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えつまさわい
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WHITE PAPER AQUIOS Tetra アプリケーションのゲーティング戦略リンパ球ゲーティングの課題 AQUIOS CLフローサイトメーターはリンパ球サブセットの分析と計数をシングルプラットフォーム技術 (SPT)

リンパ球ゲーティングとデータ解析によって生じる課題に対処することが可能となった日常サンプルについて一貫性のある迅速かつ簡単な分析が可能となることから多くの臨床検査室は日々の大量の T 細胞 B 細胞およびNK

フローサイトメトリーのデータ解析ゲートは目的とする細胞集団の周りに描かれた領域であり細胞の混合物からこれらの細胞を単離するために使用される簡単に言うとゲートは基本的には電子フィルタであるゲーティングは

更なる分析のために細胞を物理的に選別する必要がなくなるオペレーターは細胞形態細胞表面の蛍光細胞内マーカーの蛍光またはこれらの特性の組み合わせに基づいて細胞混合物に適用するゲートの特異性を選択するしかし

1 WHITE PAPER AQUIOS Tetra アプリケーションのゲーティング戦略リンパ球ゲーティングの課題 AQUIOS CLフローサイトメーターはリンパ球サブセットの分析と計数をシングルプラットフォーム技術 (SPT) にて行う SPTは単一の装置によって単一チューブから各リンパ球サブセットの絶対数と割合を測定するプロセスである (1,2) SPTの最近の進歩により AQUIOS CLフローサイトメーターはリンパ球ゲーティングとデータ解析によって生じる課題に対処することが可能となった日常サンプルについて一貫性のある迅速かつ簡単な分析が可能となることから多くの臨床検査室は日々の大量の T 細胞 B 細胞およびNK 細胞の分析にSPTを使い始めている種々のリンパ球の分析定量および測定を行うためにフローサイトメーターは細胞の種類の同定が可能なデータ分析方法を使用するこのプロセスはゲーティングと呼ばれるフローサイトメトリーのデータ解析ゲートは目的とする細胞集団の周りに描かれた領域であり細胞の混合物からこれらの細胞を単離するために使用される簡単に言うとゲートは基本的には電子フィルタであるゲーティングは特異性の異なる種々の電子フィルタをフローサイトメトリーデータに適用するプロセスである従ってゲーティングプロセスにより細胞の混合物から目的の種類の細胞サブセットを分析することが可能となるこの計算プロセスにより更なる分析のために細胞を物理的に選別する必要がなくなるオペレーターは細胞形態細胞表面の蛍光細胞内マーカーの蛍光またはこれらの特性の組み合わせに基づいて細胞混合物に適用するゲートの特異性を選択するしかし正確なリンパ球のゲーティングを行うには生物学的ばらつきサンプル調製法蛍光抗体の組合せの選択および機器変動など多くの因子が課題となる (3,4) 加えて純度と回収率はサブセットの割合と絶対数を計算する際に重要である従ってリンパ球サブセットの分析で種々の細胞の絶対数を取得し割合を計算するには装置がリンパ球ゲートを正確に確立できる必要がある

ゲートの確立にはいくつかのパラメータが使用される最も一般的な2つのゲーティングパラメータはいずれも光散乱パラメータである側方散乱 (SS) と前方散乱 (FS) である SSは細胞の顆粒性の相対尺度であり FSは細胞の大きさの相対尺度であるこれら2つの光散乱パラメータは細胞の形態のみに依存し蛍光染色には依存しないためゲートの作成に頻繁に使用される通常

