Introduction to Illumina Next Generation Sequencing (NGS)

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まなかせ
5 years ago
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1 イルミナ Sequencing By Synthesis (SBS) ケミストリーのご紹介小林孝史イルミナ株式会社テクニカルアプリケーションサイエンティスト 2013 Illumina, Inc. ll rights reserved. Illumina, IlluminaDx, BaseSpace, Beadrray, BeadXpress, cbot, SPro, DSL, DesignStudio, Eco, IIx, enetic Energy, enome nalyzer, enomestudio, oldenate, HiScan, HiSeq, Infinium, iselect, MiSeq, Nextera, NuPR, SeqMonitor, Solexa, ruseq, rusight, Veraode, the pumpkin orange color, and the enetic Energy streaming bases design are trademarks or registered trademarks of Illumina, Inc. ll other brands and names contained herein are the property of their respective owners.

2 本日のウェビナーの概要キャピラリーシーケンサー合成分離読み取り鋳型 DNから1 塩基違いの相補鎖 DNを合成キャピラリー内でゲル電気泳動で分離しながら読み取り ( サンガー法 ) 一度に少数 (96) のDN 断片しか同時に解析できない次世代シーケンサー ( イルミナ ) 合成読み取り相補鎖 DNを合成しながら読み取りを行う (SBS 法 ) 分離は行わない一度に多数 (30 億 ) のDN 断片を同時に解析できる 2

3 改良イルミナシーケンサーワークフローサンガー法サンプル調製 DN 増幅シーケンスデータ解析イルミナシーケンサー SBS 法ライブラリー作製クラスター形成 3

4 はじめに Sequencing By Synthesis (SBS) 法 MiSeq IIx HiScanSQ HiSeq 1000/1500 HiSeq 2000/2500 4

5 イルミナシーケンサーのワークフロー 1. サンプル調製 : シーケンサー解析用の DN サンプルを作る 2. クラスター形成 : DN を増幅する 3. シーケンシング : 塩基配列 ( 蛍光 ) を読み取る 4. データ解析 : データを綜合して塩基配列を得る 5

6 1. サンプル調製 : シーケンサー解析用の DN サンプルを作る DN ライブラリー ( イルミナシーケンサー解析用 DN サンプル ) の構造イルミナシーケンサー専用オリゴヌクレオチドアダプター DN Insert 数百 bpに断片化したdn( 解析する配列 ) P5, P7 フローセルへの結合部位 DN 増幅 SP シーケンスプライマー結合部位シーケンス Index 複数サンプル解析用のバーコード 6

7 1. サンプル調製 : シーケンサー解析用の DN サンプルを作る DN ライブラリーの調製方法例 (ruseq DN prep の場合 ) アプリケーションごとに最適化された試薬キットの提供ゲノム DN (1 ug から ) DN の断片化数百 bp 2 種類のアダプター添加 DN ライブラリー 7

ruseq mplicon (ustom/ancer) Details DN トランスポゾームを使用最多 96 種類の index 少量の DN から適応 DN 超音波破砕 24(L), 96(H)

8 1. サンプル調製 : シーケンサー解析用の DN サンプルを作る主なサンプル調製キット (2013 年 7 月現在 ) Kit Nextera Nextera X ruseq DN ruseq nano ruseq PR-Free ruseq RN (v2) ruseq Stranded RN ruseq Small RN Nextera Rapid apture (Exome/ustom) Nextera Mate Pair ruseq mplicon (ustom/ancer) Details DN トランスポゾームを使用最多 96 種類の index 少量の DN から適応 DN 超音波破砕 24(L), 96(H) 種類のインデックス低コスト mrn 最多 24 種類のインデックスストランド情報 (Stranded) が得られる Small RN, 最多 48 種類のインデックスターゲット領域を濃縮メイトペアシーケンス長断片に対応アンプリコンを作製しライブラリー作製 8

9 2. クラスター形成 : DN を増幅する 1 つの DN ライブラリーから増幅したクラスタークラスター形成は調製した DN ライブラリーをシーケンスの際に検出可能な充分量に増やす目的で行う増幅工程 9

10 2. クラスター形成 : DN を増幅するイルミナシーケンサーではクラスター作製はフローセルと呼ばれるガラス基板上で行われる 1~8 レーンの試薬が流れる穴が開いているフローセルのレーンの上下面にはオリゴヌクレオチド (P5/P7) が林立しているクラスター形成時やシーケンス解析時には試薬が流れる試薬が流れて反応起こるレーンの両端に穴が開いている 10 図は HiSeq シリーズの HighOutput フローセル (1 枚につき 8 レーン )

11 2. クラスター形成 : DN を増幅する 1 つのフローセルで 8 レーンフローセルの流路の表面にはオリゴヌクレオチドが林立 11

12 2. クラスター形成 : DN を増幅する 1. 変性された一本鎖 DN ライブラリーがフローセル内部のオリゴヌクレオチドと結合 2. 近傍の別なオリゴヌクレオチドとブリッジ PR することにより一本鎖 DNが増幅 3. クラスター形成のために~1000 分子形成される 4. P7を根元に含む鎖のみ切断することにより 1 方向の鎖のみ得られる変性した 1 本鎖 DN ライブラリー図は MiSeq のフローセル (1 枚につき 1 レーン ) 12

