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1 生命情報実験 A 次世代シークエンサーのデータを用いたゲノム解析 慶應義塾大学理工学部 生命情報学科 榊原康文 佐藤健吾

2 ねらい これからの生命科学において要となるツールである次世代シークエンサー (NGS) が産生するデータを用いたゲノム解析を体験する 次世代シークエンサー 長所 : 高速かつ低コスト 短所 : 得られる一本一本の配列が短い (= ショートリード ) Illumina GAIIx 例 : ヒトゲノムの解読 2003 年キャピラリーシークエンサー 13 年 3000 億円以上 2012 年次世代シークエンサー 10 日間 70 万円

3 解析対象 納豆菌 - 納豆菌 (Bacillus subtilis natto) は有用物質を作る γ-pga ナットウキナーゼ エラスターゼ ポリアミン 枯草菌 (Bacillus subtilis) の近縁種 BEST195 株ゲノムの決定 [Nishito et al., 2010] 遺伝的多様性を持つ菌種 オシキリ食品 ( 北海道 ) 黒石納豆 ( 青森 ) ソウル ( 韓国 ) ヤマダフーズ ( 秋田 ) 萬歳食品 ( 宮城 ) 高畠納豆 ( 山形 ) ホンコン ( 中国 ) あづま食品 ( 栃木 ) キネマ ( ネパール ) 奥野食品 ( 三旭松食品重 ( 大阪 ) ) タカノフーズ ( 茨城 ) 水戸納豆 ( 茨城 ) チェンマイ ( タイ ) 丸美屋 ( 熊本 ) ミツカン ( 愛知 ) やぐちフーズ ( 埼玉 ) 鎌倉山納豆 ( 神奈川 )

4 解析対象 納豆菌 - アジア各国の納豆に似た食品から採取した 5 株 韓国株 (KorC1) ラオス株 (LaoA1) ミャンマー株 (MyaA2) ネパール株 (NepD5) タイ株 (ThaB) (BEST195)

5 解析の流れ サンプル調製とシークエンシング - サンプル調製 500 bp 納豆菌ゲノム Illumina GAIIx ( アジア株 5 株 ) ゲノム抽出 断片化 シークエンシング ペアエンドリード 断片化されたショートリードの両端を読む ペアエンドリード ペアエンドリード 平均インサート長 500bp

6 解析の流れ - de novo アセンブリ - 参照するゲノムがない場合の解析方法 ペアエンドリード ( アジア株 5 株 ) アセンブリ SPAdes [Bankevich et al, 2012] 推定ゲノム ( スキャフォルド ) 遺伝子予測 glimmer [Salzberg et al, 1998] 遺伝子アノテーション 比較ゲノム Murasaki [Popendorf et al, 2010] 枯草菌 納豆菌 BEST195 オーソログ遺伝子 リピート領域の解析 アジア株

7 解析の流れ 変異解析 - 参照するゲノムがある場合の解析方法 ペアエンドリード ( アジア株 5 株 ) マッピング Bowtie2 [Langmead et al, 2012] BEST195 ゲノム 多型の同定 VarScan2 [Koboldt et al, 2012] A A A A A C BEST195 ゲノム 変異影響度アノテーション snpeff [Cingolani et al, 2012] 同義置換 非同義置換 非コード領域の置換 遺伝子の機能 表現型の解析

8 進め方 アジア 5 株のうち どれか 1 株を解析する 学科整理番号 % 5 = 0 韓国株 (KorC1) 1 ラオス株 (LaoA1) 2 ミャンマー株 (MyaA2) 3 ネパール株 (NepD5) 4 タイ株 (ThaB) 各々の計算は ウェブツール Galaxy を操作して実行する 計算結果は Windows 上のツール GMV IGV を用いて視覚化する

9 Galaxy ペンシルバニア州立大学で開発されている Web ベースのゲノム解析プラットホーム コンピュータに詳しくない研究者でもバイオインフォマティクス研究が可能に!

10 準備 (Galaxy アカウント作成 ) 実験用 Galaxy サーバにアクセスする ユーザ登録を行う 中央上部の User Register

11 準備 (Galaxy アカウント作成 ) ユーザ登録を行う 中央上部の User Register ニックネーム (3 文字以上の英小文字か - )

12 解析の流れ - de novo アセンブリ - 参照するゲノムがない場合の解析方法 ペアエンドリード ( アジア株 5 株 ) アセンブリ SPAdes [Bankevich et al, 2012] 推定ゲノム ( スキャフォルド ) 遺伝子予測 glimmer [Salzberg et al, 1998] 遺伝子アノテーション 比較ゲノム Murasaki [Popendorf et al, 2010] 枯草菌 納豆菌 BEST195 オーソログ遺伝子 リピート領域の解析 アジア株