2 ゲートの確立にはいくつかのパラメータが使用される最も一般的な2つのゲーティングパラメータはいずれも光散乱パラメータである側方散乱 (SS) と前方散乱 (FS) である SSは細胞の顆粒性の相対尺度であり FSは細胞の大きさの相対尺度であるこれら2つの光散乱パラメータは細胞の形態のみに依存し蛍光染色には依存しないためゲートの作成に頻繁に使用される通常 FSとSSを使用するゲートは単一パラメータのヒストグラム (FS) または2パラメータのドットプロット(FS vs SS) から作成される 2パラメータのドットプロットの例 (FS vs SS) については図 1を参照すること図 1. FS vs SS のドットプロット診断検査室ではゲーティングパラメータは手動あるいは複雑なアルゴリズムを用いるソフトウェア法を介して使用される従来のフローサイトメトリーによるリンパ球サブセットの分析は自動ゲーティングアルゴリズムによってまたは測定ソフトウェアを用いたオペレーターによる手動ゲーティングによって行うことができるしかしながらオペレーターは画面上でいくつかのパラメータを評価しなければならず同時にゲーティングは分析された細胞サブセットの正確性回収率および純度に対処しなければならないため手動ゲーティングは主観的かつ時間がかかりエラーを引き起こしやすい AQUIOS CLフローサイトメーターは正確で一貫性のある検査結果を生成しながらこれらの課題に対応するオペレーターを自動ゲーティングアルゴリズムでサポートする手動ゲーティングに加えて様々な要因がゲーティングに影響する可能性があるこれらの要因の一部はサンプルをフローサイトメーターに載せる前に影響を及ぼしている可能性があるゲーティングはモノクローナル抗体試薬の選択蛍光色素の選択試薬の品質管理蛍光補正および装置の品質管理ならびに分析に選択したパラメータとデータ処理後ゲーティング戦略により影響を受ける可能性がある Visualize the Possibilities 2

3 Beckman Coulter 社はこれらの問題を認識しており不均一な細胞集団の解析を向上簡略化するためにこれらの装置を標準化較正し試薬を最適化し試薬の品質を管理することによって装置が正確な結果を生成するため適切に設定されていることを証明する AQUIOS CLフローサイトメーターは定義されたモノクローナル試薬抗体パネルを標準化された分析プロトコルおよび自動制御ゲーティングアルゴリズムと組み合わせてヒューマンエラーを最小化することによりゲーティングの意思決定をより簡単にする従って AQUIOS CLフローサイトメーターのデータとアルゴリズムは免疫不全を有するまたはそれが疑われる患者の免疫学的評価のために正確な結果を生成することに寄与する AQUIOS TETRA 検査 AQUIOS CL フローサイトメーターはあらかじめ定義され十分に特徴付けられた検査を実行するように設計されている全血中の T リンパ球 B リンパ球および NK リンパ球の同定と計数を同時に行うことを目的とする Beckman Coulter 社の AQUIOS Tetra 検査は信頼性と精度について実証済みであり AQUIOS CL システムを補完する AQUIOS Tetra 検査は別々の抗原決定基またはその組み合わせを発現する細胞の表面にモノクローナル抗体が結合する能力に基づいている AQUIOS Tetra-1 パネル CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5 と AQUIOS Tetra-2+ パネル CD45- FITC/(CD56+CD16)-RD1/CD19-ECD/CD3-PC5モノクローナル抗体試薬はそれぞれ4 種または5 種のマウスモノクローナル抗体の組み合わせであり特定の蛍光色素が結合している各抗体は各細胞表面抗原に特異的である AQUIOS Tetra- 1パネルとAQUIOS Tetra-2+ パネルは個別にあるいはAQUIOS Tetra Combo 検査として連続して同時に測定することができる白血球の特異的染色は全血をモノクローナル抗体試薬とともにインキュベートすることによって行われるその後赤血球 (RBC) を溶血によって除去し残った白血球をフローサイトメトリーにより分析する正確なリンパ球数純度と回収率フローサイトメトリーにおける純度と回収率は常にゲーティングにおけるトレードオフの関係として存在するオペレーターが純度と回収率との間の適切なバランスを選択することが必要である免疫不全疾患の臨床管理では各白血球サブセットの細胞絶対数を正確にカウントし血液中の個々のサブタイプの割合を測定することが重要であるゲーティングしたリンパ球の純度は絶対数の正確性に影響する前方散乱 (FS)/ 側方散乱 (SS) ドットプロットでゲーティングすることによってリンパ球を同定し他の白血球から分離することができるしかしながら従来の光散乱による形態ゲートはリンパ球以外の白血球を多数含むサンプルでは信頼できない (5) Visualize the Possibilities 3

