプリケーション全ゲノム解析エクソン解析 HiSeq2500 1000 Gb / ラン 6 日 / ラン NextSeq

トランスクリプトーム解析遺伝子発現プロファイル解析メチル化解析メタゲノム解析微生物ゲノム解析ターゲットリシーケンシング ChIP-Seq 解析

4 MiSeq で対応可能なアプリケーション全ゲノム解析エクソン解析 HiSeq Gb / ラン 6 日 / ラン NextSeq Gb / ラン 1 日 / ラントランスクリプトーム解析遺伝子発現プロファイル解析メチル化解析メタゲノム解析微生物ゲノム解析ターゲットリシーケンシング ChIP-Seq 解析 Small RNA 解析多サンプルアンプリコンシーケンスアンプリコンシーケンスライブラリQC MiSeq v2 試薬 ~8 Gb / ラン ~2 日 (39 時間 ) / ラン MiSeq v3 試薬 ~15 Gb / ラン ~3 日 (55 時間 ) / ラン 4

5 MiSeq ランのワークフロー 1. ライブラリーの調製 2. Illumina Experiment Manager (IEM) を用いたサンプルシートの作成 3. クラスター形成 MiSeq によるシーケンシング 4. MiSeq Reporter によるデータ解析 5

6 MiSeq のランに必要となるもの 2 サンプルシート 4MiSeq 試薬キット 3 フローセル 1 調製したライブラリー 6

7 MiSeq Control Software (MCS) 画像案内でランセットアップをサポート MiSeqのラン実施まではタッチパネルを数回操作するだけ試薬セットの際に動画での手順説明を閲覧可能ラン中にデータ品質クラスター数などのパラメーターをディスプレイに表示 7

8 MiSeq ランのワークフロー 1. ライブラリーの調製 2. Illumina Experiment Manager (IEM) を用いたサンプルシートの作成 3. クラスター形成 MiSeq によるシーケンシング 4. MiSeq Reporter によるデータ解析 8

9 ライブラリーの調製ライブラリー調製 : アダプターが両端に付いた核酸断片を得るイルミナのライブラリー調製キット推奨定量方法 - qpcr 1シーケンスされるDNA 2Flowcellとのハイブリ 3Index ( サンプル区別のためのバーコード ) 推奨定性方法 -Bioanalyzer - ゲル電気泳動 2 3 4シーケンスプライマーのハイブリ例 : TruSeq DNA HT (Dual Index) の場合正確なライブラリ品質の確認と定量が最適なクラスタ密度と高いシーケンスパフォーマンスを得るためには必要不可欠である 9

10 ライブラリーの品質確認についてサポートウェビナーシリーズ 2013 Bioanalyzer を使用した Library QC トラブルシューティング 2013/10/18 イルミナサポートウェビナー ( 10

11 ライブラリーの調製 DNA ライブラリーの調製方法例 (TruSeq DNA prep の場合 ) アプリケーションごとに最適化された試薬キットの提供ゲノム DNA (1 ug から ) DNA の断片化数百 bp 2 種類のアダプター付加 DNA ライブラリー 11

12 主なライブラリー調製キット (2014 年 6 月現在 ) TruSeq Nano DNA TruSeq DNA PCR-Free Nextera DNA Nextera XT Nextera Mate Pair TruSeq Custom Amplicon TruSeq Custom Amplicon Caner Panel Nextera Rapid Capture Exsome Nextera Rapid Capture Custome Enrichment TruSight Tumor TruSight Myeloid TruSight 疾患パネル TruSeq ChIP TruSeq RNA TruSeq Stranded mrna TruSeq Stranded Total RNA TruSeq Small RNA TruSeq RNA Access Library Kit TruSeq targeted RNA Panel 12

13 シーケンスサンプル調製キット Kit Selector あなたのアプリケーションに適したサンプル調製キットを探す 2014/03/31 クリックして選びながら進みますイルミナサポートウェビナー ( 13

14 MiSeq ランのワークフロー 1. サンプルの準備と解析する DNA ライブラリーの作製 2. Illumina Experiment Manager (IEM) を用いたサンプルシートの作成 3. クラスター形成 MiSeq によるシーケンシング 4. MiSeq Reporter によるデータ解析 14

15 Illumina Experiment Manager とは? Illumina Experiment Manager (IEM) はサンプルシートを作成するためのツールですフリーソフトウェア (MyIllmina からダウンロード可能 ) ウィザードベースで作成不適切なインデックスの組み合わせを通知 15

