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のぶのすけいさやま
5 years ago
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1 背景ベンフォチアミンは脂溶性のビタミンB1 誘導体で生体内でのチアミンの利用率は水溶性ビタミンB1の約 5 倍と報告されている糖尿病合併症 ( 糖尿病性末梢神経障害腎症網膜症 ) の増悪を防ぐ効果および抗炎症作用抗酸化作用神経保護作用といった多数の作用を持つと報告されているしかし現在まで直接的な抗腫瘍作用についての報告はない今回高齢で標準治療の適応のない急性骨髄性白血病患者にベンフォチアミン単剤を投与したところ一過性ではあるが著明な芽球減少が認められた in vitro で芽球に対するベンフォチアミンの効果が確認できたため報告する

2 症例 [ 症例 ] 89 歳男性 [ 現病歴 ] 脳梗塞後遺症狭心症慢性腎不全にて当院胸部外科通院中であった 211 年 3 月ころより貧血の進行を認め当科紹介となったが骨髄検査の同意が得られず輸血のみにて経過観察中末梢血白血球数の著明な増加を認めた末梢血液像上前単球様芽球を8% 以上認めペルオキシダーゼ染色陰性ブチレート染色強陽性細胞表面抗原マーカー CD4,CD56,CD13,CD33,HLA-DR 陽性でありFAB 分類 AML(M5b) と診断された高齢であり軽度の認知症の合併もあり家族が化学療法は望まず支持療法目的に当院入院となった

3 表 1. 入院時検査所見 Blood count Serological test WBC Neu Lymph Mono Eo Baso Blast RBC Hb Ht Plt 1339/μl % 3.7% % % % 96.3% 286 1⁴ /μl 9.4g/dl 27.1% 3. 1⁴ /μl TP Alb T-Bil AST ALT ALP γ-gtp LDH BUN Cr UA Na K Cl Ca CRP 7.1g/dl 2.9g/dl.9mg/dl 71IU/l 27IU/l 143IU/l 14IU/l 1898IU/l 67mg/dl 4.8mg/dl 19.8mg/dl 142.3mEq/l 4.4mEq/l 11.4mEq/l 6.6mg/dl 1.54mg/dl

4 入院経過発熱性好中球減少症に対して前医より引き続き抗菌剤の投与を行い入院時よりベンフォチアミン ( ビオトーワ R )(25mg)1T/ 日の経口投与を開始した赤血球輸血 (LR2 単位 6 回 ) 血小板輸血(PC1 単位 2 回 ) を適宜施行した 38 度以上の発熱時サクシゾン R 1mgの静脈注射を施行した ( 計 6 回 ) 入院第 29 病日白血球数 326/μ l( 好中球数 4%) LDHは418と著明に低下し腎機能尿酸値の改善を認めた ( 図 1) その際本人家族の了承を得て骨髄検査を施行した骨髄穿刺所見では正形成で巨核球やや減少 3 系統に異形成はなく環状鉄芽球は認めなかった細胞表面抗原マーカーではCD4,CD56,CD33,HLA-DR 陽性の芽球を57% 認め染色体は2 細胞中 13 細胞に46,XY,add(1)(p32) 1 細胞に 47,idem,+8を認め正常核型は6 細胞であったその後第 35 病日にLDH563と上昇し末梢血の芽球増加を認めたためベンフォチアミンを2T/ 日に増量したところ 1 週間後にLDH27と減少したしかしその後ふたたび芽球上昇し LDH 上昇発熱も再燃し入院第 62 病日に死亡された

5 WBC, Blast ( /μl) 3 図 1 臨床経過 Benfotiamine (mg/day) 25 mg 5 mg WBC Blasts(R): PB 1 5 Blasts LDH(IU/l) Cr(mg/dl) UA (mg/dl) 211/11/4 Blasts(N): BM 12/19 212/1/13 2/13

6 目的ベンフォチアミンが白血病細胞に対して抗増殖作用をもつかどうか患者白血病細胞および既存の白血病細胞株にて検討する抗増殖作用を認めた場合その作用機序について検討するまたほかの抗がん剤との相互作用も検討する

7 方法細胞培養 : THP-1, K562,HL-6,TF-1 の細胞株は 1%FBS 入りの RPMI-164 で 5%CO2 濃度の条件にて培養した患者白血病細胞培養 : 患者と患者の家族の同意を得てまた金沢大学倫理委員会の承認を得て入院第 29 病日に骨髄細胞採取 (Blasts N) 入院第 6 病日に末梢血採取 (Blast R) し, 密度勾配遠心分離法を用いて 9% 以上の芽球を含む単核球分離を行い凍結保存した使用時トリパンブルー染色にて 9% 以上の生存率を確認し 2%FBS 入りの RPMI-164 に SCF(1ng/mL), GM-CSF(2ng/mL), 1%penicillin および streptomycin を加え培養したベンフォチアミン (Sigma) は 1%carboxymethylcellulose(Sigma) に 5mM の濃度で溶解保存され細胞株および患者白血病細胞は各濃度のベンフォチアミンを含む培養液とともに培養され -2 で保存されたコントロール細胞は 1%carboxymethylcellulose で希釈された細胞増殖は MTT アッセイを用いて測定し細胞傷害性が計算された薬剤の相互作用を調べるため combination index(ci) は CompuSym software program で計算された