4 リンパ球ゲートの純度と回収率は明るい CD45( 汎白血球マーカー ) 蛍光と相対的に低い SS に位置するリンパ球をゲーティングすることによって大幅に向上させることができるこのゲーティング法は現在広く受け入れられて使用されており FS/SS と組み合わせて使用すると >95% のリンパ球ゲート純度および回収率を保証する (6) CD45/SSゲーティング法が光散乱の低下により伝統的なリンパ球散乱光ゲートを逃れるリンパ球を捕捉するのに十分でない症例もある生物学的ばらつきサンプル調製方法試薬および蛍光色素はリンパ球の光散乱特性低下の一因となる要素の一部であるリンパ球ゲートの正確性を高めるために Beckman Coulter 社は相対的細胞体積の尺度としてElectric Volume(EV) と呼ばれるパラメータを使用する AQUIOS CLフローサイトメーターにはこのパラメータが組み込まれており 2パラメータゲートでEV vs SSを使用してリンパ球をゲーティングするリンパ球サブセット解析ゲーティング戦略のレパートリーに追加されたこの追加ゲーティングパラメータは純度と正確性においてスピードとバランスをとるようにして総リンパ球の純度と回収率を向上させる AQUIOS CL フローサイトメーターではどのように行われているのか AQUIOS CLフローサイトメーターは T 細胞 B 細胞およびNK 細胞のクロスチェックにより純度と回収率の両方のバランスをとるように設計されている細胞の性質の一部はサンプル調製プロセスの間に改変され通常と異なるFSまたはSSのプロファイルが得られる (5) これにより特定のサブ集団のドットプロットの位置が予想と異なる場合があるそのためしばしば escapees (7,8) と呼ばれるこれらの細胞は従来のゲーティングでは見逃され偏った結果につながることがある典型的なフローサイトメーターでは全リンパ球が最初に同定された後 T 細胞 B 細胞 NK 細胞その他細胞の4つの主要なグループに分けられるこの方法の問題点はもし最初のリンパ球の定義が正しくなければその後の分類も正しくないことである従って CD45/SSグラフでリンパ領域を正しくゲーティングすることは正確な結果を得るために重要である小さな配置の誤差が結果に著しい影響を及ぼし得る AQUIOS CLフローサイトメーターはボトムアップでゲーティングを行う本サイトメーターは 4つの主要グループからリンパ球を構築することによって CD45/SSグラフにおけるリンパ領域の不正確なゲーティングの影響を最小限にするリンパ球と単球の境界が正しく配置されることが重要であるゲーティングが厳密すぎるとリンパ球の純度は良くなるが回収率が低下することになるゲーティングが緩すぎると回収率は良くなるがリンパ球の純度は低くなる純度と回収率の最適なバランスを得るため AQUIOS CLシステムではリンパ球の定義を緩和して回収率を最大化することおよび厳格なリンパ球の定義を作成して同時に純度を最大化することが可能となっているシステムは追加のリンパ球特異的マーカー (CD3とCD19) をサブセットを同定するゲートの緩い定義と組み合わせて使用する逆に NK 細胞等単球の導入により汚染されるリスクの高い細胞にはシステムはゲート定義を厳格化する escapees の影響を補正するために AQUIOS CLシステムは7つのパラメータを使用する Visualize the Possibilities 4