13 準備 (de novo アセンブリ ) まずはログインする 先ほど作成した ユーザ名 パスワード でログインする History の名前を de novo assembly に変更する

14 リード配列をインポート 担当する株のリード配列を History にインポートする Shared Data Data Libraries natto DNA ここは担当する株によって変わる to History をクリック de novo assembly 選択 Import

15 FASTA フォーマット 元々は FASTA というプログラムで使われていた配列フォーマットだが 他のプログラムでも広く使われている.fa とか.fasta というファイル名であることが多い 1 行目 : > で始まるヘッダ 2 行目以降 : 実際の配列 >AP Bacillus subtilis subsp. natto BEST195 DNA, complete genome. ATCTTTTTCGGCTTTTTTTAGTATCCACAGAGGTTATCGACAACATTTTCACATTACCAA CCCCTGTGGACAAGGCTTTTTCAACAGGTTGTCCGCTTTGTGGATAAGATTGTGACAACC ATTGCAAGCTCTCGTTTATTTTGGTATTATATTTGTGTTTTAACTCTTGATTACTAATCC TACCTTTCCTCTTTATCCACAAAGTGTGGATAAGTTGTGGATTGATTTCACACAGCTTGT GTAGCAGGTTGTCCACAAGTTGTGAAATTTGTCGAAAAGCTATTTATCTACTATATTATA

16 FASTQ フォーマット NGS から出力される配列フォーマット.fq とか.fastq というファイル名であることが多い 1 行目 で始まるヘッダ 2 行目 : 塩基配列 3 行目 : + 4 行目 : 1:N:0:TAGCTT GAGGTTAACGGCACATTTCGCGCCAACCATTCCTGCGGACACGATTCNCATATGACAA + HHGGHHHHHHHHDHHGHHHHHHHHDHHHGHGHHBHHHHFHHGHHG@B#B@AEAAEHDB ( より詳しくは :

17 解析の流れ - de novo アセンブリ - 参照するゲノムがない場合の解析方法 ペアエンドリード ( アジア株 5 株 ) アセンブリ SPAdes [Bankevich et al, 2012] 推定ゲノム ( スキャフォルド ) 遺伝子予測 glimmer [Salzberg et al, 1998] 遺伝子アノテーション 比較ゲノム Murasaki [Popendorf et al, 2010] 枯草菌 納豆菌 BEST195 オーソログ遺伝子 リピート領域の解析 アジア株

18 SPAdes アセンブリを実行する この値をいろいろ変えるとアセンブリ結果のパフォーマンス (N50 等 ) が変わる

19 SPAdes アセンブリを実行する 株の名前 _R1.fastq 株の名前 _R2.fastq

20 ゲノムアセンブリ [Green, 2001]

21 SPAdes アセンブリ結果を表示する 各配列の長さとカバレッジ (1 塩基あたりマッピングされているリード数 ) 配列 ( コンティグ スキャフォルド ) は FASTA 形式

22 アセンブリの評価 推定ゲノム長 アセンブリにより得られたコンティグ ( スキャフォルド ) の長さの和 最長コンティグ ( スキャフォルド ) 長 最も長いコンティグ ( スキャフォルド ) 長 N50 長 N90 長 コンティグ ( スキャフォルド ) を長さ順につなげていった時 長さの累積が推定ゲノム長の 50(90)% を越えた時のコンティグ ( スキャフォルド ) の長さ この長さ以上のコンティグ ( スキャフォルド ) の長さを足すと 推定ゲノム長の 50(90)% を越える 推定ゲノム長の 50% 推定ゲノム長 最長コンティグ長 N50 長

23 SPAdes stats アセンブリ結果を評価する

24 SPAdes stats アセンブリ結果を評価する N50 長 N90 長

25 Summary Statistics アセンブリ結果を評価する 推定ゲノム長 最大スキャフォルド長 Scaffold stats テーブルの第 2 カラムという意味

26 Summary Statistics アセンブリ結果を評価する 推定ゲノム長 最大スキャフォルド長

27 解析の流れ - de novo アセンブリ - 参照するゲノムがない場合の解析方法 ペアエンドリード ( アジア株 5 株 ) アセンブリ SPAdes [Bankevich et al, 2012] 推定ゲノム ( スキャフォルド ) 遺伝子予測 glimmer [Salzberg et al, 1998] 遺伝子アノテーション 比較ゲノム Murasaki [Popendorf et al, 2010] 枯草菌 納豆菌 BEST195 オーソログ遺伝子 リピート領域の解析 アジア株