16 サンプルシートとは? サンプルシート : (.csv) - ランの条件 - データ解析の条件 - マニフェスト - ゲノム作成はライブラリー調製の前 16

17 サンプルシートの作成 17

18 サンプルシートの作成 Category の選択 Workflow の選択 18

Sequencing RNA Sequencing Other Resequencing Plasmids Assembly

19 サンプルシートの作成 Targeted Resequencing TruSeq Amplicon PCR Amplicon Metagenomics 16S rrna Enrichment Amplicon - DS Small Genome Sequencing RNA Sequencing Other Resequencing Plasmids Assembly Targeted RNA Small RNA RNA-Seq Library QC FASTQ Only ChIP-Seq 19

20 サンプルシートの作成ライブラリー調製に用いたキットの情報 Run のサイクル数条件を入力する 20

21 サンプルシートの作成 Index の組み合わせが悪い等の場合 Warning が表示される 21

22 サンプルシートの作成入力完了 : Valid 22

23 サンプルシートの作成 23

24 MiSeq ランのワークフロー 1. ライブラリーの調製 2. Illumina Experiment Manager (IEM) を用いたサンプルシートの作成 3. クラスター形成 MiSeq によるシーケンシング 4. MiSeq Reporter によるデータ解析 24

25 MiSeq のランに必要となるもの 2 サンプルシート 4MiSeq 試薬キット 3 フローセル 1 調製したライブラリー 25

26 MiSeq 試薬キット簡便に使える使い切りタイプの試薬セットを使用わずかな操作だけでシーケンス実施可能 26

27 アプリケーションに応じた MiSeq 試薬の使い分けが有効 MiSeq 試薬タイプ V2 50 cycle V2 300 cycle V2 500 cycle 試薬量最大対応リード長リード数 50 bp 2x26+23 bp 15 M 300 bp 2x bp 15 M 500 bp 2x bp 15 M 主な用途ショートリードのシーケンス (Small RNA の発現プロファイリング ) Library QC Nextera XT キットを使った各種アプリケーション PCR アンプリコンの解析 TruSeq Custom Amplicon との併用ロングリードのアンプリコンシーケンス小型ゲノムの De novo アセンブリーなど MiSeq 試薬タイプ V3-150 cycle V3 600 cycle 試薬量最大対応リード長リード数 150 bp 2x76+23 bp 25 M 600 bp 2x bp 25 M 主な用途 RNA-seq ( トランスクリプトーム ) 少数検体の Exome などロングリードのアンプリコンシーケンス微生物の de novo アセンブリー HLA 解析など dual index 分 27

28 MiSeq ラン ~ クラスター形成 ~ クラスター形成はシーケンスの際に DNA を検出可能な充分量に増やす目的で行う各クラスターは増幅された異なる DNA を含むクラスター形成では以下の主要なプロセスを経る 1. ライブラリーのフローセルへのハイブリダイズ 2. ライブラリーの増幅 3. Linearize 4. シーケンスプライマーのハイブリダイズクラスター 1. フローセル表面に DNA 結合 2. ブリッジ PCR で増幅 3. クラスターの形成 28

SBS シーケンシングケミストリー Sequencing By Synthesis (SBS) 法 ( サンガー法の改良法 ) 可逆的ターミネーターを用いて一塩基ずつシーケンスする 3 末端に保護基があるためDNA 合成が一塩基ずつストップしながら行われる 1 反応に蛍光ラベルされた 4ヌクレオチドを加える

29 SBS シーケンシングケミストリー Sequencing By Synthesis (SBS) 法 ( サンガー法の改良法 ) 可逆的ターミネーターを用いて一塩基ずつシーケンスする 3 末端に保護基があるためDNA 合成が一塩基ずつストップしながら行われる 1 反応に蛍光ラベルされた 4ヌクレオチドを加える ( 蛍光の種類で塩基を特定 ) 高精度で信頼がありホモポリマー領域も正確に解析可能 PPP HN O O 3 保護基 O N 切断部位蛍光色素 5 1 サイクル 1 ヌクレオチド取り込み 2 蛍光検出 3 保護基を除去 4 蛍光色素を除去 DNA O HN O O 3 OH O N X 次のサイクルへ 29