5 加えてシステムは FS と CD45 の 2 つの識別子を使用する分析で細胞がカウントされるには 2 つの識別子のうちいずれかを満たすだけでよいこれは非蛍光性や小さすぎる細胞を排除するのに役立つ escapees の捕捉と新たな Electronic Volume(EV) パラメータ生物は可変であるため従来の FS/SS リンパ球ゲートあるいは CD45/SS パラメータゲートですらデータセット内に存在するすべてのリンパ球を明らかにするには十分とは限らないこれらの行方不明のリンパ球細胞は escapees と呼ばれる escapees は伝統的なリンパ球ゲートで見落とされる原因となり得る特徴を有したリンパ球細胞である escapees はリンパ球ゲートの正確性と純度に影響する (7,8) escapees 現象はヒトリンパ球と活性化血小板および単球との凝集に起因するこれらの凝集体のサイズと粒度が大きいほどFSとSS 値が変化し凝集体は従来のリンパ球ゲートの外に存在することになるその結果凝集体は誤カウントされ絶対数が変わる複数の因子が凝集体の形成に寄与する主要な因子としてモノクローナル抗体の特異性とIgGサブクラス蛍光色素の種類モノクローナル抗体の結合溶血剤サンプル処理患者検体間における著しい変動等が挙げられるこれらの有害因子の多くは AQUIOS CLフローサイトメーターで利用できるようになった革新的技術の特徴によって軽減または排除することができるこれらの革新的な特徴としてあらかじめフォーマット済みのAQUIOS Tetraモノクローナル抗体試薬手動サンプル調製によるばらつきがない高度に自動化された採血管からの直接サンプル処理およびEVパラメータの追加が挙げられる EVは細胞粒度の影響を受けないため正確な細胞体積情報をもたらす (5) EVの測定はコールター原理に依拠する (9) EV 検出器は細胞の電気インピーダンスを測定することにより細胞体積を測定するそれは導電性のシース流体中で2つの電極を持つフローセルに細胞を通過させることによって機能する流体のインピーダンスは定義されており細胞がフローセル流路内に引き込まれるにつれて細胞の体積と等量の電解液が置換されるこれにより電極間のインピーダンスが変化するこの細胞パルスは細胞体積と直接相関する (5) EV パラメータと SS パラメータを使用して設定されたゲートはこれを用いなければ従来の FS/SS ゲートでは失われるリンパ球であっても回収することが可能である EV は一般的に相対サイズの解析に使用されており他の市販臨床用フローサイトメーターでは使用できない AQUIOS 固有のパラメータである Visualize the Possibilities 5

6 バランスと自動化 AQUIOS CLシステムソフトウェアの自動制御ゲーティングアルゴリズムはリンパ球の特異性純度および回収率をバランスよく考慮し高品質のデータを生成する本ソフトウェアシステムのこのユニークな能力は目的の細胞を探す場所を知る上で手動ゲート調整の必要性を最小限にすることができるレビュー / 編集権限および / または管理者権限を有するオペレーターは必要に応じて調整を行うことができるゲーティングの正確性の検証手順の詳細については AQUIOS Tetraシステムガイドの第 5 章の分析信頼性の確認を参照すること自動化と点検者 / 調整者の役割 AQUIOS CLフローサイトメーターはオペレーターがサンプルを迅速かつ簡単に測定することを可能にするしかしながら AQUIOS CLシステムのシンプルなワークフローの背後では高度なアルゴリズムが実行され目的の細胞サブセットを繰り返し追跡ゲートする結果はゲート領域に基づいて特定検査について自動的に生成される AQUIOS CLソフトウェアは何らかの異常を検出するとシステムおよびアプリケーション固有のフラグまたは通知を自動的に発する以下のいくつかの機能がこのような自動化を可能にしている分離指数 (SQ):Separation Quotient(SQ) と呼ばれる新たな計算指標は検査結果に関連したフラグと通知の生成に大きな役割を果たす SQは感度と特異性の相対的な尺度であり蛍光パラメータにおける陽性 vs 陰性の細胞集団サンプル vs デブリスまたはリンパ球 vs 単球等 2つの異なる集団の分離を示す指標として用いられる SQは迅速な分離推定方法として用いられパラメータ特異的であるため AQUIOS CLフローサイトメーターはサンプルを測定している際にリアルタイムでSQを計測する SS 等の特定パラメータのSQはあらかじめ定義されておりリアルタイムのチェックとバランスを取ることができるもしコントロール測定で問題が発生した場合においては標準設定範囲外のSQが算出されるとフラグまたは通知が発せられるコントロールの具体的な範囲については AQUIOS IMMUNO-TROLとAQUIOS IMMUNOTROL Lowのアッセイシートを参照することサンプルの測定については結果に影響する可能性のある異常の場合にフラグ / 通知が発せられるこれによりオペレーターは迅速に是正措置をとることが可能となる加えて SQが範囲外の場合は点検画面のドットプロットとヒストグラムにおいて細胞集団が事前設定された領域から外れることとなる臨床検査情報システム (LIS):LISは多くの臨床検査室の主要な構成要素となっている Beckman Coulter 社はその必要性を認識し AQUIOS CLフローサイトメーターを自動化に適するように設計した AQUIOS CLシステムは結果をLISに自動的に送信する機能を提供する AQUIOS CLシステムはフラグおよび通知のないすべての結果を自動的に送信するあるいはすべての結果を保持するように設定することができる注意 :QC の測定結果は LIS に転送されない Visualize the Possibilities 6