8 方法 2 細胞周期解析とアポトーシス細胞老化解析 : 細胞周期解析は Becton Dickinson FACS flow cytometer にて測定ベンフォチアミンの有無による培養によるアポトーシス細胞を 7ADD/Annexin V 染色し細胞老化染色はベンフォチアミンとともに 48 時間培養後 β ー Galactosidase 染色キットを用いた Weastern blot 解析 : 全細胞溶解液に対する western blot 解析が施行され Phospho cdk2, total cdk2, cdk3, phospho CDC2, total CDC2, phospho- ERK1/2, Phospho JNK1/2, phospho AKT, cdk4, total p38, total ERK1/2, total JNK1/2, phpspho-p38, total p38, α -tubulin を検出した統計解析 : 全てのデータは平均値 ± 標準誤差で示されている 2 群間の比較には t-test を用い多群間比較には一元配置分散分析を用いた P.5 のとき統計学的に有意としたすべての統計分析には GraphPad Prism software package を使用した

9 Cell proliferation (inhibition rate) Cell proliferation (% of inhibition) 結果 1. ベンフォチアミンは患者白血病細胞と HL-6, K562 の増殖を妨げた MTT アッセイによりベンフォチアミンは用量依存的に骨髄採取された患者の白血病細胞の増殖を妨げたしかし終末期の白血病細胞に対してはその効果はなかったこれらの細胞毒性は K562, HL-6 においても認められたが TF-1 や THP-1 細胞株では見られなかった * * Benfotiamine ( M) Blasts(N) Blasts at diagnose Blasts(R) Blasts at relapse Benfotiamine ( M) * * * * p<.5 HL-6 K652 THP-1 TF-1

アポトーシス細胞の増加はみられなかった ( 図 2A) また細胞老化細胞の増加も見られなかった HL-6 を 72 時間培養したところプレートに接着したり

72 時間培養したところ形態学的に多数の小空胞が出現しており ( 図 2C)Autophagic vacuoles の可能性があり現在 western blot

10 図 2A 結果 2. アポトーシスおよび細胞老化分化に対する効果患者の骨髄白血病細胞 K562, HL-6 をベンフォチアミンとともに 96 時間まで培養したがアポトーシス細胞の増加はみられなかった ( 図 2A) また細胞老化細胞の増加も見られなかった HL-6 を 72 時間培養したところプレートに接着したり細胞増大など分化傾向を示す形態学変化は見られず CD14,CD11c の発現も見られなかった ( 図 2B) しかし患者の骨髄白血病細胞をベンフォチアミンとともに 72 時間培養したところ形態学的に多数の小空胞が出現しており ( 図 2C)Autophagic vacuoles の可能性があり現在 western blot 法にて LC3 抗体を検査中である HL6, 72hr Benfotiamine (μm) 5 1 図 2B Benfotiamine (μm) 5 1 図 2C Blast (N), 72hr, Giemsa 染色, 6X untreat Benfotiamine Benfotiamine +Hydrocortisone Hydrocortisone

MAPKp38 は患者の白血病細胞にて認められず ERK1/2, JNK1/2, AKT は発現が認められたベンフォチアミンは患者の白血病細胞

11 図 3 結果 3. MAPK の活性化に対する効果患者の白血病細胞 K562 TF-1 において ERK1/2, JNK1/2, MAPKp38,AKT の発現を調べたが, MAPKp38 は患者の白血病細胞にて認められず ERK1/2, JNK1/2, AKT は発現が認められたベンフォチアミンは患者の白血病細胞 K562 において用量依存的に ERK1/2 活性を阻害し, JNK1/2 活性を増加させたしかし TF-1 では変化はなかったまた AKT はベンフォチアミンの影響を受けなかった HL-6 では ERK1/2 活性はベンフォチアミンの影響をうけなかったが JNK1/2 活性が著明に増加した

12 結果 4. 細胞周期停止への誘導の効果ベンフォチアミンとともに 24 時間培養後患者の白血病細胞の G1 期の割合が有意に増加 ( 図 4A) K562, HL-6 においても認められたが同時に S 期と G2-M 期の割合の低下を伴っていた ( 図 4B) 一方 TF-1 や THP-1 細胞株で G1 期や S 期の割合の変化は見られなかった ( 図 4B) 図 4A *

