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1 2.6 緒言, 非臨床試験の概要文及び概要表 ( 薬理 ) ミノドロン酸水和物リカルボン錠 1 mg/ ボノテオ錠 1 mg 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 緒言 薬理試験の概要文 薬理試験概要表 小野薬品工業株式会社 / アステラス製薬株式会社 2.

2 目次 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 緒言 薬理試験の概要文 まとめ 効力を裏付ける試験 副次的薬理試験 安全性薬理試験 薬力学的薬物相互作用試験 考察及び結論 図表 薬理試験概要表 63

3 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 緒言 ミノドロン酸水和物 ( 図 ) はビスホスホン酸骨格 (P-C-P 結合 ) の側鎖にイミダゾピ リジン基を有するビスホスホネートであり, 破骨細胞の機能を抑制することにより骨吸収抑制作用を示す. N HO O P OH N O P OH OH OH H 2 O 図 ミノドロン酸水和物の構造式 ビスホスホネートは無機ピロリン酸の構造類似体であり, ピロリン酸が有する P-O-P 結合を生体内でより安定な P-C-P 結合に置換した基本構造を有する. この基本構造の炭素原子に結合する側鎖を修飾した化合物の中には強力な骨吸収抑制能を有するものが見出されており, これまでに様々なビスホスホネートが合成されている 1). ビスホスホネートは化学構造的に骨組織の構成成分であるハイドロキシアパタイトに高い親和性を示し 1), 全身性に投与されたビスホスホネートは骨に集積することが知られている 1,2). そのため, 破骨細胞が骨を溶解すると, ビスホスホネートが骨から遊離して破骨細胞に取り込まれ 1,3), その骨吸収能を抑制するものと考えられている. ビスホスホネートは側鎖に窒素原子を有するか否かにより大別されるが 1,4), 窒素原子を有するビスホスホネートの骨吸収抑制作用は破骨細胞内でのメバロン酸代謝経路におけるファルネシルピロリン酸 (FPP) 合成酵素の阻害作用に起因することが最近の研究により明らかになってきた 1,4-6). すなわち, 窒素原子含有ビスホスホネートが FPP 合成酵素を阻害すると, 破骨細胞内において FPP から生合成されるゲラニルゲラニルピロリン酸量が低下することにより低分子量グアノシン三リン酸 (GTP) 結合タンパク質の機能が抑制される. 低分子量 GTP 結合タンパク質は破骨細胞の機能発現に必須であるため, 本酵素の阻害は破骨細胞に機能抑制や細胞死を誘導し, 結果として骨吸収が抑制されると考えられている 1,4-7). 骨粗鬆症は骨量が低下するとともに骨質が劣化し骨折を生じやすくなった病態であり, 閉経後骨粗鬆症や老人性骨粗鬆症などの原発性骨粗鬆症とステロイド性骨粗鬆症などの続発性骨粗鬆症に分類されている 8-11). いずれの型の骨粗鬆症においても骨吸収と骨形成のバランスが崩れ相対的に骨吸収が優位になった結果として, 骨量が低下し, 骨強度は低下する. ビスホスホネートは骨吸収を抑制することで骨吸収と骨形成のバランスを改善し, 骨量や骨強度の増加をもたらす 12-14). このような背景から, 一部のビスホスホネートが骨粗鬆症の治療薬として既に臨床 - 1 -

4 において使用されている. ミノドロン酸水和物は骨粗鬆症治療薬として本邦で開発された化合物である. 今回, 本邦申請にあたり, 本薬の薬理学的, 薬物動態学的及び毒性学的特徴を明らかにする目的で各種試験を実施し, ミノドロン酸水和物錠であるリカルボン錠 1 mg 及びボノテオ錠 1 mg の製造販売承認申請を行うに至った. 参考文献 1) Fleisch H. Bisphosphonates in bone disease. From the laboratory to the patient. 4th ed. San Diego (CA): Academic Press; 2: ) Sato M, Grasser W, Endo N, Akins R, Simmons H, Thompson DD, et al. Bisphosphonate action. Alendronate localization in rat bone and effects on osteoclast ultrastructure. J Clin Invest 1991;88: ) Russell RG, Rogers MJ. Bisphosphonates: From the laboratory to the clinic and back again. Bone 1999;25: ) Rogers MJ, Gordon S, Benford HL, Coxon FP, Luckman SP, Monkkonen J, et al. Cellular and molecular mechanisms of action of bisphosphonates. Cancer 2;88: ) Dunford JE, Thompson K, Coxon FP, Luckman SP, Hahn FM, Dale Poulter C, et al. Structure-activity relationships for inhibition of farnesyl diphosphate synthase in vitro and inhibition of bone resorption in vivo by nitrogen-containing bisphosphonates. J Pharmacol Exp Ther 21;296: ) van Beek E, Pieterman E, Cohen L, Löwik C, Papapoulos S. Farnesyl pyrophosphate synthase is the molecular target of nitrogen-containing bisphosphonates. Biochem Biophys Res Commun 1999;264: ) Ito M, Amizuka N, Nakajima T, Ozawa H, Ultrastructural and cytochemical studies on cell death of osteoclasts induced by bisphosphonate treatment. Bone 1999;25: ) Lane JM, Riley EH, Wirganowicz PZ. Osteoporosis: Diagnosis and treatment. J Bone Joint Surg Am 1996;78: ) Riggs BL, Melton LJ III. Clinical heterogeneity of involutional osteoporosis: Implications for preventive therapy. J Clin Endocrinol Metab 199;7: ) Ettinger MP. Aging bone and osteoporosis: strategies for preventing fractures in the elderly. Arch Intern Med 23;163: ) Reid IR. Glucocorticoid osteoporosis- mechanisms and management. Eur J Endocrinol 1997;137: ) Cranney A, Wells G, Willan A, Griffith L, Zytaruk N, Robinson V, et al. Meta-analysis of alendronate for the treatment of postmenopausal women. Endocr Rev 22;23: ) Cranney A, Tugwell P, Adachi J, Weaver B, Zytaruk N, Papaioannou A, et al. Meta-analysis of risedronate for the treatment of postmenopausal osteoporosis. Endocr Rev 22;23:

5 14) Emkey R, Delmas PD, Goemaere S, Liberman UA, Poubelle PE, Daifotis AG, et al. Changes in bone mineral density following discontinuation or continuation of alendronate therapy in glucocorticoid-treated patients. Arthritis Rheum 23;48:

6 2.6.2 薬理試験の概要文 本項で使用した用語及び略号を表 に示す. 表 用語及び略号一覧 用語及び略号 内容 A375 ヒト悪性黒色腫細胞 ARH-77 ヒト骨髄腫細胞 AUC - 時間 から無限時間まで外挿した血漿中濃度 - 時間曲線下面積 BCE 骨コラーゲン相当量 BFR/BS 骨形成速度 ( 骨面 ); 骨形成速度 / 骨面 BV/TV 骨量 ; 骨量 / 組織量 CK クレアチンキナーゼ CK-B クレアチンキナーゼ B 型サブユニット CK-BB クレアチンキナーゼ BB 型アイソザイム CK-MB クレアチンキナーゼ MB 型アイソザイム Cmax 最高血漿中濃度 CTX I 型コラーゲン架橋 C-テロペプチド DMSO ジメチルスルホキシド DXA 法 二重エネルギー X 線吸収法 ES/BS 吸収面 ; 吸収面 / 骨面 FOH ファルネソール FPP ファルネシルピロリン酸 GGOH ゲラニルゲラニオール GTP グアノシン三リン酸 HEK293 ヒト胎児腎臓細胞 HepG2 ヒト肝癌細胞 herg ヒト ether-a-go-go 関連遺伝子 IC 5 5% 抑制濃度 L-Ot. N/T-Ot. N 標識オステオンの割合 ; 標識オステオン数 / 総オステオン数 μct 像 マイクロフォーカス X 線コンピュータ断層像 MAR 骨石灰化速度 max. dp/dt 左心室内圧最大立ち上がり速度 MDA-231 ヒト乳癌細胞 N. Oc/BS 破骨細胞数 ; 破骨細胞数 / 骨面 NTX I 型コラーゲン架橋 N-テロペプチド Oc. S/BS 破骨細胞面 ; 破骨細胞面 / 骨面 OHX 卵巣子宮摘出術 O. Th 類骨幅 pqct 法 末梢型コンピュータ断層法 SCID 重症複合免疫不全 SXA 法 単一 X 線吸収法 Tb. N 骨梁数 Tb. Th 骨梁幅 TRAPase 酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ - 4 -

7 まとめミノドロン酸水和物は破骨細胞による骨吸収を抑制することにより, 骨粗鬆症モデル動物における骨密度及び骨強度の低下を抑制する. 今回の本邦申請にあたり, 本薬の in vitro 及び in vivo における骨吸収抑制作用, 作用機序, 作用部位, 骨石灰化に及ぼす影響, 副次的薬理試験として癌の骨病変モデル動物における骨吸収抑制作用, 安全性薬理に関する作用及び骨粗鬆症治療薬との併用作用を検討した. 以下に, 本薬の効力を裏付ける試験, 副次的薬理試験, 安全性薬理試験及び薬力学的薬物相互作用試験の成績をまとめる. 効力を裏付ける試験骨吸収抑制作用ミノドロン酸水和物, リセドロネート及びアレンドロネートの in vitro における骨吸収抑制作用をウシ骨スライス上でのウサギ破骨細胞培養系を用いて検討した. ミノドロン酸水和物は本薬を破骨細胞の培養時に添加した場合においても, 本薬で骨スライスを前処置した後に破骨細胞を培養した場合のいずれにおいても, 骨吸収の指標である培養液中 I 型コラーゲン架橋 C-テロペプチド (CTX) 濃度を濃度依存的に低下させた. その 5% 抑制濃度 (IC 5 ) 値はそれぞれ.66 及び.11 μm であり, リセドロネートの IC 5 値 ( いずれも.35 μm) 及びアレンドロネートの IC 5 値 ( それぞれ 1.7 及び.89 μm) と比較して低値であった. ラット卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおいてミノドロン酸水和物, リセドロネート及びアレンドロネートを卵巣摘出の翌日から 1 日 1 回 12 週間反復経口投与し, 骨密度及び骨代謝マーカーに対する作用を検討した. ミノドロン酸水和物 (.16,.8 及び.4 mg/kg/day), リセドロネート (.4,.2 及び 1 mg/kg/day) 及びアレンドロネート (.4,.2 及び 1 mg/kg/day) は腰椎においてはそれぞれ.8,.4 及び.2 mg/kg/day 以上の用量, また大腿骨においてはそれぞれ.8,.2 及び.2 mg/kg/day 以上の用量で骨密度の低下を抑制し, ミノドロン酸水和物が最も低用量から作用した. また, ミノドロン酸水和物の.4 mg/kg/day 投与群におけるこれらの部位の骨密度は偽手術群と同程度であった. 更に, ミノドロン酸水和物, リセドロネート及びアレンドロネートはそれぞれ.4,.2 及び.2 mg/kg/day 以上の用量で骨吸収マーカーである尿中デオキシピリジノリン濃度の上昇を抑制し, 骨吸収マーカーに対してもミノドロン酸水和物が最も低用量から作用した. また, 脛骨近位骨幹端部の海綿骨領域での骨形態計測においても, ミノドロン酸水和物は最も低用量から吸収面, 破骨細胞面及び破骨細胞数を減少させ, 骨量及び骨梁数の減少を抑制した. ミノドロン酸水和物, リセドロネート及びアレンドロネートは骨形成速度を低下させ, 骨石灰化の指標である骨石灰化速度を低下させたが, 類骨幅も減少させた. 同モデルにおいてミノドロン酸水和物を卵巣摘出の翌日から, 前述の試験より長期の 12 カ月間にわたり 1 日 1 回反復経口投与し, 骨密度, 骨強度, 骨代謝マーカー及び骨形態に対する作用を検討した. 本薬 (.6,.3 及び.15 mg/kg/day) はいずれの用量においても腰椎及び大腿骨骨密度の低下を抑制し,.3 mg/kg/day における腰椎骨密度は偽手術群と同程度であった. また, 本薬はいずれの用量においても腰椎椎体圧迫強度及び大腿骨骨幹部 3 点折り曲げ強度の低 - 5 -