28 Filter SPAdes output 信頼できないスキャフォルドを除去する

29 Glimmer3 遺伝子予測を実行する

30 Convert Glimmer to GFF 遺伝子予測結果を他のプログラムで使える形式に変換する 同じ名前のデータが二つあるが 番号が若い方を選ぶ

31 GFF フォーマット General Feature Format ゲノムアノテーション ( 遺伝子など ) を記述するためのフォーマット natto0 confirmed CDS ID=BSNT_00864 natto0 confirmed CDS ID=BSNT_01234 natto0 confirmed CDS ID=BSNT_02038 natto0 confirmed CDS ID=BSNT_02338 natto0 confirmed CDS ID=BSNT_02447 配列名 タイプ 開始座標 終了座標 ストランド その他の属性 (IDなど)

32 解析の流れ - de novo アセンブリ - 参照するゲノムがない場合の解析方法 ペアエンドリード ( アジア株 5 株 ) アセンブリ SPAdes [Bankevich et al, 2012] 推定ゲノム ( スキャフォルド ) 遺伝子予測 glimmer [Salzberg et al, 1998] 遺伝子アノテーション 比較ゲノム Murasaki [Popendorf et al, 2010] 枯草菌 納豆菌 BEST195 オーソログ遺伝子 リピート領域の解析 アジア株

33 枯草菌と納豆菌 BEST195 のゲノム配列を準備 Shared Data Data Libraries natto からインポート 枯草菌 Shared Data Data Libraries natto Reference 納豆菌 BEST195

34 GenBank フォーマット 配列アノテーションを記述するフォーマットの一つ GenBank で使用されている LOCUS AP bp DNA linear HTG 25-MAR-2010 DEFINITION Bacillus subtilis subsp. natto BEST195, *** SEQUENCING IN PROGRESS ***, 12 ordered pieces. ACCESSION AP SOURCE Bacillus subtilis subsp. natto BEST195 ORGANISM Bacillus subtilis subsp. natto BEST195 Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus. REFERENCE 1 AUTHORS Nishito,Y., Osana,Y., Hachiya,T., Popendorf,K., Toyoda,A., Fujiyama,A., Itaya,M. and Sakakibara,Y. TITLE Whole genome assembly of a natto production strain Bacillus subtilis natto from very short read data JOURNAL BMC Genomics (2010) In press FEATURES Location/Qualifiers source /organism="bacillus subtilis subsp. natto BEST195" /mol_type="genomic DNA" /strain="best195" /sub_species="natto" /db_xref="taxon:645657" gene /gene="dnaa" /locus_tag="bsnt_00001" CDS /gene="dnaa" /locus_tag="bsnt_00001" /note="from glimmer orf00001" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="chromosomal replication initiation protein" /protein_id="bai " /db_xref="gi: " /translation="menildlwnqalaqiekklskpsfetwmkstkahslqgdtltit APNEFARDWLESRYLHLIADTIYELTGEELSIKFVIPQNQDVEDFMPKPQVKKAVKED TSDFPQNMLNPKYTFDTFVIGSGNRFAHAASLAVAEAPAKAYNPLFIYGGVGLGKTHL MHAIGHYVIDHNPSAKVVYLSSEKFTNEFINSIRDNKAVDFRNRYRNVDVLLIDDIQF

35 Murasaki 比較ゲノム解析

36 結果をダウンロード 比較ゲノム解析の結果を GMV で可視化するために Murasaki と Glimmer3 の結果をダウンロードする

37 GMV (Murasaki Viewer) GMV をダウンロードして適当な場所で解凍 Murasaki の実行結果が入っている zip ファイルを解凍して実行 展開先 /output/test.anchors を開く

38 GMV (Murasaki Viewer) Glimmer3 による遺伝子予測結果を貼り付ける [File]-[Load Annotation File] から For sequence は #3 を選ぶ

39 GMV (Murasaki Viewer) アンカーを並べ替える [Edit]-[Sort Sequence Sources by Anchors] から Along は Sequence #2 を選ぶ

40 GMV (Murasaki Viewer)

41 解析の流れ 変異解析 - 参照するゲノムがある場合の解析方法 ペアエンドリード ( アジア株 5 株 ) マッピング Bowtie2 [Langmead et al, 2012] BEST195 ゲノム 多型の同定 VarScan2 [Koboldt et al, 2012] A A A A A C BEST195 ゲノム 変異影響度アノテーション snpeff [Cingolani et al, 2012] 同義置換 非同義置換 非コード領域の置換 遺伝子の機能 表現型の解析

42 準備 ( 変異解析 ) 新しい History を作る ここから Create New を選ぶ variant analysis に変更する

43 リード配列をインポート 担当する株のリード配列を History にインポートする Shared Data Data Libraries natto DNA ここは担当する株によって変わる to History をクリック variant analysis 選択 Import

44 解析の流れ 変異解析 - 参照するゲノムがある場合の解析方法 ペアエンドリード ( アジア株 5 株 ) マッピング Bowtie2 [Langmead et al, 2012] BEST195 ゲノム 多型の同定 VarScan2 [Koboldt et al, 2012] A A A A A C BEST195 ゲノム 変異影響度アノテーション snpeff [Cingolani et al, 2012] 同義置換 非同義置換 非コード領域の置換 遺伝子の機能 表現型の解析