13 図 4B % Cells % Cells % Cells % Cells Control Benfotiamine TF-1 G1 S G THP-1 G1 S G K HL G1 S G2 G1 S G2

結果 5. ベンフォチアミンによる細胞周期とアポトーシス関連タンパクの変化患者の骨髄白血病細胞で細胞周期関連タンパクの CDK3 の発現がベンフォチアミンにより低下したが終末期の患者の白血病細胞では低下は認められなかった ( 図 5) ベンフォチアミンによる CDK3

14 結果 5. ベンフォチアミンによる細胞周期とアポトーシス関連タンパクの変化患者の骨髄白血病細胞で細胞周期関連タンパクの CDK3 の発現がベンフォチアミンにより低下したが終末期の患者の白血病細胞では低下は認められなかった ( 図 5) ベンフォチアミンによる CDK3 の発現の低下は HL-6 でも認められたが THP-1 では認められなかったそのほかの Phospho cdk2, total cdk2, phospho CDC2, total CDC2 などはベンフォチアミンにより発現は変わらなかった ( 図 6) 図 5 Blasts(N) Blasts(R)

15 THP-1 HL-6 図 6 Benfotiamine (μm) 5 1 Benfotiamine (μm) 5 1 pcdc2 CDC2 pcdk2 CDK2 CDK3 Tubulin

16 結果 6. ベンフォチアミンはシタラビンの殺細胞効果を増加させる患者の骨髄白血病細胞 HL-6 をベンフォチアミンとシタラビンとともに培養したところシタラビンの増殖抑制効果が増加した ( 図 7) アイソボログラムを使い Conbination Index を計算したところベンフォチアミンは患者白血病細胞において相加的効果 ( 図 7A) HL-6 においては相乗効果を示した ( 図 7B)

17 Combination index Cell proliferation (% of inhibition) 図 7A 1 Patient s blasts 8 Benfotiamine 5 μm 6 4 No Benfotiamine Cytarabine ( M) y = ln(x) R² = Fa CI at ED5 = 1.11, additive effect

18 Combination index Cell proliferation (% of inhibition) 図 7B 1 HL-6 cells 8 6 Benfotiamine 5 μm 4 No Benfotiamine Cytarabine ( M) 2 y = -.875ln(x) R² = Fa CI at ED5 =.59, positive for synergism

19 総括ベンフォチアミンは 1. MTTアッセイにより患者白血病細胞とK562, HL-6の増殖を妨げた 2. 患者の白血病細胞 K562において用量依存的にERK1/2 活性を阻害し, JNK1/2 活性を増加させた HL-6では ERK1/2 活性は影響をうけなかったが JNK1/2 活性が著明に増加した 3. 細胞周期解析で患者白血病細胞およびK562, HL-6においてG1 期の割合を有意に増加させ同時に細胞周期関連タンパクのCDK3の発現の低下を認めた 4. シタラビンの殺細胞効果を増加させた患者白血病細胞において相加的効果 HL-6においては相乗効果を示した

20 総括 2 5. ベンフォチアミンと培養したところアポトーシス細胞の増加はみられず細胞老化細胞の増加もみられず HL-6では分化傾向もみられず形態学的変化よりオートファジー性細胞死が示唆された Western Blot 法にてLC3 抗体の発現を確認中である以上よりベンフォチアミンは白血病細胞にオートファジーを誘導し副作用がなく安価な抗ガン剤である可能性がある今後臨床経験を重ねて効果を確認する必要がある

21 細胞老化 Autophagyに対するご指導抗体等の供与を賜りました金沢大学大学院医薬保健総合研究科形態機能学佐々木素子准教授に深謝いたします筆頭発表者 : 演題発表に関連し開示すべき CO I 関係にある企業などはありません

1 8 ぜ表2 入院時検査成績 2 諺齢 APTT ALP 1471U I Fib 274 LDH 2971U 1 AT3 FDP alb 4 2 BUN 16 Cr K4 O Cl g dl O DLST 許皇磯二図1 入院時胸骨骨髄像低形成で異常細胞は認め

1 8 ぜ表2 入院時検査成績 2 諺齢 APTT ALP 1471U I Fib 274 LDH 2971U 1 AT3 FDP alb 4 2 BUN 16 Cr K4 O Cl g dl O DLST 許皇磯二図1 入院時胸骨骨髄像低形成で異常細胞は認め 1 8 ぜ表2 入院時検査成績 2 諺齢 APTT ALP 1471U I Fib 274 LDH 2971U 1 AT3 FDP 125 6 7 alb 4 2 BUN 16 Cr K4 O Cl g dl O 7 137 DLST 許皇磯二図1 入院時胸骨骨髄像低形成で異常細胞は認められない PAIgG 177 3ng 107 cell meq 1 砂糖水試験一 Fe 236 μg