30 SBS シーケンシングケミストリー T C A 蛍光をカメラで取得 C T G G G G G G A 蛍光標識した ddntps を DNA ポリメラーゼと一緒に添加一塩基取り込み取り込まれなかったヌクレオチドは洗い流される蛍光標識を励起蛍光標識と 3 の保護基を除去次のサイクルへ... 30

31 SBS シーケンシングケミストリー Quality scores (Q Scores) がすべての塩基に割り当てられるサイクル 1-4 = T G C T Q scores はそれぞれの塩基が不正確にbase callされる可能性を示す Q Score Probability of error Q30 1 in 1000 Q20 1 in

32 シーケンスの原理サポートウェビナーシリーズ 2013 イルミナ SBS (Sequencing By Synthesis) ケミストリーのご紹介 2013/07/19 イルミナサポートウェビナー ( 32

33 トラブルシューティング装置の洗浄 7 月 11 日 ( 金 ) 予定トラブルシューティング編 :NGS 困ったときのお助けツール Online Truobleshooter 7 月 25 日 ( 金 ) 予定トラブルシューティング編 : MiSeq でフォーカスエラーが出た! どうしたら良い? 8 月予定ラン間のサンプル持ち込みを最大限に防ぐための MiSeq のメンテナンス ~ テンプレート洗浄のプロトコール ~ 登録リンク : 33

34 MiSeq ランのワークフロー 1. サンプルの準備と解析するライブラリーの作製 2. Illumina Experiment Manager (IEM) を用いたサンプルシートの作成 3. クラスター形成 MiSeq によるシーケンシング 4. MiSeq Reporter によるデータ解析 34

35 MiSeq Reporter (MSR) とは? MiSeq のパイプラインで二次解析以降を担当するソフトウェアです画像取得 MiSeq Control Software(MCS) /Real Time Analysis (RTA) 一次解析 MiSeq Reporter (MSR) 二次解析画像解析ベースコール FASTQの作成ワークフローに従った各解析レポート表示 Or SAV 別の Windows PC 上でラン中ラン後に確認 35

36 MiSeq 一次解析と二次解析 Analysis Type Outputs Outputs Sequencing (MCS) Images/TIFF files Primary Analysis (RTA) Intensities Base Calling Secondary Analysis (MSR or BaseSpace) Alignments and Variant Detection 36

QC イメージ解析ベースコール一次解析リシーケンスアンプリコン 16S メタゲノム de novo

37 MiSeq Reporter (MSR) 基本ワークフローリシーケンスアンプリコン 16Sメタゲノム De novo アセンブル Enrichment Targeted RNA Small RNA ライブラリー QC イメージ解析ベースコール一次解析リシーケンスアンプリコン 16S メタゲノム de novo アセンブル Enrichment Targeted RNA Small RNA ライブラリー QC 二次解析 37

MiSeq Reporter について Reference Guide http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/mis eq_reporter.ilmn MiSeq Reporter Theory of Operation http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/mis eq_reporter/documentation.

38 MiSeq Reporter について Reference Guide eq_reporter.ilmn MiSeq Reporter Theory of Operation eq_reporter/documentation.ilmn サポートウェビナーシリーズ 2013 MiSeq Reporter アップデート 2013/11/

39 MiSeq Reporter (MSR) ワークフロー概要 * 全てのワーフクローで出力されるわけではありません *Resequencing Enrichment Metagenomics ワークフローが出力に対応レポートに含まれる内容 : リードの統計カバレッジライブラリー断片長のサマリー SNV Insertion / deletion duplicate % など + 解析オプションや使用したソフトウェアのバージョン情報 39

40 Summary MiSeq は簡単に操作を行うことができロングリードのアンプリコンシーケンスやエクソン解析など様々なアプリケーションに対応可能な装置使いきりタイプ MiSeq 試薬キットをシーケンスを行う配列長用途に合わせて選択しクラスター形成からシーケンシングまで簡単な操作で実施可能 MiSeq Reporter によってデータの二次解析まで実施することが可能 40

41 サポートウェビナーにご参加いただきありがとうございました本日のセッション終了後のご質問はで承ります 41

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イルミナテクニカルセミナー session3 Illumina Experiment Manager の使い方サービスサポート部テクニカルサポートサイエンティスト渡辺真子 2011 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, illuminadx, BeadArray, BeadXpress, cbot, CSPro, DASL, Eco, Genetic