Microsoft PowerPoint - 社外資料_TruSeq Synthetic Long-Read DNA Library Prep.pptx

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よしたかたかにし
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1 TruSeq Synthetic Long- Read DNA ライブラリー調製キットイルミナ株式会社マーケティング部 2014 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, 24sure, IlluminaDx, BaseSpace, BeadArray, BeadArray, BlueFish, BeadXpress, BlueFuse, cbot, BlueGnome, CSPro, DASL, cbot, DesignStudio, CSPro, CytoChip, Eco, GAIIx, DesignStudio, Genetic Epicentre, Energy, Genome GAIIx, Genetic Analyzer, Energy, GenomeStudio, Analyzer, GoldenGate, GenomeStudio, HiScan, HiSeq, GoldenGate, Infinium, HiScan, iselect, MiSeq, HiSeq, Nextera, HiSeq X, NuPCR, Infinium, SeqMonitor, iscan, iselect, Solexa, ForenSeq, TruSeq, MiSeq, TruSight, MiSeqDx, VeraCode, MiSeqFGx, the pumpkin NeoPrep, orange Nextera, color, NextBio, and the NextSeq, Genetic Energy Powered streaming by Illumina, bases SeqMonitor, design are SureMDA, trademarks TruGenome, or registered TruSeq, trademarks TruSight, of Illumina, Understand Inc. All other Your brands Genome, and names UYG, VeraCode, contained herein verifi, VeriSeq, are the property the pumpkin of their orange respective color, owners. and the streaming bases design are trademarks of Illumina, Inc. and/or its affiliate(s) in the U.S. and/or other countries. All other names, logos, and other trademarks are the property of their respective owners.

2 TruSeq Synthetic Long-Read DNA ライブラリー調製キット使用にあたっての注意点 TruSeq Synthetic Long-Read DNA ライブラリー調製キットは現時点では HiSeq のみサポートしています解析は BaseSpace で実施していただきます必要準備品が複数ございます事前にご確認をお願いします 2

3 イルミナの DNA ライブラリー調製キット NEW TruSeq DNA PCR-Free TruSeq Nano DNA Nextera Mate Pair TruSeq Synthetic Long-Read Nextera Nextera XT 概要 PCR がもたらすバイアスを削除少ない DNA 量で新たな標準キット長いインサートでゲルフリー複数のアプリケーションに対応微量迅速 MiSeq 超微量微生物 MiSeq アッセイ時間 ~5 時間 ~6 時間 1.5 日 3 日 1.5 時間 1.5 時間アプリケーション全ゲノム全ゲノム De novo 構造変化ゲノムフィニッシング De novo フェージング全ゲノムアンプリコンプラズミド小さいゲノム必要量 1ug+ 100ng+ 1ug+ 500ng 50ng 1ng インデックス (gel-free) インサート 350 or 550bp 350 or 550bp 約 8kbp 10kbp ~300bp ~300bp 3

4 TruSeq Synthetic Long-Read ワークフロー Sample to Answer のトータルソリューション Library Prep Barcoding Sequencing Analysis HiSeq のみサポート 4

TruSeq Synthetic Long-Read ワークフロー DNA 断片化 & ライゲーションゲノム DNA 500ng を Covaris で約 10Kb に断片化両端に増幅用のアダプターをライゲーション精製サイズ選択および定量 DNA 断片の希釈および増幅ウェルあたり数百分子程度になるように 384

5 TruSeq Synthetic Long-Read ワークフロー DNA 断片化 & ライゲーションゲノム DNA 500ng を Covaris で約 10Kb に断片化両端に増幅用のアダプターをライゲーション精製サイズ選択および定量 DNA 断片の希釈および増幅ウェルあたり数百分子程度になるように 384 ウェルプレートに希釈ロングレンジ PCR 反応で DNA 断片を増幅バーコード化およびライブラリー調製 Nextera によるタグメンテーションウェルごとに固有のバーコードを付加ライブラリーのプーリング精製サイズ選択 ( ビーズ使用 ) 電動ピペット推奨シーケンスライブラリーをまとめて HiSeq で解析 5

6 TruSeq Synthetic Long-Read ワークフローショートリードからを合成 100bp x2 の区分けバーコード情報を元に区分けウェル単位にリード配列を分割 100bp x2 のクオリティ前処理 ( ウェルごと ) PCR エラーの修正コンティグ & アセンブル ( ウェルごと ) ウェルごとにコンティグを作成アセンブルを実行してを構築完成各ウェルから得られた ~10Kb の (FASTQ) 6

7 BaseSpace で 2 つのアプリケーションを解析サポートヒトゲノム専用フェージング De novo 7

8 TruSeq Synthetic Long-Read 製品情報製品名 (Library Prep) TruSeq SYNTH Long-Read DNA Library Prep Kit (4 Samples) カタログ番号 FC 製品名 (Barcoding) TruSeq SYNTH Long-Read DNA Kit (1 Sample) TruSeq SYNTH Long-Read DNA Kit (4 Samples) カタログ番号 FC FC 製品名 (Optional) TruSeq SYNTH Long-Read DNA Accessory Kit カタログ番号 FC

9 バーコードキットの利用方法フェージングヒト gdna 500ng gdna 500ng LR Library Prep Kit LR Library Prep Kit 1x Library Prep 1x Library Prep 1x Prep 4x Prep 30x 全ゲノム VCF データ ( フェーズなし ) 高出力あるいは Rapid 1 レーン 100bp x 2 のラン設定高出力の場合 1 レーン / バーコードプレート Rapid の場合 2 レーン / バーコードプレート 1x Analysis 4x Analysis Phased VCF 9