8 下を抑制し, 骨密度と骨強度には正の相関がみられた. 更に, 本薬はいずれの用量においても尿中デオキシピリジノリン濃度及び骨形成マーカーである血清中オステオカルシン濃度の上昇を抑制し, 卵巣摘出により亢進した骨代謝回転を低下させた. 一方, 腰椎椎体海綿骨領域における骨形態計測の結果, 本薬は.3 mg/kg/day 以上の用量で骨量, 骨梁幅及び骨梁数の減少を抑制した. また, 本薬はいずれの用量においても破骨細胞面及び破骨細胞数の増加を抑制した. 更に, 本薬は未石灰化骨基質層の厚さである類骨幅を減少させた. 同モデルにおいてミノドロン酸水和物を卵巣摘出後 12 週から治療的に 1 日 1 回 12 カ月間反復経口投与し, 骨密度, 骨強度, 骨代謝マーカー及び骨形態に対する作用を検討した. 本薬 (.6,.3 及び.15 mg/kg/day) はいずれの用量においても腰椎及び大腿骨骨密度の低下を抑制した. また, 本薬はいずれの用量においても大腿骨骨幹部 3 点折り曲げ強度の低下を抑制するとともに,.15 mg/kg/day の用量で腰椎椎体圧迫強度の低下を抑制し, いずれの部位においても骨密度と骨強度には正の相関がみられた. 更に, 本薬は.6 あるいは.3 mg/kg/day 以上の用量において尿中デオキシピリジノリン濃度の上昇を抑制し,.3 mg/kg/day 以上の用量で血清中オステオカルシン濃度を低下させた. 一方, 腰椎椎体海綿骨領域における骨形態計測の結果, 本薬はいずれの用量においても骨量及び骨梁数の減少を抑制するとともに,.3 mg/kg/day 以上の用量で骨梁幅の減少を抑制した. また, 本薬はいずれの用量においても破骨細胞面及び破骨細胞数の増加を抑制し, 骨形成の指標である骨形成速度を低下させた. 更に, 本薬はいずれの用量においても骨石灰化速度を低下させたが,.3 mg/kg/day 以上の用量で類骨幅を減少させた. カニクイザル卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおいてミノドロン酸水和物及びアレンドロネートを卵巣摘出の翌日から 1 日 1 回 17 カ月間反復経口投与し, 骨密度, 骨強度, 骨代謝マーカー及び骨形態に対する作用を検討した. ミノドロン酸水和物 (.15 及び.15 mg/kg/day) はいずれの用量においても腰椎骨密度の低下を抑制し,.15 mg/kg/day の用量で腰椎椎体及び大腿骨頸部の圧迫強度の低下を抑制した. また, 腰椎椎体及び大腿骨骨幹部において, 骨密度と骨強度には正の相関がみられた. 更に, ミノドロン酸水和物はいずれの用量においても骨吸収マーカーである尿中 I 型コラーゲン架橋 N-テロペプチド (NTX) 及びデオキシピリジノリン濃度, 並びに骨形成マーカーである血清中オステオカルシン及び骨型アルカリホスファターゼ濃度の上昇を抑制した. 腰椎椎体海綿骨領域における骨形態計測の結果, ミノドロン酸水和物はいずれの用量においても吸収面の増加を抑制し,.15 mg/kg/day の用量で破骨細胞面及び破骨細胞数を減少させた. また, ミノドロン酸水和物はいずれの用量においても骨形成速度を低下させた. 骨石灰化の指標に関しては, 本薬は骨石灰化速度を低下させたが, 類骨幅の増加を抑制した. 脛骨近位骨幹端部海綿骨領域における骨形態計測の結果, ミノドロン酸水和物は吸収面の増加を抑制しなかったが, いずれの用量においても骨形成速度の増加を抑制した. 骨石灰化の指標に関しては, 本薬は骨石灰化速度の増加を抑制したが, 類骨幅に影響を与えなかった. 更に, 脛骨骨幹部のオステオンにおける骨形態計測の結果, ミノドロン酸水和物は.15 mg/kg/day の用量で骨形成速度の増加を抑制した. アレンドロネート (.5 mg/kg/day) も骨吸収抑制作用を示し, 腰椎骨密度の低下及び腰椎椎体の圧迫強度の低下を抑制するとともに, 骨密度と骨強度には正の相関がみられた

9 イヌ卵巣子宮摘出及びカルシウム制限食給餌骨粗鬆症モデルにおいてミノドロン酸水和物を卵巣子宮摘出後 1 カ月から 1 日 1 回 12 カ月間反復経口投与し, 骨密度, 骨強度及び骨形態に対する作用を検討した. 本薬 (.2,.1 及び.5 mg/kg/day) はいずれの用量においても腰椎椎体及び大腿骨骨密度の低下を抑制し, 腰椎椎体の圧迫強度の低下を抑制した. 腰椎椎体海綿骨領域における骨形態計測の結果, 本薬はいずれの用量においても破骨細胞面を減少させ, 破骨細胞数の増加を抑制した. また, 本薬は骨石灰化速度の増加を抑制したが, 類骨幅の増加を抑制した. ラット不動性骨粗鬆症モデル ( 坐骨神経切除 ) においてミノドロン酸水和物, リセドロネート及びアレンドロネートを神経切除の翌日から 1 日 1 回 4 週間反復経口投与し, 骨密度に対する作用を検討した. ミノドロン酸水和物 (.6,.3 及び.15 mg/kg/day) は.3 mg/kg/day 以上の用量で脛骨近位骨幹端部の骨密度低下を抑制し,.3 mg/kg/day における骨密度は偽手術群と同程度であった. リセドロネート (1 mg/kg/day) 及びアレンドロネート (1 mg/kg/day) も脛骨近位骨幹端部の骨密度の低下を抑制した. また, ラット不動性骨粗鬆症モデル ( 上腕神経切除 ) においてミノドロン酸及びリセドロネートを神経切除の翌日から 1 日 1 回 2 週間反復経口投与し, 骨乾燥重量に対する作用を検討した. ミノドロン酸 (.3,1,3 及び 1 mg/kg/day) 及びリセドロネート (1,3 及び 1 mg/kg/day) はそれぞれ 1 及び 1 mg/kg/day 以上の用量で上腕骨の乾燥重量の低下を抑制した. ラットステロイド性骨粗鬆症モデルにおいてミノドロン酸水和物, リセドロネート及びアレンドロネートをコハク酸プレドニゾロンナトリウムの投与開始日から 1 日 1 回 12 週間反復経口投与し, 骨密度及び骨強度に対する作用を検討した. ミノドロン酸水和物 (.6,.3 及び.15 mg/kg/day ) はいずれの用量においても腰椎及び大腿骨骨密度の低下を抑制し,.3 mg/kg/day における骨密度は正常群と同程度であった. また, ミノドロン酸水和物は.15 mg/kg/day の用量で腰椎椎体における骨強度の低下を抑制し, 骨密度と骨強度には正の相関がみられた. リセドロネート (1 mg/kg/day) 及びアレンドロネート (1 mg/kg/day) も腰椎及び大腿骨骨密度の低下を抑制し, リセドロネートに関する腰椎での一部の解析を除き, いずれの薬物においても腰椎及び大腿骨骨幹部で骨密度と骨強度には正の相関がみられた. 作用機序窒素原子含有ビスホスホネートは破骨細胞内のファルネシルピロリン酸 (FPP) 合成酵素を阻害し, 破骨細胞内において FPP から生合成されるゲラニルゲラニルピロリン酸量を低下させることによって破骨細胞に機能抑制や細胞死をもたらし骨吸収抑制作用を示すと考えられていることから, メバロン酸代謝経路の酵素に対するミノドロン酸水和物の阻害作用を検討した. 本薬はカニクイザル肝臓から調製した FPP 合成酵素を濃度依存的に阻害し, その IC 5 値は.81 μm であった. 既存のビスホスホネートであるゾレドロン酸水和物及びパミドロネートも同様に FPP 合成酵素を阻害し, その IC 5 値はそれぞれ.13 及び.61 μm であった. 一方, ミノドロン酸水和物はヒト肝癌細胞 HepG2 から調製したスクアレン合成酵素に対しても阻害作用を示し, その IC 5 値は 5.3 μm であった