45 Bowtie2 ショートリードを参照ゲノムにマッピングする 株の名前 _R1.fastq 株の名前 _R2.fastq

46 Bowtie2 ショートリードを参照ゲノムにマッピングする 平均インサート長 +200

47 Bowtie2

48 SAM Tools flagstat マッピング率を調べる

49 SAM/BAM フォーマット 配列をゲノムにマッピングしたときに生成されるアラインメントのフォーマット SAM フォーマット : プレーンテキスト形式 BAM フォーマット : SAM フォーマットをバイナリ形式したもの HWUSI-EAS1730:24:FC:1:51:11857: natto M = ATCTTTTTCGGCTTTTTTTAGTATCCACA GAGGTTATCGACAACATTTTCACATTACC IIHHIIIIHIIIIIIIIIIDE8GGGIIIDFHHIGHIHIEIGIHIIGG:GGGDDGGIGH AS:i:0 XN:i:0 XM:i:0 XO:i:0 XG:i: 0 NM:i:0 MD:Z:58 YS:i:-1 YT:Z:CP RG:Z:KorC1 HWUSI-EAS1730:24:FC:1:112:3847: natto M8I46M = ATGTGGATATCTTTTTCGGCTTTTTTTAG AS:i:-34 XN:i:0 XM:i:1 XO:i: 1 XG:i:8 NM:i:9 MD:Z:2C47 YS:i:0 YT:Z:CP RG:Z:KorC1

50 マッピングの評価 マッピング率

51 解析の流れ 変異解析 - 参照するゲノムがある場合の解析方法 ペアエンドリード ( アジア株 5 株 ) マッピング Bowtie2 [Langmead et al, 2012] BEST195 ゲノム 多型の同定 VarScan2 [Koboldt et al, 2012] A A A A A C BEST195 ゲノム 変異影響度アノテーション snpeff [Cingolani et al, 2012] 同義置換 非同義置換 非コード領域の置換 遺伝子の機能 表現型の解析

52 Mpileup call variants リファレンスゲノムと異なる塩基を同定する

53 VarScan2 多型を同定する

54 VCF フォーマット Variant Call Format 配列の多型を記述する #CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO.. AP T A. PASS ADP=132;.. AP C A. PASS ADP=143;.. AP A C. PASS ADP=129;.. AP A T. PASS ADP=116;.. 配列名座標参照配列の塩基変異後の塩基その他の属性

55 解析の流れ 変異解析 - 参照するゲノムがある場合の解析方法 ペアエンドリード ( アジア株 5 株 ) マッピング Bowtie2 [Langmead et al, 2012] BEST195 ゲノム 多型の同定 VarScan2 [Koboldt et al, 2012] A A A A A C BEST195 ゲノム 変異影響度アノテーション snpeff [Cingolani et al, 2012] 同義置換 非同義置換 非コード領域の置換 遺伝子の機能 表現型の解析

56 snpeff 変異効果アノテーション

57 多型の種類 一塩基多型 (SNP) 同義置換 (synonymous coding) Effect Low 参照ゲノム M N C S T ATG AAT TGC AGT ACC... M N C S T ATG AAT TGC AGC ACC... SNP 非同義置換 (non-synonymous coding) Moderate M N C I T ATG AAT TGC ATT ACC... 挿入 欠失 (INDEL) フレームシフト (frame-shift) 遺伝子領域以外の多型 High Modifier SNP M N W Q Y ATG AAT TGG CAG TAC C... 挿入 詳しくは を参照

58 変異解析結果 検出した変異の種類とその割合

59 変異解析結果 検出した変異の種類とその割合

60 結果を可視化 下のリンクをクリックすると IGV にマッピング結果と変異解析の結果を表示することができる IGV を使った解析は各自で行う

61 IGV (Integrative Genomics Viewer) IGV をダウンロードして適当な場所で解凍 IGV.bat をクリックして実行 リファレンスゲノムをダウンロード [Genomes]-[Load Genome From URL] から

62 IGV (Integrative Genomics Viewer) 変異解析 マッピング結果 遺伝子アノテーション

63 レポート課題について ウェブページにある レポート課題の進め方 をよく読む 割り当てられた株に関して以下を報告する アセンブリの推定ゲノム長 最長コンティグ長 N50 長 BEST195 に対するマッピング率 同定された変異の種類と数 Murasaki で計算した比較ゲノムの結果を使って トランスポゾン ( transposase で検索 ) を探す 遺伝子領域に入り込んで破壊していないかを調べる 比較ゲノムやリシークエンシングの結果を使って 納豆のねばねばに関係する遺伝子を中心に調べる

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