10 バーコードキットの利用方法 de novo の場合 1 サンプルスタート gdna 500ng 1 ライブラリー調製 LR Library Prep Kit 1x Library Prep 複数のバーコードプレートを使用 ( 必要数は次スライド参照 ) 4x Prep バーコードプレートごとにシーケンスを実施 100bp x 2 のラン設定高出力の場合 1 レーン / バーコードプレート Rapid の場合 2 レーン / バーコードプレートバーコードプレートごとに解析を実施 4x Analysis バーコードプレートあたり約 600Mb ののセットを構築 ( 目安 ) 10

イネ (400Mb) を de novo 解析するにはイネのゲノムサイズ = 400Mb 5x のデータ量で 1 サンプルを de novo 解析 400Mb x5 = 2Gb 必要 2Gb / 600Mb = 4 バーコードプレート必要 gdna 500ng ライブラリー調製キット FC-126-1001(4 サンプルキット ) 1 キット購入し 1 サンプル分を調製 LR Library

11 イネ (400Mb) を de novo 解析するにはイネのゲノムサイズ = 400Mb 5x のデータ量で 1 サンプルを de novo 解析 400Mb x5 = 2Gb 必要 2Gb / 600Mb = 4 バーコードプレート必要 gdna 500ng ライブラリー調製キット FC (4 サンプルキット ) 1 キット購入し 1 サンプル分を調製 LR Library Prep Kit 1x Library Prep バーコードキット FC (4 サンプルキット ) 1 キット購入し 4 プレートを使用 4x Prep 高出力の場合 4 レーン Rapid の場合 8 レーン必要 100bp x 2 のラン設定高出力の場合 1 レーン / バーコードプレート Rapid の場合 2 レーン / バーコードプレート 600Mb x 4 = 2.4 Gb 4x Analysis 11

12 解析例 : ゲノムサイズ複雑性の異なる生物種で実施 % ゲノムサイズ N50 (>1.5kb) (bp) (1.5Kb 以上 ) にアセンブルできた塩基数アカパンカビ 41 Mb 8,285 1,417Mb 線虫 102 Mb 9,125 1,182 Mb トキソプラズマ 65.6 Mb 8,847 1,052Mb イネ 420 Mb 7,095 1,088Mb トウモロコシ 2.3 Gb 6, Mb 10 0 %GC Reference %GC Long-Reads %Aligned to Reference %Misassembled Neurospora crassa C. Elegans Toxoplasma gondii Oryza sativa Zea mays 12

13 TruSeq Synthetic Long-Read 使用例ゲノムサイズ N50 (>1.5kb) (bp) パイナップル TBD Mb (>1.5kb) にアセンブルされた塩基数昆虫 TBD 7, Mb 昆虫パイナップル Number of Long Reads Number of Long Reads Read Length (bp) Read Length (bp) 13

Nextera Mate Pair との違い原理 TruSeq Synthetic Long-Read DNAを約 10kbに断片化 ( ロングフラグメント ) した後さらに Nextera でタグメンテーションもとのロングフラグメントすべてをショートリードで読み取りアセンブルして合成を構築 Nextera メイトペア DNA を約 5~8kb に断片化 ( ロングフラグメント )

14 Nextera Mate Pair との違い原理 TruSeq Synthetic Long-Read DNAを約 10kbに断片化 ( ロングフラグメント ) した後さらに Nextera でタグメンテーションもとのロングフラグメントすべてをショートリードで読み取りアセンブルして合成を構築 Nextera メイトペア DNA を約 5~8kb に断片化 ( ロングフラグメント ) した後環状化環状化した接点を抽出しシーケンス ( ロングフラグメントの末端配列のみを解析 ) 目安となるゲノム 40Mb サイズ以上のゲノム主に微生物でよく使われる DNAスタート量 500ng ゲルフリー 1ug ゲルあり 4ug 最終産物約 10kbをアセンブル 5~8kb 離れたDNA 断片の両端のみシーケンスインデックス利用不可 12プレックスライブラリー調製にかかる時間 3 日 1.5 日ライブラリーコスト高安対応システム HiSeq HiSeq, NextSeq, MiSeq, GA シーケンス 100bp x2( 高出力 v3の場合 ) 150bp x2 1バーコード1レーン ( 高出力の場合 ) 30~60xカバレッジ推奨解析 BaseSpace 専用アプリメイトペアリード解析が可能なソフトウェア BaseSpace アプリ (Spades, Velvet) 14

15 TruSeq Synthetic Long-Read DNA ライブラリー調製キット Sample to Answer トータルソリューション Library Prep Barcoding Sequencing Analysis 15

2015 年 5 月 15 日イルミナサポートウェビナー Nextera Rapid Capture Exome キットを用いたエクソームシーケンス - ドライ編 BaseSpace で行うかんたん NGS データ解析 < Enrichment アプリ > イルミナ株式会社バイオインフォマティクスサ

2015 年 5 月 15 日イルミナサポートウェビナー Nextera Rapid Capture Exome キットを用いたエクソームシーケンス - ドライ編 BaseSpace で行うかんたん NGS データ解析 < アプリ > イルミナ株式会社バイオインフォマティクスサポートサイエンティスト癸生川絵里 (Eri Kibukawa) 2014 Illumina, Inc. All rights