10 ウサギ破骨細胞培養系においてミノドロン酸水和物の骨吸収抑制作用に及ぼすメバロン酸代謝経路の関連物質の影響を検討した. ミノドロン酸水和物 (.3 μm) により培養液中 CTX 濃度は低下し, ゲラニルゲラニオールはこの低下作用を減弱させた. 一方, ファルネソール及びスクアレンはミノドロン酸水和物の作用に影響を及ぼさなかった. ミノドロン酸水和物のクレアチンキナーゼ (CK) 遊離作用をウサギ破骨細胞培養系において検討した. ミノドロン酸水和物 (.3,1 及び 3 μm) を前処置したウシ骨スライス上で破骨細胞を培養したところ, 本薬はいずれの濃度においても骨吸収マーカーである培養液中の CTX 濃度を低下させるとともに培養液中の CK 活性を上昇させ,1 μm 以上で破骨細胞数を減少させた. 一方, バフィロマイシンを処置し破骨細胞内へのミノドロン酸の取り込みを阻害すると, 本薬単独で認められた培養液中の CK 活性上昇及び破骨細胞数の減少は抑制された. 正常ラットにミノドロン酸水和物を単回経口投与し, 経時的に大腿骨の電子顕微鏡観察を行った. 本薬 1 mg/kg の投与により, 破骨細胞が骨と接着する部位である明帯の構造及び破骨細胞が明帯の内側に作る特殊な細胞膜である波状縁が不明瞭となり, 破骨細胞に形態変化が誘導された. また, 一部の破骨細胞にアポトーシスが誘導されている像が観察された. これらのことから, 本薬は破骨細胞の細胞骨格系に作用し, 破骨細胞に機能抑制や細胞死を誘導することにより, 骨吸収能を低下させると考えられた. 作用部位ミノドロン酸水和物の骨との結合及び解離に関する性質並びに骨組織内の局在を検討した. In vitro において, 14 C-ミノドロン酸 (1 μm) は時間依存的にウシ骨スライスに結合し, 反応開始後 5 時間以降はほぼ一定の結合量であった. 骨スライスに結合した 14 C-ミノドロン酸は ph2.5 以下の緩衝液で処理すると骨スライスから解離した. In vivo において, ヒト悪性黒色腫細胞 A375 を左心室より移植したラットに 14 C-ミノドロン酸水和物を 1 mg/kg 単回静脈内投与し, 大腿骨における局在をミクロオートラジオグラフィーにより解析した. その結果, 非転移部においては, 投与後 2 時間では, 海綿骨及び皮質骨の表面に放射能が検出され, その局在は吸収面, 形成面及び休止面のいずれにおいても認められ, 更に多くの破骨細胞に放射能が検出された. 投与後 1 及び 3 日では, ほぼすべての破骨細胞に放射能が検出された. 一方, 骨芽細胞, 骨髄細胞及び骨細胞には投与後 7 日まで放射能は検出されなかった. 転移部における結果も非転移部と同様であった. 骨石灰化に及ぼす影響正常ラットにミノドロン酸水和物を 1 日 1 回 2 週間反復経口投与し, 骨石灰化に及ぼす影響を検討した. 脛骨のマイクロフォーカス X 線コンピュータ断層像 (μct 像 ) を観察したところ, ミノドロン酸水和物 (.1,.1,1 及び 1 mg/kg/day) は.1 mg/kg/day 以上の用量で海綿骨量を増加させたのに対して, 骨石灰化障害の指標として測定した骨端軟骨板の幅に関してはいずれの用量においても影響を及ぼさなかった. 一方, エチドロネート (3,1,3 及び 1 mg/kg/day) は骨量増加作用と骨石灰化障害作用の発現用量が乖離していなかった

11 ラット腓骨骨折モデルにおいて, ミノドロン酸水和物を骨折前 4 週から骨折後 8 週まで 12 週間, また骨折前 4 週間のみあるいは骨折後 8 週間のみ 1 日 1 回反復経口投与し, 骨折治癒に及ぼす影響を検討した. 本薬 (.3 及び.3 mg/kg/day) は.3 mg/kg/day の用量を骨折前後に投与した場合には仮骨量の増加は明らかでなく,.3 mg/kg/day の用量を骨折後 ( 骨折前後あるいは骨折後のみ ) に投与した場合には骨折修復過程において仮骨の吸収遅延により仮骨量を増加させる傾向を示したが, 骨折部位の骨強度を増加させた. また, 同モデルにおいて, ミノドロン酸水和物及びアレンドロネートを骨折前 4 週から骨折後 8 週まで 1 日 1 回 12 週間反復経口投与し, 骨折治癒に及ぼす影響を検討した. ミノドロン酸水和物 (.3 及び.3 mg/kg/day) は本試験ではいずれの用量においても仮骨及び軟骨の吸収遅延により仮骨量を増加させる傾向を示したが, 骨強度には影響を与えなかった. 一方, アレンドロネート (1 及び 1 mg/kg/day) はいずれの用量においても仮骨及び軟骨の吸収遅延により仮骨量を増加させる傾向を示し, 骨折部位の骨強度を増加させた. 副次的薬理試験ヒト骨髄腫細胞 ARH-77 を左心室より移植した骨髄腫マウスにおいて, ミノドロン酸水和物を 1 日 1 回 2 週間反復経口投与し骨密度に対する作用を検討した. 本薬 (.3,.3 及び 3 mg/kg/day) は.3 mg/kg/day 以上の用量で腰椎骨密度の低下を抑制した. また, ヒト乳癌細胞 MDA-231 を左心室より移植した骨転移マウスにおいて, ミノドロン酸水和物を 1 日 1 回 1 週間反復経口投与し, 破骨細胞に対する作用を検討した. 本薬 (.3,.3 及び 3 mg/kg/day) は.3 mg/kg/day 以上の用量で大腿骨骨転移部位における単位骨面当りの破骨細胞数及び破骨細胞接触面の増加を抑制した. 安全性薬理試験コアバッテリー試験ミノドロン酸水和物 (.3,3 及び 3 mg/kg) は単回経口投与によりラットの中枢神経系に対して影響を及ぼさなかった. ヒト ether-a-go-go 関連遺伝子 (herg) チャネルを介するカリウム電流に対して本薬 (.3,3 及び 3 μm) は 3 μm で抑制作用が最も強く, その抑制率は 15.8% であった. 一方, 本薬 (.3,3 及び 3 μm) はモルモット摘出乳頭筋の活動電位に対し影響を及ぼさなかった. また, 本薬 (.3,3 及び 3 mg/kg) は無麻酔イヌの心血管系及び呼吸器系に対して影響を及ぼさなかった. 胃粘膜及び消化管機能に対する作用臨床において既存のビスホスホネートは胃腸障害を起こすことが知られていることから, 正常ラットの胃粘膜に対するミノドロン酸水和物の作用を検討した. 本薬 (3,1,3,1 及び 3 mg/kg) は 3 mg/kg の単回経口投与において, 投与後 3 日にラットの胃粘膜障害スコアを有意に増加させた. また, 本薬経口投与後 4 時間における胃粘膜障害作用を検討したところ, 本薬 (3 及び 1 mg/kg) は 1 mg/kg の単回投与により出血性損傷面積を有意に増加させた

12 次に, 胃粘膜障害モデルにおける作用を検討したところ, 本薬 (3,1 及び 3 mg/kg) の単回経口投与はインドメタシン胃損傷に対し有意な影響を及ぼさなかった. また, 本薬 (1,3 及び 1 mg/kg/day) は 1 日 1 回 1 週間の反復経口投与により 3 mg/kg/day 以上で酢酸胃潰瘍の治癒を有意に遅延させた. 更に, 詳細に検討するため ex vivo 試験を実施したところ, チャンバーで固定した胃内に本薬 (1,3 及び 1 mg/kg) を投与すると,3 mg/kg 以上で胃粘膜電位差が有意に低下するとともに胃管腔内からの酸の消失 ( 酸の逆拡散 ) が有意に亢進し,1 mg/kg 投与後 9 分に出血性損傷面積が有意に増加した. 消化管機能として腸管内水分量及び胃排泄能に対する作用を検討したところ, 本薬 (2,5 及び 1 mg/kg) は 1 mg/kg の単回経口投与において, 有意な腸管内水分量増加作用及び胃排泄能抑制作用を示した. アレンドロネート (2,5 及び 1 mg/kg) は 2 mg/kg 以上の単回経口投与において, 腸管内水分量を有意に増加させ, 同用量のミノドロン酸水和物投与群と比べて高値を示した. また, アレンドロネートは 1 mg/kg では胃排泄率を有意に低下させ, ミノドロン酸水和物投与群と比べて低値を示した. 更に, アレンドロネートの胃排泄能抑制作用は投与液量を 1 ml/kg から 1 ml/kg に減量することにより増強した. 食道通過能既存のビスホスホネートであるアレンドロネートは食道など上部消化管局所で副作用が発現することが知られている. この可能性を低下させるため, 錠剤を速やかに胃内へ到達させることが重要であるとされていることから, イヌを用いてミノドロン酸水和物の臨床試験使用製剤 (1 mg 錠 ) とアレンドロネート製剤 (,5 mg 錠 ) の食道通過能を検討した. 覚醒イヌの口腔内に錠剤を置き, その後 5 分に,5 あるいは 1 ml の水とともに嚥下させ, 錠剤が食道に残存しているか否かを内視鏡にて確認した.,5 及び 1 ml の飲水後の食道残存率は ミノドロン酸水和物製剤がそれぞれ 9%,3% 及び %, アレンドロネート錠がそれぞれ 1%,9% 及び 3% であり, 両製剤は飲水量の増加に伴い残存率が低下したが, アレンドロネート錠の残存率の方が高値であった. また, イヌ摘出食道粘膜を用いた検討においても, ミノドロン酸水和物 製剤は 5 例中 4 例が 5 秒以内に食道粘膜全長を通過したのに対し, アレンドロネート錠は 5 例全例が 3 分経過しても全長を通過しなかった. 泌尿器系に対する作用ミノドロン酸水和物 (1,1 及び 3 mg/kg) を単回経口投与し, ラットの尿量, 尿中電解質排泄量及び尿 ph に及ぼす影響を検討したところ, 本薬の作用と考えられる変化は認められなかった. 一般薬理試験として実施した試験では, 本薬をラットへ単回経口投与 (1,1 及び 3 mg/kg) したところ,1 mg/kg 以上の用量で尿 ph の上昇又は低下, 尿中カリウム排泄量の増加又は減少, 尿量, 尿中ナトリウム排泄量及び尿中クロライド排泄量の減少が認められた. また, 単回静脈内投与 (.1,.1 及び 1 mg/kg) においては,.1 mg/kg で尿の ph の低下,1 mg/kg で尿中クロライド排泄量の減少が認められたが, これら尿排泄に対する作用は用量依存性が認められ : 新薬承認情報提供時に置き換え

13 ないか, あるいは用量依存性が認められた場合でも一過性の変化であった. 一般薬理試験ミノドロン酸水和物 (.1,.1 及び 1 mg/kg) を単回静脈内投与した結果,.1 mg/kg でマウスの体温を一過性に低下させたが, 軽度の変動であり用量依存性も認められなかった. また, 本薬 (.1,.1,1,1 及び 1 μm) はアセチルコリン及び塩化バリウムによるモルモット摘出回腸収縮をそれぞれ 1 μm 以上及び.1 μm で増強したが, いずれも軽度の変動であり用量依存性も認められなかった. その他の中枢神経系, 呼吸循環器系, 自律神経系及び血液凝固系に対して本薬は影響を及ぼさなかった. 薬力学的薬物相互作用試験骨粗鬆症治療薬との併用作用 In vitro のウサギ破骨細胞培養系において, 骨吸収の指標である培養液中 CTX 濃度に対するミノドロン酸水和物とビタミン K 2 薬であるメナテトレノンの併用作用を検討した. ミノドロン酸水和物 (.5 μm) 及びメナテトレノン (3 及び 1 μm) はそれぞれ単独で培養液中 CTX 濃度を低下させた. ミノドロン酸水和物と 1 μm のメナテトレノン両薬を培地に添加したところ, それぞれの単独処理に比べて培養液中 CTX 濃度を更に低下させた. ラット卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおいて, ミノドロン酸水和物 (.3 mg/kg/day) 及びビタミン D 3 薬であるアルファカルシドール (.2 及び.4 μg/kg/day) をそれぞれ卵巣摘出の翌日から 1 日 1 回 12 週間反復経口投与し, 骨密度低下抑制に対する併用作用を検討した. ミノドロン酸水和物 (.3 mg/kg/day) 及びアルファカルシドール (.2 及び.4 μg/kg/day) は単独で腰椎骨密度の低下を抑制した. それらを併用したところ, それぞれの単独投与時に比べて腰椎骨密度の低下を更に抑制した

14 効力を裏付ける試験 骨吸収抑制作用 破骨細胞培養系における骨吸収抑制作用 添付資料 ウサギ長管骨から調製した破骨細胞をウシ骨スライス上で培養するウサギ破骨細胞培養系において, ミノドロン酸水和物, リセドロネート及びアレンドロネートの in vitro における骨吸収抑制作用を検討した. 蒸留水 ( 対照群 ), ミノドロン酸水和物 (.3,.1,.3,1,3 及び 1 μm), リセドロネート (.1,.3,1,3,1 及び 3 μm) あるいはアレンドロネート (.3,1,3,1, 3 及び 1 μm) は培養液に添加し, 破骨細胞を 3 日間培養した. 培養液中に遊離したコラーゲン分解産物である CTX 濃度を骨吸収の指標として測定した. また, これらの薬物で約 17 時間, 前処理した骨スライス上で破骨細胞を 3 日間培養し, 培養液中 CTX 濃度を測定した. ミノドロン酸水和物は, 培養液中に薬物を添加した場合, 薬物で骨スライスを前処理した場合のいずれにおいても培養液中の CTX 濃度を濃度依存的に低下させた ( 図 ). その IC 5 値はそれぞれ.66 及び.11 μm であり, リセドロネートの IC 5 値 ( いずれも.35 μm) 及びアレンドロネートの IC 5 値 ( それぞれ 1.7 及び.89 μm) と比較して低値であった ( 表 ). A: 薬物を培養液に添加 B: 薬物で骨スライスを前処理 培養液中 CTX 濃度 (nm) ミノドロン酸水和物 4 リセドロネートアレンドロネート 対照群 濃度 (μm) 培養液中 CTX 濃度 (nm) 1 ミノドロン酸水和物 リセドロネート アレンドロネート 対照群 濃度 (μm) 図 ウサギ破骨細胞の骨吸収 ( 培養液中 CTX 濃度 ) に対するビスホスホネートの作用 A: 薬物を培養液に添加,B: 薬物で骨スライスを前処理図中の各点は 6 例の平均値 ± 標準誤差を示す. : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,williams の多重比較検定 ). ( 添付資料 : ウサギ骨組織由来破骨細胞, 図 1 及び 3 を改変 ) 表 ウサギ破骨細胞の骨吸収 ( 培養液中 CTX 濃度 ) に対するビスホスホネートの作用 IC 5 値 (μm) 処理条件 薬物を培養液に添加薬物で骨スライスを前処理 括弧内は 95% 信頼区間を示す. 被験薬物 ミノドロン酸水和物 リセドロネート アレンドロネート (.41~.95) (.28~.42) (1.4~2.).11 (.81~.14) ( 添付資料 : ウサギ骨組織由来破骨細胞, 表 1 及び 2 を改変 ).35 (.25~.47).89 (.49~1.4)

15 ラット卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける作用 ラット卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける予防効果 (12 週間投与 ) 添付資料 両側卵巣を摘出した成熟雌性ラットの骨密度に対するミノドロン酸水和物, リセドロネート及びアレンドロネートの作用を検討した.1.5 w/v% メチルセルロース水溶液 ( 偽手術群及び対照群 ), ミノドロン酸水和物 (.16,.8 及び.4 mg/kg/day), リセドロネート (.4,.2 及び 1 mg/kg/day) 及びアレンドロネート (.4,.2 及び 1 mg/kg/day) は卵巣摘出の翌日から 1 日 1 回 12 週間反復経口投与した. 投与開始後 12 週に第 3~5 腰椎及び右大腿骨を摘出し, 二重エネルギー X 線吸収法 (DXA 法 ) により骨密度を測定した. また, 投与開始後 12 週において, 骨吸収マーカーである尿中デオキシピリジノリン濃度及び骨形成マーカーである血清中オステオカルシン濃度を測定した. 対照群では第 3~5 腰椎及び右大腿骨における骨密度が低下したが, ミノドロン酸水和物, リセドロネート及びアレンドロネートは第 3~5 腰椎においてはそれぞれ.8,.4 及び.2 mg/kg/day 以上の用量で, また右大腿骨においてはそれぞれ.8,.2 及び.2 mg/kg/day 以上の用量で骨密度の低下を抑制し, ミノドロン酸水和物が最も低用量から抑制作用を示した ( 図 ). また, ミノドロン酸水和物の.4 mg/kg/day 投与群におけるこれらの部位の骨密度は偽手術群と同程度であった. 骨代謝マーカーを測定した結果, 尿中デオキシピリジノリン濃度は対照群で上昇し, ミノドロン酸水和物はこの上昇を.4 mg/kg/day の用量で抑制した ( 図 ). リセドロネート及びアレンドロネートも.2 mg/kg/day 以上の用量で尿中デオキシピリジノリン濃度の上昇を抑制したが, ミノドロン酸水和物が最も低用量から抑制作用を示した. 一方, 血清中オステオカルシン濃度は対照群で低下し, ミノドロン酸水和物及びアレンドロネートは影響を及ぼさなかったが, リセドロネートは.2 mg/kg/day 以上の用量で更に低下させた. 骨梁構造並びに骨吸収及び骨形成の指標を右脛骨近位骨幹端部の海綿骨領域で検討した結果, 対照群では骨量, 骨梁幅及び骨梁数が減少し, ミノドロン酸水和物は骨量及び骨梁数の減少を.8 mg/kg/day 以上の用量で抑制したが, 骨梁幅の減少は抑制しなかった ( 表 ). リセドロネート及びアレンドロネートも骨量及び骨梁数の減少をそれぞれ.4 及び.2 mg/kg/day 以上の用量で抑制したが, 骨梁幅の減少は抑制しなかった. 骨吸収の指標に関して, 対照群では吸収面及び破骨細胞面が増加したが, 破骨細胞数は変化しなかった. ミノドロン酸水和物, リセドロネート及びアレンドロネートはそれぞれ.16,.4 及び.4 mg/kg/day 以上の用量で, いずれの骨吸収指標も低下させた. 骨形成の指標に関して, 対照群では骨形成速度は変化しなかったが, ミノドロン酸水和物, リセドロネート及びアレンドロネートはそれぞれ.4,.4 及び.2 mg/kg/day 以上の用量で骨形成速度を低下させた. また, 骨石灰化速度及び未石灰化骨基質層の厚さである類骨幅は対照群では変化しなかったが, ミノドロン酸水和物, リセドロネート及びアレンドロネートはそれぞれ.8,.2 及び.2 mg/kg/day 以上の用量で骨石灰化速度を低下させたが, それぞれ.4,.4 及び.2 mg/kg/day 以上の用量で類骨幅も減少させた

16 A : 腰椎 (L3-L5) B : 右大腿骨 腰椎骨密度 ( mg/cm 2 ) ミノドロン酸水和物リセドロネートアレンドロネート (11) 右大腿骨骨密度 ( mg/cm 2 ) ミノドロン酸水和物リセドロネートアレンドロネート (11) 1 偽手術群対照群 用量 ( mg/kg/day po ) 95 偽手術群対照群 用量 ( mg/kg/day po ) 図 ラット卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける (A) 第 3~5 腰椎及び (B) 右大腿骨の骨密度に対するビスホスホネートの作用図中の各点は 11~12 例 (11 例のみ図中に例数を示した ) の平均値 ± 標準誤差を示す. : 偽手術群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,williams の多重比較検定 ). ( 添付資料 : 卵巣摘出 F344/DuCrj ラット, 雌, 表 6 を改変 ) A : 尿中デオキシピリジノリン濃度 B : 血清中オステオカルシン濃度 尿中デオキシピリジノリン濃度 (pmol/μmol クレアチニン ) 偽手術群対照群 ミノドロン酸水和物リセドロネートアレンドロネート (11) 用量 (mg/kg/day po) 血清中オステオカルシン濃度 (ng/ml) 偽手術群対照群 ミノドロン酸水和物リセドロネートアレンドロネート (11) 用量 (mg/kg/day po) 図 ラット卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける (A) 尿中デオキシピリジノリン濃度及び (B) 血清中オステオカルシン濃度に対するビスホスホネートの作用図中の各点は 11~12 例 (11 例のみ図中に例数を示した ) の平均値 ± 標準誤差を示す. : 偽手術群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,williams の多重比較検定 ). ( 添付資料 : 卵巣摘出 F344/DuCrj ラット, 雌, 表 3 及び 4 を改変 )

17 測定項目 骨量 BV/TV(%) 骨梁幅 Tb. Th(μm) 骨梁数 Tb. N(N/mm) 吸収面 ES/BS(%) 破骨細胞面 Oc. S/BS(x1-2 %) 破骨細胞数 表 ラット卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける右脛骨近位骨幹端部海綿骨領域の骨形態に対するビスホスホネートの作用 偽手術群 (n=12) 対照群 (n=12).16 (n=12) ミノドロン酸水和物 (mg/kg/day po).8 (n=11).4 (n=11).4 (n=12) リセドロネート (mg/kg/day po).2 (n=12) 1 (n=12).4 (n=12) アレンドロネート (mg/kg/day po).2 (n=12) 1 (n=12) 22.65± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±.29.85±.13.63±.11.38±.7.81±.11.48±.5.44±.6.86± ±.22.49± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±1.11 N. Oc/BS(x1-2 N/mm) 16.14± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±1.38 骨形成速度 ( 骨面 ) BFR/BS (x1-2 mm 3 /mm 2 /year) 骨石灰化速度 MAR(μm/day) 類骨幅 O. Th(μm) 表中の値は 11~12 例の平均値 ± 標準誤差を示す. 3.51± ± ± ±.7.38± ±.4.43±.11.15± ± ±.3.54±.19.59±.3.59±.5.52±.3.4±.8.26±.7.43±.4.33±.6.15±.7.56±.6.36±.5.23± ±.9 2.5±.7 2.± ± ± ± ± ±.5 2.9± ± ±.1 : 偽手術群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,williams の多重比較検定 ). ( 添付資料 : 卵巣摘出 F344/DuCrj ラット, 雌, 表 7 を改変 )

18 ラット卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける予防効果 (12 カ月間投与 ) 添付資料 ~5 両側卵巣を摘出した成熟雌性ラットの骨密度, 骨強度及び骨代謝回転に対するミノドロン酸水和物の作用を検討した.1.5 w/v% メチルセルロース水溶液 ( 偽手術群及び対照群 ) 及びミノドロン酸水和物 (.6,.3 及び.15 mg/kg/day) は卵巣摘出の翌日から 1 日 1 回 12 カ月間反復経口投与した. 投与開始後 12 カ月に第 3~5 腰椎及び左右大腿骨を摘出し, 単一 X 線吸収法 (SXA 法 ) にて骨密度を測定し, また力学試験 ( 圧迫試験及び 3 点折り曲げ試験 ) を実施した. また, 投与開始後 12 カ月において, 骨吸収マーカーである尿中デオキシピリジノリン濃度及び骨形成マーカーである血清中オステオカルシン濃度を測定した. 更に, 第 3,4 腰椎椎体海綿骨領域において骨形態計測を実施した. また, 右上腕骨内の薬物濃度を測定した. 骨密度及び骨強度を測定した結果, 第 3~5 腰椎及び右大腿骨の骨密度は対照群で低下したが, ミノドロン酸水和物はいずれの用量においてもこれらの骨密度の低下を抑制し,.3 mg/kg/day における腰椎骨密度は偽手術群と同程度であった ( 表 ). 第 5 腰椎椎体の圧迫強度及び左大腿骨骨幹部の 3 点折り曲げ強度は対照群で低下した ( 表 ). ミノドロン酸水和物はいずれの用量においてもこれら骨強度の低下を抑制した. 第 3~5 腰椎の骨密度と第 5 腰椎椎体の骨強度及び右大腿骨の骨密度と左大腿骨骨幹部の骨強度は正の相関を示した ( 表 ). 骨代謝マーカーについて検討した結果, 尿中デオキシピリジノリン濃度及び血清中オステオカルシン濃度は対照群で上昇したが, ミノドロン酸水和物はこれら骨代謝マーカーの上昇を用量依存的に抑制し ( 表 ), 骨代謝回転の亢進を抑制した. 第 3,4 腰椎椎体海綿骨領域について骨形態計測を行った結果, 骨量, 骨梁幅及び骨梁数は対照群で減少した ( 表 ). ミノドロン酸水和物は骨量, 骨梁幅及び骨梁数の減少を.3 mg/kg/day 以上の用量で抑制し, 未石灰化骨基質層の厚さである類骨幅を減少させた. 骨吸収の指標に関して, 対照群では吸収面は変化しなかったが, 破骨細胞面及び破骨細胞数が増加した. ミノドロン酸水和物は破骨細胞面及び破骨細胞数の増加をいずれの用量においても抑制した. 右上腕骨内の薬物濃度を測定した結果, ミノドロン酸水和物は.6 mg/kg/day の用量では 25 ng/g の定量限界未満であり,.3 及び.15 mg/kg/day の用量ではそれぞれ 38.2 及び 24 ng/g の濃度であった. 表 ラット卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける第 3~5 腰椎及び右大腿骨骨密度に対するミノドロン酸水和物の作用測定項目偽手術群対照群ミノドロン酸水和物 (mg/kg/day po) 第 3~5 腰椎骨密度 (mg/cm ± ±1.6 ) 161.5± ± ±2. 右大腿骨骨密度 (mg/cm ± ±1.2 ) 133.4± ± ±1.3 表中の値は 15 例の平均値 ± 標準誤差を示す. : 偽手術群に対する有意差を示す (p<.5, 分散分析後に Student あるいは Aspin-Welch の t 検定 ). : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,williams の多重比較検定 ). ( 添付資料 : 卵巣摘出 F344/DuCrj ラット, 雌, 表 を改変 )

19 表 ラット卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける第 5 腰椎椎体及び左大腿骨骨幹部骨強度 に対するミノドロン酸水和物の作用 測定項目 偽手術群 対照群 ミノドロン酸水和物 (mg/kg/day po) 第 5 腰椎椎体絶対負荷 (N) 191±13 129±6 17±6 168±8 169±6 左大腿骨骨幹部絶対負荷 (N) 97±2 87±2 94±2 1±2 14±2 表中の値は 15 例の平均値 ± 標準誤差を示す. : 偽手術群に対する有意差を示す (p<.5, 分散分析後に Student あるいは Aspin-Welch の t 検定 ). : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,williams の多重比較検定 ). ( 添付資料 : 卵巣摘出 F344/DuCrj ラット, 雌, 表 5-1 を改変 ) 表 ラット卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける腰椎及び大腿骨での骨密度と骨強度の相関 偽手術群及び対照群 対照群及び偽手術群, 対照群及びミノドロン酸水和物投与群ミノドロン酸水和物投与群 腰椎 大腿骨 表中の値は Pearson の相関係数を示す. 偽手術群 15 例, 対照群 15 例, ミノドロン酸水和物投与群 45 例. : 有意な相関を示す (p<.5, 線形回帰分析法 ). ( 添付資料 : 卵巣摘出 F344/DuCrj ラット, 雌, 表 1 を改変 ) 表 ラット卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける尿中デオキシピリジノリン濃度及び 血清中オステオカルシン濃度に対するミノドロン酸水和物の作用 測定項目 偽手術群 対照群 ミノドロン酸水和物 (mg/kg/day po) 尿中デオキシピリジノリン濃度 (pmol/μmol クレアチニン ) 13.7± ± ±.4 8.7±.4 5.9±.3 血清中オステオカルシン濃度 (ng/ml) 18.± ± ±.8 17.± ±.9 表中の値は 15 例の平均値 ± 標準誤差を示す. : 偽手術群に対する有意差を示す (p<.5, 分散分析後に Student あるいは Aspin-Welch の t 検定 ). : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,williams の多重比較検定 ). ( 添付資料 : 卵巣摘出 F344/DuCrj ラット, 雌, 表 及び を改変 )

20 表 ラット卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける第 3,4 腰椎椎体海綿骨領域の骨形態 に対するミノドロン酸水和物の作用 測定項目 偽手術群 対照群 ミノドロン酸水和物 (mg/kg/day po) 骨量 BV/TV(%) ± ± ± ± ± 骨梁幅 第 Tb. Th(μm) ± ± ± ± ± 骨梁数腰 Tb. N(N/mm) ± ± ± ± ±.1493 椎 吸収面 ES/BS(%) ± ± ± ± ±.317 第 3 腰椎 類骨幅 O. Th(μm) ± ± ± ± ±.2151 破骨細胞面 Oc. S/BS(%).125± ± ± ± ±.969 破骨細胞数 N. Oc/BS (N/mm).489± ± ± ± ±.288 表中の値は 15 例の平均値 ± 標準誤差を示す. : 偽手術群に対する有意差を示す (p<.5, 分散分析後に Student あるいは Aspin-Welch の t 検定 ). : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,williams の多重比較検定 ). ( 添付資料 : 卵巣摘出 F344/DuCrj ラット, 雌, 表 及び を改変 ) ラット卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける治療効果 (12 カ月間投与 ) 添付資料 ,7 両側卵巣を摘出した成熟雌性ラットの骨密度, 骨強度及び骨代謝回転に対するミノドロン酸水和物の作用を検討した.1.5 w/v% メチルセルロース水溶液 ( 偽手術群及び対照群 ) 及びミノドロン酸水和物 (.6,.3 及び.15 mg/kg/day) は卵巣摘出後 12 週から 1 日 1 回 12 カ月間反復経口投与した. 投与開始後 12 カ月に第 3~5 腰椎, 右大腿骨を摘出し, 骨密度測定 (DXA 法 ) 及び力学試験 ( 圧迫試験及び 3 点折り曲げ試験 ) を実施した. 骨吸収マーカーである尿中デオキシピリジノリン濃度を経時的に測定し, 骨形成マーカーである血清中オステオカルシン濃度を投与開始後 12 カ月において測定した. また, 第 4 腰椎椎体海綿骨領域において骨形態計測を実施した. 更に, 投与開始時に剖検する群も設け, これらの指標を測定した. 投与開始時に対照群で第 3~5 腰椎及び右大腿骨の骨密度は低下し ( 表 ), 第 5 腰椎椎体の圧迫強度及び右大腿骨骨幹部の 3 点折り曲げ強度も低下した ( 表 ). また, 尿中デオキシピリジノリン濃度及び血清中オステオカルシン濃度は投与開始時に対照群で上昇した ( 表 ). 更に, 第 4 腰椎椎体海綿骨領域について骨形態計測を行った結果, 骨量及び骨梁幅は投与開始時に対照群で減少した ( 表 ). また, 投与開始時に対照群では骨吸収の指標である破骨細胞面及び破骨細胞数, 並びに骨形成の指標である骨形成速度が増加した. 更に, 類骨幅は増加した. 投与開始後 12 カ月に骨密度及び骨強度を測定した結果, 第 3~5 腰椎及び右大腿骨の骨密度は対照群で低下したが, ミノドロン酸水和物はいずれの用量においても, これらの骨密度の低下を抑制した ( 表 ). また, 第 5 腰椎椎体の圧迫強度及び右大腿骨骨幹部の 3 点折り曲

21 げ強度は対照群で低下し, ミノドロン酸水和物はこれらの部位における骨強度の低下を, それぞれ.15 mg/kg/day 及び.6 mg/kg/day 以上の用量で抑制した ( 表 ). 更に, 第 3~5 腰椎の骨密度と第 5 腰椎椎体の骨強度及び右大腿骨骨幹部の骨密度と骨強度は正の相関を示した ( 表 ). 投与開始後に骨代謝マーカーについて検討した結果, 対照群の尿中デオキシピリジノリン濃度はいずれの時点でも上昇し, ミノドロン酸水和物はこの上昇を.6 あるいは.3 mg/kg/day 以上の用量で抑制した ( 表 ). また, 投与開始後 12 カ月で, ミノドロン酸水和物は.3 mg/kg/day 以上の用量で血清中オステオカルシン濃度を低下させた. 投与開始後 12 カ月に第 4 腰椎椎体海綿骨領域について骨形態計測を行った結果, 対照群では骨量, 骨梁幅及び骨梁数が減少した ( 表 ). ミノドロン酸水和物はいずれの用量においても骨量及び骨梁数の減少を抑制するとともに,.3 mg/kg/day 以上の用量で骨梁幅の減少を抑制した. 骨吸収の指標に関して, 対照群では破骨細胞面及び破骨細胞数が増加し, ミノドロン酸水和物はいずれの用量においてもこれらの増加を抑制した. 骨形成の指標に関して, 対照群では骨形成速度は変化せず, ミノドロン酸水和物はいずれの用量においても骨形成速度を低下させた. また, 同部位の骨石灰化速度及び類骨幅は対照群で変化せず, ミノドロン酸水和物はいずれの用量においても骨石灰化速度を低下させたが,.3 mg/kg/day 以上の用量で類骨幅を減少させた. 表 ラット卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける第 3~5 腰椎及び右大腿骨骨密度に対する ミノドロン酸水和物の作用 測定項目 投与開始時ミノドロン酸水和物 (mg/kg/day po) 偽手術群対照群偽手術群対照群 (n=15) (n=12) (n=15) (n=15) (n=12) (n=15) (n=13) 第 3~5 腰椎骨密度 18.1± ± ± ± ± ± ±1.8 (mg/cm 2 ) 右大腿骨骨密度 (mg/cm 2 ) 97.7± ± ± ± ± ± ±1.5 表中の値は表中に示す例数 (12~15 例 ) の平均値 ± 標準誤差を示す. +: 投与開始時偽手術群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). : 偽手術群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,williams の多重比較検定 ). ( 添付資料 : 卵巣摘出 F344/DuCrj ラット, 雌, 表 6-2 を改変 )

22 表 ラット卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける第 5 腰椎椎体及び右大腿骨骨幹部の骨強度に対するミノドロン酸水和物の作用投与開始時ミノドロン酸水和物 (mg/kg/day po) 偽手術群対照群測定項目偽手術群対照群 (n=15) (n=12) (n=15) (n=15) (n=12) (n=15) (n=13) 第 5 腰椎椎体 158.3± ± ± ± ± ± ±6.3 絶対負荷 (N) 右大腿骨骨幹部 111.5± ± ± ± ± ± ±2.5 絶対負荷 (N) 表中の値は表中に示す例数 (12~15 例 ) の平均値 ± 標準誤差を示す. +: 投与開始時偽手術群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). : 偽手術群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,williams の多重比較検定 ). ( 添付資料 : 卵巣摘出 F344/DuCrj ラット, 雌, 表 2 を改変 ) 表 ラット卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける腰椎及び右大腿骨骨幹部での骨密度と骨強度の相関 偽手術群及び対照群 対照群及びミノドロン酸水和物投与群 偽手術群, 対照群及びミノドロン酸水和物投与群 腰椎 右大腿骨骨 幹部表中の値は Pearson の相関係数を示す. 偽手術群 15 例, 対照群 12 例, ミノドロン酸水和物投与群 4 例. : 有意な相関を示す (p<.5, 線形回帰分析法 ). ( 添付資料 : 卵巣摘出 F344/DuCrj ラット, 雌, 表 3 を改変 ) - 2 -

23 表 ラット卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける尿中デオキシピリジノリン濃度及び血清中オステオカルシン濃度に対するミノドロン酸水和物の作用ミノドロン酸水和物投与開始時偽手術群対照群 (mg/kg/day po) 測定項目偽手術群対照群 (n=15) (n=12) 検体 (n=15) (n=15) (n=12) (n=15) (n=13) 尿中デオキシピリジノリン濃度 (pmol/μmol クレアチニン ) 投与前 131.8± ± ± ± ± ± ± カ月 ± ± ± ± ±3.3 投 3 カ月 ± ±5. 59.± ± ±1.5 与 6 カ月 ± ± ± ± ±1.9 後 12 カ月 ± ± ± ± ±2.1 血清中オス投与前 12.2± ± テオカルシン濃度投与後 (ng/ml) 12 カ月 ± ±.5 12.±.6 8.7±.4 8.8±.4 表中の値は表中に示す例数 (12~15 例 ) の平均値 ± 標準誤差を示す. +: 投与開始時偽手術群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). : 偽手術群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). : 対照群に対する有意差を示す (p<.5, 尿中デオキシピリジノリン濃度については二元配置分散分析後 Williams の多重比較検定, 血清中オステオカルシン濃度については Williams の多重比較検定 ). ---: 測定せず. ( 添付資料 : 卵巣摘出 F344/DuCrj ラット, 雌, 表 4-1 及び 4-3 を改変 ) 注 ) 表 ラット卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける第 4 腰椎椎体海綿骨領域の 測定項目 骨形態に対するミノドロン酸水和物の作用 偽手術群 (n=15) 投与開始時 対照群 (n=15) 偽手術群 (n=15) 対照群 (n=12).6 (n=12) ミノドロン酸水和物 (mg/kg/day po).3 (n=15).15 (n=13) 骨量 BV/TV(%) 35.83± ± ± ± ± ± ±1.68 骨梁幅 Tb. Th(μm) 93.47± ± ± ± ± ± ±4.55 骨梁数 Tb.N(N/mm) 3.82± ± ± ±.9 3.8± ± ±.12 破骨細胞面 Oc. S/BS(%) 5.27± ± ± ± ± ± ±.37 破骨細胞数 N. Oc/BS(N/mm) 2.2± ± ± ± ± ± ±.16 骨形成速度 ( 骨面 )BFR/BS (mm 3 /mm 2 /year) 21.31± ± ± ± ± ± ±1.7 骨石灰化速度 MAR(μm/day).849± ± ± ± ±.46.53±.5.382±.42 類骨幅 O. Th(μm) 2.31± ± ± ± ± ± ±.49 表中の値は表中に示す例数 (12~15 例 ) の平均値 ± 標準誤差を示す. +: 投与開始時偽手術群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). : 偽手術群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,williams の多重比較検定 ). ( 添付資料 : 卵巣摘出 F344/DuCrj ラット, 雌, 表 7-6,7-7 及び 7-8 を改変 ) 注 ): 新薬情報提供時注釈誤 177.1, 正 177.7

24 カニクイザル卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける作用 添付資料 両側卵巣を摘出した成熟雌性カニクイザルの骨密度, 骨強度及び骨代謝回転に対するミノドロン酸水和物の作用を検討した. 乳糖 ( 偽手術群及び対照群 ), ミノドロン酸水和物 (.15 及び.15 mg/kg/day) 及びアレンドロネート (.5 mg/kg/day) は卵巣摘出の翌日から 1 日 1 回 17 カ月間反復経口投与した. 卵巣摘出前及び投与開始後 4,8,12 及び 16 カ月に麻酔下で生体位の第 3~5 腰椎及び左大腿骨近位部の骨密度を DXA 法により測定し, 骨吸収マーカーである尿中 NTX 及びデオキシピリジノリン濃度並びに骨形成マーカーである血清中オステオカルシン及び骨型アルカリホスファターゼ濃度を経時的に測定した. 投与開始後 17 カ月に第 4 腰椎及び左大腿骨を摘出し, 力学試験 ( 圧迫試験及び 3 点折り曲げ試験 ) を実施した. また, 第 2,3 腰椎椎体及び左脛骨近位骨幹端部海綿骨領域並びに左脛骨骨幹部オステオンにおいて骨形態計測を実施した. 更に, ミノドロン酸水和物投与群の第 4 腰椎椎体, 右大腿骨骨幹部及び右大腿骨頸部における骨内薬物濃度を測定した. 骨密度を測定した結果, 対照群では第 3~5 腰椎骨密度が低下したが, ミノドロン酸水和物はいずれの用量でも腰椎骨密度の低下を抑制した ( 図 ). また, アレンドロネートも腰椎骨密度の低下を抑制した. 更に, 投与開始後 16 カ月における左大腿骨近位部の骨密度はミノドロン酸水和物.15 mg/kg/day 投与群と偽手術群で同程度であった. 骨強度について検討した結果, 第 4 腰椎椎体及び左大腿骨頸部の圧迫強度は対照群で低下したが, ミノドロン酸水和物はこれら圧迫強度の低下を.15 mg/kg/day の用量で抑制した ( 表 ). アレンドロネートも同様に第 4 腰椎椎体の圧迫強度の低下を抑制した. 一方, 左大腿骨骨幹部 3 点折り曲げ強度に関しては対照群で明らかな変化がなく, ミノドロン酸水和物及びアレンドロネートも影響を及ぼさなかった. 骨密度と骨強度の相関を検討した結果, 偽手術群と対照群の混合解析で第 4 腰椎椎体及び左大腿骨骨幹部における骨強度は同部位の骨密度と正の相関を示し, ミノドロン酸水和物投与群を合わせて解析した場合においても, またアレンドロネート投与群を合わせて解析した場合においてもこれらは正の相関を示した ( 表 及び図 ). 骨代謝マーカーについて検討した結果, 対照群の尿中 NTX 及びデオキシピリジノリン濃度並びに血清中オステオカルシン及び骨型アルカリホスファターゼ濃度は投与開始後 4 カ月以降において上昇した ( 図 ). ミノドロン酸水和物はこれらの骨代謝マーカーの濃度上昇を用量依存的に抑制した. アレンドロネートも偽手術群と同程度まで骨代謝マーカー濃度の上昇を抑制し, 尿中 NTX 濃度以外の指標に関しては有意な作用であった. 骨梁構造並びに骨吸収及び骨形成の指標を第 2,3 腰椎椎体及び左脛骨近位骨幹端部の海綿骨領域で検討した結果, 対照群では骨量, 骨梁幅及び骨梁数は変化せず, ミノドロン酸水和物の影響も明らかではなかった ( 表 ). アレンドロネート投与群では腰椎椎体の骨量及び骨梁幅が増加したが, 脛骨では変化がみられなかった. 骨吸収の指標に関して, 対照群では腰椎椎体及び脛骨において吸収面が増加したが, 腰椎椎体の破骨細胞面及び破骨細胞数は変化しなかった. ミノドロン酸水和物は脛骨における吸収面の増加を抑制しなかったが, 腰椎椎体では

25 いずれの用量においても吸収面の増加を抑制するとともに,.15 mg/kg/day の用量では破骨細胞面及び破骨細胞数を減少させた. 骨形成の指標に関して, 対照群の骨形成速度は腰椎椎体では変化しなかったが, 脛骨では増加した. ミノドロン酸水和物はいずれの用量においても腰椎椎体の骨形成速度を低下させ, 脛骨の骨形成速度の増加を抑制した. 一方, アレンドロネートも腰椎椎体及び脛骨の骨吸収及び骨形成の指標を減少させた. また, 対照群の骨石灰化速度は腰椎椎体においては変化しなかったが, 脛骨において増加した. ミノドロン酸水和物はいずれの用量においても腰椎椎体の骨石灰化速度を低下させ, 脛骨の骨石灰化速度の増加を抑制した. 一方, アレンドロネートは腰椎椎体の骨石灰化速度に影響を与えなかったが, 脛骨における骨石灰化速度の増加を抑制した. また, 対照群では腰椎椎体の類骨幅が増加したが, 脛骨では変化しなかった. ミノドロン酸水和物は.15 mg/kg/day の用量で腰椎椎体において類骨幅の増加を抑制したが, 脛骨の類骨幅には影響を与えなかった. アレンドロネートも腰椎椎体において類骨幅の増加を抑制したが, 脛骨の類骨幅には影響を与えなかった. 更に, 左脛骨骨幹部オステオンにおいて, ミノドロン酸水和物は.15 mg/kg/day の用量で骨形成速度の増加を抑制し, アレンドロネートも骨形成速度の増加を抑制した. 骨内薬物濃度を測定した結果, ミノドロン酸水和物は.15 及び.15 mg/kg/day の用量でそれぞれ第 4 腰椎椎体において 132 及び 965 ng/g, 右大腿骨骨幹部において 44.7 及び 274 ng/g 並びに右大腿骨頸部において 85.4 及び 598 ng/g の濃度であった. 12 A: 腰椎 (L3-L5) 12 B: 左大腿骨近位部 骨密度変化率 (%) 11 1 $ $ $ $ 骨密度変化率 (%) 投与前 投与前 投与開始からの期間 ( 月 ) 投与開始からの期間 ( 月 ) 偽手術群 (n=12) 対照群 (n=11) ミノドロン酸水和物.15 mg/kg/day po(n=12) ミノドロン酸水和物.15 mg/kg/day po(n=12) アレンドロネート.5 mg/kg/day po(n=12) 図 カニクイザル卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける (A) 第 3~5 腰椎及び (B) 左大腿骨近位部の生体位骨密度に対するミノドロン酸水和物の作用図中の各点は図中に示す例数 (11~12 例 ) の平均値 ± 標準誤差を示す. : 偽手術群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,williams の多重比較検定 ). $: 対照群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). なお, 二元配置分散分析にて時間と処置の交互作用が有意な場合のみ有意差を表示した. ( 添付資料 : 卵巣摘出カニクイザル, 雌, 図 3 及び 4 を改変 )

26 表 カニクイザル卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける第 4 腰椎椎体, 左大腿骨頸部及び左大腿骨骨幹部骨強度に対するミノドロン酸水和物の作用ミノドロン酸水和物アレンドロネート偽手術群対照群 (mg/kg/day po) 測定項目.5 mg/kg/day po (n=12) (n=12) (n=11).15 (n=12).15 (n=12) 第 4 腰椎椎体絶対負荷 (N) 3383± ± ± ± ±167 $ 左頸部大絶対負荷 (N) 157± ±56 144± ±6 1495±68 腿骨幹部骨絶対負荷 (N) 1228± ± ±52 122±58 127±65 表中の値は表中に示す例数 (11~12 例 ) の平均値 ± 標準誤差を示す. : 偽手術群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,williams の多重比較検定 ). $: 対照群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). ( 添付資料 : 卵巣摘出カニクイザル, 雌, 表 22,24 及び 25 を改変 ) 表 カニクイザル卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける第 4 腰椎椎体及び左大腿骨骨幹部での骨密度と骨強度の相関 偽手術群及び対照群 対照群及びミノドロン酸水和物投与群 偽手術群, 対照群及びミノドロン酸水和物投与群 対照群及びアレンドロネート投与群 偽手術群, 対照群及びアレンドロネート投与群 第 4 腰椎椎体 左大腿骨骨幹部 表中の値は Pearson の相関係数を示す. 偽手術群 12 例, 対照群 11 例, ミノドロン酸水和物投与群 24 例, アレンドロネート投与群 12 例. : 有意な相関を示す (p<.5, 線形回帰分析法 ). ( 添付資料 : 卵巣摘出カニクイザル, 雌, 表 26 を改変 ) 絶対負荷 (N) A: ミノドロン酸水和物 B: アレンドロネート 偽手術群対照群ミノドロン酸水和物投与群 絶対負荷 (N) 6 偽手術群 5 対照群アレンドロネート投与群 y = 15.93x y = 17.29x 骨密度 (mg/cm 2 ) 骨密度 (mg/cm 2 ) 図 カニクイザル卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける第 4 腰椎での骨密度と骨強度の相関 A: ミノドロン酸水和物,B: アレンドロネート ( 添付資料 : 卵巣摘出カニクイザル, 雌, 図 6 を改変 )

27 尿中 NTX 濃度 (nmol BCE /mmol クレアチニン ) A: 尿中 NTX 濃度 投与前 尿中デオキシピリジノリン濃度 (pmol/ μmol クレアチニン ) 2 1 B: b) 尿中デオキシピリジノリン濃度 $ $ $ $ 投与前 投与開始からの時間 ( 月 ) 投与開始からの時間 ( 月 ) 血清中オステオカルシン濃度 (ng/ml) c) C: 血清中オステオカルシン濃度 $ $ $ $ 投与前 投与開始からの時間 ( 月 ) 血清中骨型アルカリホスファターゼ濃度 (U/L) D: 血清中骨型アルカリホスファターゼ濃度 15 1 $ $ $ $ 5 投与前 投与開始からの時間 ( 月 ) 偽手術群 (n=12) 対照群 (n=11) ミノドロン酸水和物.15 mg/kg/day po (n=12) ミノドロン酸水和物.15 mg/kg/day po(n=12) アレンドロネート.5 mg/kg/day po (n=12) 図 カニクイザル卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける (A) 尿中 NTX 及び (B) デオキシピリジノリン濃度,(C) 血清中オステオカルシン及び (D) 骨型アルカリホスファターゼ濃度に対するミノドロン酸水和物の作用図中の各点は図中に示す例数 (11~12 例 ) の平均値 ± 標準誤差を示す. : 偽手術群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,williams の多重比較検定 ). $: 対照群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). なお, 二元配置分散分析にて時間と処置の交互作用が有意な場合のみ有意差を表示した. ( 添付資料 : 卵巣摘出カニクイザル, 雌, 図 1 及び 2 を改変 )

28 表 カニクイザル卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおける第 2,3 腰椎椎体及び左脛骨近位骨幹端部海綿骨領域並び左脛骨骨幹部オステオンの骨形態に対するミノドロン酸水和物の作用ミノドロン酸水和物偽手術群対照群 (mg/kg/day po) 測定項目 (n=12) 第 2 腰椎 第 3 腰椎 脛骨近位骨幹 端 脛骨オステオン 骨量 BV/TV(%) 骨梁幅 Tb. Th(μm) 骨梁数 Tb. N(N/mm) 吸収面 ES/BS(%) 骨形成速度 ( 骨面 ) BFR/BS (x1-2 mm 3 /mm 2 /year) 骨石灰化速度 MAR(μm/day) 類骨幅 O. Th(μm) (n=11).15 (n=12).15 (n=12) アレンドロネート.5 mg/kg/day po(n=12) 28.1± ± ± ± ±2.3 $ 175.± ± ± ± ±16.3 $ 1.64± ± ±.7 1.8± ±.4.±..44±.1.15±.6.8±.5.2±.2 $ 1.4± ±.27.22±.9.3±.2.44±.18 $.618±.84.87± ± ± ± ± ± ± ± ± $ 破骨細胞面 Oc. S/BS(%) 1.11± ± ± ±.8.281±.81 $ 破骨細胞数 N. Oc/BS(N/mm).396± ±.69.31±.53.86±.24.91±.23 $ 骨量 BV/TV(%) 8.4±.7 6.8± ± ±1. 7.8±.8 骨梁幅 Tb. Th(μm) 99.4± ± ± ± ±5. 骨梁数 Tb. N(N/mm).84±.3.73±.9.9±.1.88±.1.87±.7 吸収面 ES/BS(%).±. 1.29±.59.18±.12.43±.27.4±.4 $ 骨形成速度 ( 骨面 ) BFR/BS (x1-2 mm 3 /mm 2 /year).25± ±.33.5±.4.±..3±.3 $ 骨石灰化速度 MAR(μm/day).142± ±.47.87±.62.±..57±.57 $ 類骨幅 O. Th(μm) 1.234± ± ± ± ± 標識オステオンの割合 L-Ot. N/T-Ot. N(%).75± ± ± ± ±1.21 $ 骨形成速度 ( 骨面 ) BFR/BS (mm 3 /mm 2 /year).3±.2.123±.19.99±.19.17±.9.5±.16 $ 表中の値は 11~12 例の平均値 ± 標準誤差を示す. : 偽手術群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). : 対照群に対する有意差を示す ( p<.5,williams の多重比較検定 ). $: 対照群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). ( 添付資料 : 卵巣摘出カニクイザル, 雌, 表 27~3 を改変 )

29 イヌ卵巣子宮摘出及びカルシウム制限食給餌骨粗鬆症モデルにおける作用 添付資料 ( 参 ) 卵巣子宮摘出術 (OHX) を施し, 更にカルシウム含有率.14% の低カルシウム食 ( 通常食のカルシウム含有率は 1.4%) を摂取させた成熟雌性ビーグル犬の骨密度及び骨強度に対するミノドロン酸水和物の作用を検討した. ミノドロン酸水和物 (.2,.1 及び.5 mg/kg/day) は卵巣子宮摘出後 1 カ月から 1 日 1 回 12 カ月間反復経口投与した. 投与開始後 12 カ月に第 2,3 腰椎及び右大腿骨を摘出し, 骨密度測定 (DXA 法 ) 及び力学試験 ( 圧迫試験及び 3 点折り曲げ試験 ) を実施した. また, 第 4,5 腰椎椎体海綿骨領域において骨形態計測を実施した. 第 2 腰椎椎体, 右大腿骨全体及び右大腿骨頸部の骨密度は偽手術群 ( 偽手術 - 通常食 ) と比較して対照群 (OHX- 低カルシウム食 ) で低下したが, ミノドロン酸水和物はいずれの用量においてもこれらの部位の骨密度の低下を抑制した ( 表 ). 右大腿骨骨幹部の骨密度は対照群で明らかな変化がなく, ミノドロン酸水和物により増加した. 第 2 腰椎椎体海綿骨の圧迫強度は対照群で明らかな変化がなかったが, ミノドロン酸水和物はいずれの用量においても対照群と比較して骨強度を増加させた ( 表 ). また, 第 3 腰椎椎体の圧迫強度は対照群で低下したが, ミノドロン酸水和物はいずれの用量においても対照群と比較して骨強度を増加させた. 右大腿骨骨幹部の 3 点折り曲げ強度は対照群で明らかな変化がなく, ミノドロン酸水和物も影響を及ぼさなかった. 第 5 腰椎椎体海綿骨領域の骨形態計測の結果, 対照群では骨量及び骨梁数が減少し, 骨梁幅は変化しなかったが, ミノドロン酸水和物はいずれの用量においてもこれらの指標を増加させた ( 表 ). 骨吸収の指標に関して, ミノドロン酸水和物はいずれの用量においても, 第 4 腰椎椎体海綿骨領域の破骨細胞面を減少させるとともに, 破骨細胞数の増加を抑制した. 骨形成の指標として測定した第 5 腰椎椎体海綿骨領域の骨形成速度は対照群で増加したが, ミノドロン酸水和物はいずれの用量においてもこれらの増加を抑制した. 更に, 同部位の骨石灰化速度及び類骨幅は対照群で増加したが, ミノドロン酸水和物はそれぞれ.5 及び.1 mg/kg/day 以上の用量でこれらの増加を抑制した. 表 イヌ卵巣子宮摘出及びカルシウム制限食給餌骨粗鬆症モデルにおける 第 2 腰椎及び右大腿骨骨密度に対するミノドロン酸水和物の作用 測定項目 偽手術群 偽手術ミノドロン酸水和物 (mg/kg/day po) 対照群制限食群 第 2 腰椎 骨密度 (mg/cm 2 ) 468±18 45±14 37±17 45±7 469±2 451±11 右大腿骨 全体 44±15 381±11 368±11 417±6 435±8 436±9 骨密度 骨幹部 469±15 446±12 432±12 466±12 464±11 474±1 (mg/cm 2 ) 頸部 35±17 281±6 258±12 314±9 333±8 34±6 表中の値は 6 例の平均値 ± 標準誤差を示す. : 偽手術群に対する有意差を示す (p<.5,dunnett の多重比較検定 ). : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,williams の多重比較検定 ). ( 添付資料 : 卵巣子宮摘出ビーグル犬, 雌, 表 2-1 を改変 )