13 3. シーケンシング : 塩基配列 ( 蛍光 ) を読み取る Sequencing By Synthesis (SBS) 法 ( サンガー法の改良法 ) 可逆的ターミネーターを用いて一塩基ずつシーケンスする 3 末端に保護基があるため DN 合成が一塩基ずつストップしながら行われる 1 反応に蛍光ラベルされた 4 ヌクレオチドを加える ( 蛍光の種類で塩基を特定 ) 高精度で信頼がありホモポリマー領域も正確に解析可能 HN O PPP O 3 保護基 O N 切断部位蛍光色素 5 DN O 1 サイクル 1 ヌクレオチド取り込み 2 蛍光検出 3 保護基を除去 4 蛍光色素を除去 HN O O 3 OH O N X 次のサイクルへ 13

14 3. シーケンシング : 塩基配列 ( 蛍光 ) を読み取る 3 5 ycle 1 シーケンス試薬の添加 1 塩基伸長反応未反応試薬の除去蛍光シグナルの取り込み保護基と蛍光の除去 ycle 2 上記反応の繰り返し ycle 3, 4, 5.. 上記反応の繰り返し 14

15 4. データ解析 : データを綜合して塩基配列を得る 1 回のサイクル終了後のイメージ MiSeq だと 1 フローセルあたり 1500 万個のクラスター 20um 100um 15

16 4. データ解析 : データを綜合して塩基配列を得るそれぞれのサイクルにおける F 上の画像から塩基情報が抽出されるまずクラスターの認識位置づけそしてカウントが行われるサイクル 1-4 = 28 clusters 16

17 4. データ解析 : データを綜合して塩基配列を得る Quality scores (Q Scores) がすべての塩基に割り当てられるサイクル 1-4 = Q scores はそれぞれの塩基が不正確にBaseallされる可能性を示す Q Score Probability of error Q30 1 in 1000 Q20 1 in

18 4. データ解析 : データを綜合して塩基配列を得るテキストファイルの視覚化 Instrument Run ID Lane ile X-coord Y-coord Index # Read # Sequence SII haracter Q-score PF (0,1) 座標配列最終的にクラスター位置を座標で表しそのクラスターに含まれている DN の塩基配列を示したものが出力される 18

19 19 イルミナシーケンサーでアウトプット量を大きくするための工夫

20 その 1:PE( ペアエンド ) シーケンス Read1 シーケンス 3 5 Read 1 シーケンス (100bp) 5 フローセル表面上のクラスター 1 分子での例 20

21 Read1 が終わった後クラスターの再形成を行う Single molecule array クラスターを再合成する 21

22 逆側からのシーケンス =Read2 R2 プライマーをハイブリダイズフローセル上のクラスター 1 分子での例 22

23 ペアエンドリードの利点 : 両端からユニークリードが得られるということはアウトプット量が 2 倍に! single read 100bp paired-end read 100bp 100bp 23

24 その 2: 多サンプル解析 ( マルチプレックス解析 ) Index シーケンシングとはなにか? DN ライブラリーの端に識別のためのインデックスが付加されてあるそれぞれの DN 断片がどのサンプル由来か同定が可能簡単ということは? サンプルを混ぜて (pooling) 解析して後でクラスターをそれぞれのサンプルに振り分ければいい (de-multiplex) 多サンプル解析 (multiplex analysis) が可能インデックスを持つ DN ライブラリーの例イルミナでは矢印の部分がインデックス配列を指します 24

25 Index シーケンシングとはなにか? 最多 24 サンプルか 96 サンプルの多サンプルの同時解析が可能です! ということは? 1 サンプル当たりより経済的に安価に解析が可能です! より具体的には 1 サンプルにつきデータ量がたくさん要らないサンプルについてまとめて多くのサンプルを解析できる別なサンプル必要なデータ量 : 1bases 別なサンプル必要なデータ量 : 1bases 必要なデータ量 : 1bases MiSeq Output: max 8bases 残った部分のデータは実質捨ててしまう 25

26 マルチプレックス解析がどのように行われるか Read 1 26

27 マルチプレックス解析がどのように行われるか Read 1 Index Read 27

28 マルチプレックス解析がどのように行われるか Read 1 Index Read Read 2 28

29 多サンプル解析に関してもっと知りたい場合にはサポートウェビナー :Dual Index を持つ Library のシーケンサーセットアップ (pdf のダウンロードのみも可能です ) 29

30 本日のまとめ : イルミナシーケンサーのワークフロー 3 5 解析したいサンプル (DN/RN) DN ライブラリーサンプル調製クラスター形成 ( フローセルの中で ) シーケンシング (SBS 法による ) シーケンシングにおけるサイクルベースコール 30

31 参考文献細胞工学別冊 : 次世代シークエンサー目的アドバンストメソッド菅野純夫 / 鈴木穣監修イルミナのホームページから得られる情報からシーケンスサンプル調製キットセレクター ( 目的のアプリケーションに沿ったキット ) ( ウェブ上でトレーニング英語 ) MyIllumina( 弊社サイト内 ) からユーザーガイドのダウンロードサポートメールニュースイルミナからのお知らせメール ( 登録が必要 ) イルミナシーケンサーの原理について : Bentley et al. (2008) ccurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature 456:

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Dual Index を持つ Library のシーケンサーセットアップ小林孝史テクニカルアプリケーションサイエンティスト 2012 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, illuminadx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cbot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx,