遺伝子解析法による微生物同定法

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1 遺伝子解析法による微生物同定法 - レジオネラ属菌の生菌迅速検出法を例にとって 年 9 月 11 日防菌防黴学会第 40 回年次大会タカラバイオ ( 株 ) 吉崎美和

2 本日の内容 遺伝子解析法について 遺伝子解析法の種類と用途 遺伝子解析法の特徴 PCR による生菌検出法について EMA-PCR 法の原理 LC EMA-qPCR 法によるレジオネラ生菌検出 遺伝子解析法の活用例 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 2

3 遺伝子とは バクテリア (O157 サルモネラ セレウス菌等 ) DNA: デオキシリボ核酸 遺伝子 DNA 相補結合 A T C G DNA 二重らせん構造 4 種の物質 拡大 A T C G アデニンチミンシトシングアニン 細菌ゲノムや毒素遺伝子は 4 種物質の並び配列が異なり 固有配列をもつ領域がある その固有配列を検出することで特定の微生物検出ができる 拡大 4 種の物質からなるポリマー ( 重合体 ) C G G T A G G T A G C C A T C C A T 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 3

4 培養や生理試験による同定 細菌 グラム陽性 グラム陰性 桿菌球菌桿菌 らせん菌球菌 有芽胞 好気嫌気 無芽胞 好気嫌気 有芽胞 無芽胞 好気 嫌気 好気 発酵 嫌気 非発酵 弾力性 剛直 運動性抗酸性非運動性非抗酸性カタラーゼありカタラーゼなし極毛運動性周毛非運動性極毛運動性周毛非運動性 好気ベーシックマスター微生物学 ( オーム社 ) より一部改変して引用 嫌気 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 4

5 培養法による検出 Species Specific es c な手法 細菌 A 増菌培養 選択増菌培養 分離培養 同定試験 細菌 B 増菌培養 選択増菌培養 分離培養 分離培養 同定試験 細菌 C 選択増菌培養 分離培養 同定試験 細菌 D 増菌培養 選択増菌培養 選択増菌培養 分離培養 同定試験 検出対象の菌種によって 使用する培地や手順が異なる 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 5

6 遺伝子解析法による検出 1 対象菌種 1 種類 検出目的の菌種が1 種類に特定される場合 Universal な手法 解析手法 PCR やリアルタイム PCR 法による対象菌種特異的な検出 PCR 1 3 qpcr 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 6

7 遺伝子解析法による検出 2 対象菌種 数種類 状況から数種の菌種に絞り込める場合 遺伝子解析はUniversalな手法 複数の菌種を同じ手法で検出可能 解析手法 PCR やリアルタイム PCR 法による対象菌種特異的な検出 複数の PCR 反応で複数菌種を同時検出 あるいは Multiplex PCR でも 大腸菌 赤痢菌 サルモネラ菌 リステリア菌 黄色ブドウ球菌 大腸菌赤痢菌サルモネラ菌黄色ブドウ球菌 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 7

8 遺伝子解析法による検出 3 対象菌種 数 10 種類 ~ 食中毒菌全般など 解析手法 各種アレイ技術を応用して多数の菌種をスクリーニング Primer Array Microarray 例えば リアルタイムPCR 用のプライマーを配置 最大 96 種を同時検出 マイクロアレイなら 数万のターゲットをスクリーニング可能 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 8

9 単一菌種の検出からスクリーニングまで 複数種の病原体を一括してスクリーニング可能 Multiplex PCR Primer Array 次世代シーケンス PCR Primer Set Micro Array 1 ~5 ~16 ~96 ~ 数万 << 検体数 ターゲット数 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 9

10 特定遺伝子から集団まで 遺伝子の類似性で規定できる集団は 一括検出可能 < 病原因子 > ex. ベロ毒素 < 属 > ex. Legionella 属菌 < 種 > ex. C. jj jejuni < 代謝活性等 > < 集団 > ex. 一般細菌 < 科 > ex. 腸内細菌科菌群 PCR/qPCR 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 10

11 遺伝子解析法による同定 対象菌種 --(Unknown) 対象菌種を絞り込めない場合 遺伝子解析はUniversal な手法 対象菌種を特定できない場合や未知の菌種も解析可能 解析手法 Ribosomal RNA 領域の配列解析による微生物種の推定 このコロニーは何? 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 11

12 遺伝子解析法による菌株の識別 16S rrna (Sequence, Mass) 遺伝子配列の詳細情報を利用 近縁種や菌株の識別は難しい すると菌株の識別も可能 パルスフィールドゲル電気泳動 (PFGE) 制限酵素処理後 電気泳動を行い 泳動パタ泳動パターンを比較する MLVA(Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) の数を比較する MLST (Multi Locus Sequence Typing) 複数の遺伝子領域の配列情報を解析する Sequence Type (ST) を同定 PFGE のようなフラグメント解析とは異なり 客観性が高く 情報の共有が容易 また 系統解析も可能 16S rrna VNTR MLST 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 12

13 遺伝子解析法のまとめ 検出 病原性 薬剤耐性 特異的遺伝子 PCR/qPCR 病原因子 PCR/qPCR rrna 領域 Sequence 同定 全ゲノム PFGE 菌株識別 Repeat 配列 MLVA Housekeeping 遺伝子 MLST (Sequence) 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 13

14 主な遺伝子解析手法 PCR/Real time PCR 病原因子遺伝子の検出 シーケンス対象領域の増幅 制限酵素処理 / 電気泳動 パルスフィールドゲル電気泳動ルドゲル電気泳動 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism シーケンス解析 16S rrna 配列解析による菌種の推定 MLST による菌株の識別 遺伝子解析手法の多くは これらの組み合わせ Universal な方法で 多様な菌種の解析に対応可能 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 14

15 遺伝子解析法の特徴 長所 迅速 簡便 客観的 多種類の菌種を同時に検査できる 遺伝子配列の詳細な解析により 菌種や菌株の識別も可能 短所 通常 生菌と死菌を区別することはできない 毒素量などを測定することはできない 生菌 死菌 生きていても 死んでいても DNA は存在する どちらも PCR 結果は陽性 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 15

16 PCR による生菌検出法 EMA PCR 法 について EMA PCRは PCRにより生菌を選択的に検出できる画期的な方法です Live or Dead?? 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 16

17 EMA-PCR 法とは? EMA とは? Ethidium monoazide 可視光の光照射により DNA に共有結合するインターカレート色素 EMA-PCR 法とは? EMA の生菌と死菌への作用の違いを利用して PCR により生菌由来 DNAを選択的に検出する方法 2003 年に Nogva HK らが報告 (Biotechniques.;34(4): ) 細菌に対してEMA 処理を行うと 生菌では 細胞膜に阻まれてEMAは菌内部に浸透しない 細胞膜が損傷している死菌には EMA が浸透する つまり 死菌のDNAのみEMAによる修飾を受け PCR 増幅不能となる 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 17

18 EMA-PCR 法の原理 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 18

19 EMA-PCR 法の実験例 : 生菌選択的な検出 ( エンドポイント PCR) E. coli 生菌および死菌について EMA 処理の効果を確認 M M M:pHY Marker 1: 生菌 EMA 処理 (+) 2: 生菌 EMA 処理 (-) 3: 死菌 EMA 処理 (+) 4: 死菌 EMA 処理 (-) 5: Negative Control E. coli 生菌または死菌 :2 10^7 個 EMA 処理 (Viable Bacteria Selection Kit 使用 ) DNA 抽出 (NucleoSpin Tissue XS 使用 ) PCR 検出 (TaKaRa Ex Taq HS 使用 ) 増幅サイズ :1002bp EMA 処理により 死菌由来の DNA 増幅が抑制され 生菌のみが検出された 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 19

20 EMA-PCR 法の実験例 : 死菌の抑制効果 ( リアルタイム PCR) レジオネラ死菌について EMA 処理の効果を確認 EMA 処理 (-) 40 EMA( ) EMA(+) Ct 値 EMA 処理 (+) 菌数 (Log 10) レジオネラ死菌 :4 10^1~ 4 10^7 個 EMA 処理 (Viable Bacteria Selection Kit 使用 ) DNA 抽出 (NucleoSpinl Tissue XS 使用 ) qpcr 検出 (CycleavePCR Legionella (5S rrna) Detection Kit Ver.2.0 使用 ) 少なくとも 4 10^4 個の死菌由来 DNA の増幅を完全に抑制できることが確認された 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 20

21 EMA-PCR 法の実験例 : 生菌への影響評価 ( リアルタイム PCR) レジオネラ生菌について EMA 処理の影響を確認 EMA 処理 (-) 40 EMA( ) EMA(+) Ct 値 EMA 処理 (+) 菌数 (Log 10) EMA 処理による検出感度の低下は認められなかった レジオネラ生菌 :4 10^1~ 4 10^7 個 EMA 処理 (Viable Bacteria Selection Kit 使用 ) DNA 抽出 (NucleoSpin Tissue XS 使用 ) qpcr 検出 (CycleavePCR Legionella (5S rrna) Detection Kit Ver.2.0 使用 ) 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 21

22 さらに確実かつ高感度に LC EMA qpcr 法 について ~レジオネラ属菌生菌迅速検出法への応用 ~ 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 22

23 LC EMA-qPCR 法とは? LC EMA-qPCR 法 2 日間で結果判定が 濃縮 EMA 処理による死菌由来の PCR 増幅抑制 酸処理 液体培養 (Liquid Culture) (18 時間 ) できます! 液体培養 (LC) による生菌の選択的増殖 EMA 処理 (30 分 ) DNA 抽出 (30 分 ) リアルタイム PCR (90 分 ) リアルタイムPCRと2つの技術 1 液体培養 (LC: Liquid Culture) による生菌の選択的増殖 2 EMA 処理による死菌由来 DNAからのPCR 増幅抑制を組み合わせた確実かつ高感度な 生菌遺伝子迅速検査法 です 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 23

24 LC EMA-qPCR 法の原理 Liquid Culture による生菌の増殖 Dead EMA 処理による死菌の抑制 Live Detection Limit Liquid Culture (18 h) EMA 処理 生菌は 液体培養により増殖し EMA 処理では変化しない 死菌は 液体培養により増殖せず EMA 処理で抑制される 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 24

25 レジオネラ純培養菌を用いたモデル実験 レジオネラ生菌 (1, 10 2, 10 4 cfu/ µl) レジオネラ死菌 (1, 10 2, 10 4 cfu/ µl) 95 2 分 液体培養 (18 h) EMA 処理 DNA 抽出 qpcr 培養前 (0 h) 培養後 (18h h ) EMA 処理後 (18 h+) 液体培養による生菌増殖率 EMA 処理による死菌抑制効果 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 25

26 液体培養と EMA 処理の効果 液体培養による生菌の増殖 EMA 処理による死菌の抑制 生菌 死菌 ^ ^4 Ct 35 10^2 1 Ct 35 10^ h 18h 18h+ 45 0h 18h 18h+ 液体培養 EMA 処理 Dead Live 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 26

27 評価試験結果のご紹介 厚生労働科学研究費補助金 ( 健康安全 危機管理対策総合研究事業 ) 公衆浴場等におけるレジオネラ属菌対策を含めた総合的衛生管理手法に関する研究研究代表者倉文明国立感染症研究所細菌第一部主任研究官 分担研究報告書 液体培養 (Liquid Culture)EMA qpcr 法を用いたレジオネラ生菌迅速検査法の検討 研究分担者 烏谷竜哉 愛媛県立衛生環境研究所 荒井桂子 横浜市衛生研究所 磯部順子 富山県衛生研究所 緒方喜久代 大分県衛生環境研究センター 八木田健司 国立感染症研究所 寄生動物部 研究協力者 泉山信司 国立感染症研究所 寄生動物部 矢崎知子 宮城県保健環境センター 金谷潤一 富山県衛生研究所 吉崎美和 タカラバイオ ( 株 ) ドラゴンジェノミクスセンター 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 27

28 評価試験結果 1 アメーバ培養レジオネラを用いた検量線 厚生労働科学研究費補助金 ( 健康安全 危機管理対策総合研究事業 ) 公衆浴場等におけるレジオネラ属菌対策を含めた総合的衛生管理手法に関する研究分担研究報告書より引用 <レジオネラ1 CFU 当りのコピー数 > 液体培養前 12コピー 18 時間培養後 270コピー EMA 処理後 100コピー 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 28

29 評価試験結果 2 浴槽水等における平板培養法との比較 (1) qpcr LC EMA qpcr LC qpcr 0h(EMA ) (log CFU/100ml) LC EMA qpcr (0h, EMA ) y = x R² = ) 18h(EMA+) (lo og CFU/100ml LC qpcr LC EMA qpcr (18h, EMA+) y = x R² = Plate count (log CFU/100ml) Plate count (log CFU/100ml) 厚生労働科学研究費補助金 ( 健康安全 危機管理対策総合研究事業 ) 公衆浴場等におけるレジオネラ属菌対策を含めた総合的衛生管理手法に関する研究分担研究報告書より引用 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 29

30 評価試験結果 2 浴槽水等における平板培養法との比較 (2) 浴槽水等 113 件について 平板培養法と LC EMA qpcr 法を比較 LC EMA qpcr 法の定量結果について 5 CFU/100 ml 以上を陽性とすると 感度 95.5% 特異度 75.4% の良好な結果が得られた 厚生労働科学研究費補助金 ( 健康安全 危機管理対策総合研究事業 ) 公衆浴場等におけるレジオネラ属菌対策を含めた総合的衛生管理手法に関する研究分担研究報告書より引用 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 30

31 レジオネラ属菌の遺伝子検出法のまとめ 検査法迅速性生菌選択性用途 平板培養法 標準法 qpcr 衛生状態の把握など * EMA qpcr 迅速スクリーニング検査など LC EMA qpcr 迅速スクリーニング検査など < 使い分けのポイント > 平板培養法が標準法であるのに対し 遺伝子検査法は その迅速性を活かして スクリーニング検査等への利用が期待されている * 死菌の検出については衛生の不備と解釈することで 結果を管理に反とで 結果を管理に反映させることが可能である ( 第 3 版レジオネラ症防止指針より ) 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 31

32 タカラバイオにおけるシーケンスデータ量推移タ量推移 >600 Gb ( シーケンスデータ量 / RUN) FLX SOLiD GAIIx >30 Gb 3 機種稼働 3Gb HiSeq >60 Gb 遺伝子解析センター 0.05Mb ドラゴンジェノミクスセンター設立 5Mb MPSS 受託開始 17Mb GS20 受託開始 100 Mb TGCA- NGS 微生物 November 29,

33 次世代シーケンサーによる遺伝子解析 検出 特異的遺伝子 PCR/qPCR 病原性 薬剤耐性病原因子 PCR/qPCR 次世代シーケンサーなら すべての解析をカバーできる 病原因子を包括的に検出 rrna 領域 Sequence 同定 より正確かつ高精度な識別が可能に Repeat 配列 MLVA 全ゲノム PFGE 菌株識別 Housekeeping 遺伝子 MLST (Sequence) 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 33

34 次世代シーケンサーの実用例 1 腸管出血性大腸菌 O104 O104:H4による欧州での大規模感染 2011 年にドイツを中心に発生 HUS 発症患者の割合が高く 死亡者は 53 名に上った 感染源はスプラウトとされている 原因菌の解析 次世代シーケンサーにより 3 日で draft sequence が得られ さらに 2 日後には first assemblyが完了 これらの配列情報を解析した結果 原因菌は新規のO104:H4 変異株で Stx2 遺伝子を持つファージの感染により毒素産生性を獲得したと推測された Nat Rev Genet Sep;13(9): 次世代シーケンサーにより 原因菌の病原性因子等を迅速に特定 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 34

35 Future direction メタゲノム解析 増菌培養などを行わず 検体に含まれるすべての DNA を解析する 次世代シーケンサーの進化 低コスト化 Throughputの向上 解析技術の発展 培養なしでの解析 培養が困難な菌の検出 菌叢解析 Nat Rev Genet Sep;13(9): 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 35

36 まとめ < 遺伝子解析法 > 解析目的 手法 検出 スクリーニング PCR, Real time PCR など New! EMA PCR 法による生菌検出 病原因子の検出 菌種の推定 菌株の識別 PCR, Real time PCR など 16S rrna 解析など MLST, PFGE など New! 次世代シーケンサーによる包括的な解析 Simple で Universal な解析法であるが故に 適 不適もある 過信もせず 毛嫌いもせず 目的に適した手法を上手く活用するのがコツ 2013 防菌防黴学会 TaKaRa Bio 2013/9/11 36

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