7 オペレーターは検査結果を LIS に自動送信することができるもののオペレーター / 管理者は結果の公開前にすべてのサンプルをレビューすることが望まれるこれは重要な臨床分析が正しく行われることを確実にするオペレーターが行う重要な点検の役割である LOAD & GOシステム : 本システムは矛盾をチェックするアルゴリズムを適用し矛盾が確認された場合はオペレーターに警告または通知を行う AQUIOS CLフローサイトメーターはLOAD & GOシステムであるためオペレーターはサンプルにフラグが付された場合にシステムからテキストメッセージまたは電子メールを受信することを選択できるレビュー / 編集または管理者権限を持つオペレーターのみがこれらのアルゴリズムで定義された領域を編集することができるこれらの警告フラグと通知は臨床検査室の環境においてAQUIOS CLフローサイトメーターを真のウォークアウェイ ( 現場待機不要 ) かつ信頼性の高い分析装置にする上で重要な役割を果たすゲーティングの調整 AQUIOS CLフローサイトメーターは手動でゲートを調整する必要性を最小限に抑える独自のアルゴリズムを使用してり各サンプルのゲーティングを自動的に行うフラグが付されているサンプルデータはレビュー画面で点検することができるしかしレビュー / 編集および / または管理者の権限を持つオペレーターが自身のニーズに応じてゲーティングを微調整する能力を必要とすることもある変更がファイルに保存されるとシステムはこれらの変更をUser Modifiedの通知としてタグ付けするこれらのステップの詳細な概要については AQUIOS Tetra システムガイドを参照すること許容できないゲートと領域の例を表 1 と表 2 に示す表 1. AQUIOS Tetra-1 と AQUIOS Tetra-2+ の詳細プロットにおける領域編集リンパ球ゲートは次の 2 つのプロットから定義される :SS Lin vs CD45 と SS Lin vs EV マウスを用いて領域をドラッグしまたは形を整えて明るい CD45+FITC 蛍光と低い SS を持つリンパ球を含めるように Lymphs(45) ゲートを編集する ( 許容可能な例を参照 ) この分析では単球 ( やや低めの CD45 発現と中程度の SS) と好塩基球 ( 低めの CD45 と低 SS) を極力排除しながらリンパ球を含めるマウスを用いてポインタをドラッグし低中 SS を持つリンパ球を含めるように Lymphs(EV) ゲートを編集する ( 許容可能な例を参照 ) この分析では単球と好塩基球を極力排除しながらリンパ球を含める Visualize the Possibilities 7

8 注意 : 時折 CD45 ゲートが緩く設定されるがこれは EV 対 SS 領域が正しく描画される限り許容可能である表 2. リンパ総 CD3 ヒストグラム許容可能な例に示すように CD3+ 集団を包含するためにリージョンの境界を全 CD3+ ヒストグラム上に設定する Visualize the Possibilities 8

9 分析アルゴリズムの概要これに関する詳細については AQUIOS Tetra システムガイドの第 2 章分析アルゴリズム概要の項を参照すること AQUIOS TETRA ゲーティング戦略の概要サンプル中の単球および顆粒球はフローサイトメーター上の適切なリンパ球ゲーティングにより除外することができる (11) AQUIOS CL システムでは特異性と正確性を確保するためにいくつかの方法が使用されている 1. AQUIOS Tetra システムソフトウェアは CD45+ EV 光散乱特性および蛍光パラメータ (FL1 FL4) に基づいてリンパ球ゲートを自動的に確認し最適化するよう設計されている 2. 追加的な鑑別パラメータとして EV を使用することは他の白血球および / またはデブリス / ノイズからのリンパ球分離に役立つ 3. AQUIOS Tetra ソフトウェアは陽性ピークと陰性ピークの分離に基づいて自動的にカーソルを配置することおよびその差異を計測することによりリンパ球への非特異的抗体結合を監視するこのプロセスによりアイソタイプコントロールの必要性がなくなる AQUIOS のゲーティング戦略はリンパ球集団を捕捉しリンパ球サブセットを計測する AQUIOS システムは FS( 相対サイズ ) SS( 顆粒性 ) 蛍光パラメータ (FL1 FL4) ならびに EV パラメータ ( 相対細胞体積 ) を使用して各集団を分離するゲーティングの詳細については AQUIOS CL フローサイトメーターの使用説明書の第 6 章を参照すること Visualize the Possibilities 9

10 結論 AQUIOS CL フローサイトメーターは自動サンプル調製自動 QC および患者サンプル分析を統合することによりサンプル調製分析およびゲーティングといった従来のフローサイトメーターにおける課題が大幅に改善されている AQUIOS CL システムはゲーティングとデータ解析を簡略化する自動制御ソフトウェアを使用するシステムである AQUIOS CL システムの革新的なゲーティング戦略は : 再現性のある正確なリンパ球サブセットの計数をもたらす EV パラメータを統合し検体中の様々なリンパ球集団を捉えるリンパ球の純度と回収率へのバランスのとれたアプローチを提供する臨床における免疫学的マーカー診断の標準化に役立つ免疫学的マーカー診断プロセスのあらゆる段階で全面的なゲーティングソリューションを提示する AQUIOS CL フローサイトメーターを使用することにより従来のフローサイトメトリーにおいて必要であった手動および繰り返し作業の数が最小化されるため AQUIOS のオペレーターは経験があまりなくともシステム使用方法の迅速な習得効率的な運用および一貫した正確な結果を得ることが可能となる Visualize the Possibilities 10

11 参考文献 1. Centers for Disease Control and Prevention. Guidelines for performing single platform absolute CD4+ T cell determinations with CD45 gating for persons infected with human immunodeficiency virus. MMWR, 2003:52 (No. RR 2): CDC: 1997 Revised Guidelines for Performing CD4+ T Cell Determinations in Persons Infected with Human Immunodeficiency Virus (HIV). MMWR 1997; 46 (RR 2); Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Maecker HT, McCoy JP, Nussenblatt R. Nat Rev Immunol Feb 17; 12(3): doi: /nri Koepke JA and Landay AL. Precision and accuracy of absolute lymphocyte counts. Clin Immunol Immunopathol, 1989; 52: Givan A.L. Flow Cytometry First Principles. 2nd ed. Wiley-Liss, Inc. New York, NY Nicholson JKA, Hubbard M and Jones BM. Use of CD45 fluorescence and side scatter characteristics for gating lymphocytes when using the whole blood lysis procedure and flow cytometry. Cytometry (Communications in Clinical Cytometry), 1996; 26: Reduction of escapee formation in flow cytometric analysis of lymphocyte subsets. Prince HE, York J, Kuttner DK. J Immunol Methods Dec 28; 177(1 2): Analysis of factors contributing to the formation of mononuclear cell aggregates («escapees») in flow cytometric immunophenotyping. Gratama JW, van der Linden R, van der Holt B, Bolhuis RL, van de Winkel JG. Cytometry Nov 1;29(3): Coulter, Wallace H., (1953). Means for counting particles suspended in a fluid, Patent number: H42 A2 CLSI: Enumeration of Immunologically Defined Cell Populations by Flow Cytometry: Approved Guideline 2nd Edition Nicholson JKA, Hubbard M Jones BM. Use of CD45 fluorescence and side scatter characteristics for gating lymphocytes when using the whole blood lysis procedure and flow cytometry. Cytometry (Communications in Clinical Cytometry), 1996; 26: Visualize the Possibilities 11

12 頭字語 SPT: シングルプラットフォーム技術 FS: 前方散乱 SS: 側方散乱 EV(Electric Volume): 細胞電気抵抗法により測定された細胞体積 SQ(Separation Quotient): 分離指数 LIS: 臨床検査情報システム QC: 精度管理商標について Beckman Coulter ロゴおよび Load & Go は Beckman Coulter, Inc. の商標である AQUIOS CL はクラス 1 レーザー製品である

-. -. CD Threshold Noise Discrimination CD CDbight+ CDdim CD は

-. -. CD Threshold Noise Discrimination CD CDbight+ CDdim CD は CD34 JCCLS H3-P V1.0 Report of the Hematology Standardization Committee Guidelines for CD34+ Cell Determination by Flow CytometryJCCLS H3-P V1.0 日本臨床検査標準協議会血液検査標準化検討委員会フローサイトメトリーワーキンググループ Japanese Committee