30 表 イヌ卵巣子宮摘出及びカルシウム制限食給餌骨粗鬆症モデルにおける 第 2 腰椎椎体海綿骨, 第 3 腰椎椎体及び右大腿骨骨幹部の骨強度に対する ミノドロン酸水和物の作用 測定項目 偽手術群 偽手術ミノドロン酸水和物 (mg/kg/day po) 対照群制限食群 第 2 腰椎 椎体海綿骨 781±89 744±67 616±51 957±47 961±19 92±65 絶対負荷 (N) 第 3 腰椎椎体 321± ± ± ± ± ±59 絶対負荷 (N) 右大腿骨骨幹部絶対負荷 (N) 157± ± ±56 141±9 131±8 1267±12 表中の値は 6 例の平均値 ± 標準誤差を示す. : 偽手術群に対する有意差を示す (p<.5,dunnett の多重比較検定 ). : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,williams の多重比較検定 ). ( 添付資料 : 卵巣子宮摘出ビーグル犬, 雌, 表 3-1 を改変 ) 表 イヌ卵巣子宮摘出及びカルシウム制限食給餌骨粗鬆症モデルにおける 第 4,5 腰椎椎体海綿骨領域の骨形態に対するミノドロン酸水和物の作用 測定項目 偽手術群 偽手術ミノドロン酸水和物 (mg/kg/day po) 対照群制限食群 骨量 BV/TV(%) 21.2± ± ± ± ± ±2.5 骨梁幅 Tb. Th(μm) 92.6± ± ± ± ± ±8.4 骨梁数第 Tb. N(N/mm) 2.27± ± ± ± ± ±.24 5 骨形成速度 ( 骨面 ) 腰 BFR/BS 椎 (x1-2 μm 3 /μm 2 /day) 7.25± ± ± ± ± ±.51 & 骨石灰化速度 MAR(μm/day).627± ±.12.8± ± ± ±.2 & 類骨幅 O. Th(μm) 6.21± ± ± ± ± ±.31 第 4 破骨細胞面 Oc. S/BS(%) 1.85± ± ± ± ±.27.67±.19 腰椎 破骨細胞数 N. Oc/BS(N/mm).94± ± ±.19.82±.17.83±.17.38±.12 表中の値は 6 例 ( & は 5 例 ) の平均値 ± 標準誤差を示す. : 偽手術群に対する有意差を示す (p<.5,dunnett の多重比較検定 ). : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,williams の多重比較検定 ). ( 添付資料 : 卵巣子宮摘出ビーグル犬, 雌, 表 6-1 及び 7-1 を改変 )

31 ラット不動性骨粗鬆症モデル ( 坐骨神経切除 ) における作用 添付資料 左坐骨神経を切除した成長期雌性ラットの骨密度に対するミノドロン酸水和物の作用を検討した.1.5 w/v% メチルセルロース水溶液 ( 偽手術群及び対照群 ), ミノドロン酸水和物 (.6,.3 及び.15 mg/kg/day), リセドロネート (1 mg/kg/day) 及びアレンドロネート (1 mg/kg/day) は左坐骨神経切除の翌日から 1 日 1 回 4 週間反復経口投与した. 投与開始後 4 週に左脛骨を摘出し, 左脛骨近位骨幹端部の骨密度を末梢型コンピュータ断層法 (pqct 法 ) で測定した. 対照群では左脛骨近位骨幹端部の骨密度が低下し, ミノドロン酸水和物は.3 mg/kg/day 以上の用量でこの骨密度の低下を抑制し,.3 mg/kg/day における骨密度は偽手術群と同程度であった ( 図 ). リセドロネート及びアレンドロネートも同様に左脛骨近位骨幹端部における骨密度の低下を抑制した. 8 $ 脛骨骨密度 (mg/cm 3 ) $ 偽手術群対照群 (mg/kg/day po) リセドアレンドミノドロン酸水和物ロネートロネート図 ラット不動性骨粗鬆症モデル ( 坐骨神経切除 ) における左脛骨近位骨幹端部の骨密度に対するミノドロン酸水和物の作用図中の各カラムは 1 例の平均値 ± 標準誤差を示す. : 偽手術群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,williams の多重比較検定 ). $: 対照群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). ( 添付資料 : 坐骨神経切除 CD(SD)IGS ラット, 雌, 図 1 を改変 )

32 ラット不動性骨粗鬆症モデル ( 上腕神経切除 ) における作用 添付資料 ( 参 ) 左上腕神経を切除した成長期雄性ラットの骨重量に対するミノドロン酸の作用を検討した. 蒸留水 ( 偽手術群及び対照群 ), ミノドロン酸 (.3,1,3 及び 1 mg/kg/day) 及びリセドロネート (1,3 及び 1 mg/kg/day) は左上腕神経切除の翌日から 1 日 1 回 2 週間非絶食下で反復経口投与した. 投与開始後 2 週に左上腕骨を摘出し, 乾燥重量を測定した. 対照群では左上腕骨の乾燥重量が低下し, ミノドロン酸及びリセドロネートはそれぞれ 1 及び 1 mg/kg/day 以上の用量でこの乾燥重量の低下を抑制した ( 図 ). A: ミノドロン酸 B: リセドロネート 上腕骨乾燥重量 (mg) 上腕骨乾燥重量 (mg) (4) (5) (5) (5) (5) (4) 偽手術群 対照群 ミノドロン酸 (mg/kg/day po) (5) (6) (5) (4) (5) 偽手術群対照群 リセドロネート (mg/kg/day po) 図 ラット不動性骨粗鬆症モデル ( 上腕神経切除 ) における左上腕骨の乾燥重量に対する (A) ミノドロン酸及び (B) リセドロネートの作用図中の各カラムはカラム中に示す例数 (4~6 例 ) の平均値 ± 標準誤差を示す. : 偽手術群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,dunnett の多重比較検定 ). ( 添付資料 : 上腕神経切除 Wistar ラット, 雄, 表 1 を改変 ) ラットステロイド性骨粗鬆症モデルにおける作用 添付資料 , 13 コハク酸プレドニゾロンナトリウムを週 3 回 12 週間経口投与した成熟雌性ラットの骨密度及び骨強度に対するミノドロン酸水和物の作用を検討した.1.5 w/v% メチルセルロース水溶液 ( 正常群及び対照群 ), ミノドロン酸水和物 (.6,.3 及び.15 mg/kg/day), リセドロネート (1 mg/kg/day) 及びアレンドロネート (1 mg/kg/day) はコハク酸プレドニゾロンナトリウムの投与開始日から 1 日 1 回 12 週間反復経口投与した. 投与開始後 12 週に第 3~5 腰椎及び右大腿骨を摘出し, 骨密度測定 (DXA 法 ) 及び力学試験 ( 圧迫試験及び 3 点折り曲げ試験 ) を実施した. 対照群では第 3~5 腰椎及び右大腿骨の骨密度が低下し, ミノドロン酸水和物はいずれの用量 - 3 -

33 でも骨密度の低下を抑制し,.3 mg/kg/day における骨密度は正常群と同程度であった ( 表 ). リセドロネート及びアレンドロネートも同様にこれらの骨密度の低下を抑制した. また, 第 5 腰椎椎体の圧迫強度及び右大腿骨骨幹部の 3 点折り曲げ強度は対照群で低下し, ミノドロン酸水和物は.15 mg/kg/day の用量で腰椎椎体における骨強度の低下を抑制したが, 右大腿骨骨幹部の 3 点折り曲げ強度の低下は抑制しなかった ( 表 ). リセドロネート及びアレンドロネートはいずれの部位においても骨強度の低下を抑制しなかった. 骨密度と骨強度の相関を調べたところ, 正常群と対照群の混合解析で第 3~5 腰椎の骨密度と第 5 腰椎椎体の骨強度及び右大腿骨の骨密度と骨強度は正の相関を示し, 対照群とミノドロン酸水和物投与群の混合解析においても, また正常群, 対照群及びミノドロン酸水和物投与群の混合解析においてもこれらは正に相関した ( 表 ). また, アレンドロネート投与群を合わせて解析した場合にもこれらは正に相関し, リセドロネート投与群を合わせて解析した場合には, 右大腿骨で正に相関したが, 腰椎では対照群とリセドロネート投与群の混合解析において相関がなかった. 表 ラットステロイド性骨粗鬆症モデルにおける第 3~5 腰椎及び右大腿骨の骨密度に対するミノドロン酸水和物の作用 測定項目正常群対照群 ミノドロン酸水和物 (mg/kg/day po) リセドロネート 1 mg/kg/day po アレンドロネート 1 mg/kg/day po 第 3~5 腰椎骨密度 112.9± ± ± ± ± ±1.6 $ 113.6±1.1 $ (mg/cm 2 ) 右大腿骨 骨密度 (mg/cm 2 ) 15.3± ± ± ± ± ±1.6 $ 15.±1.5 $ 表中の値は 12 例の平均値 ± 標準誤差を示す. : 正常群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,williams の多重比較検定 ). $: 対照群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). ( 添付資料 : ステロイド投与 F344/Jcl ラット, 雌, 表 5-2 を改変 )

34 表 ラットステロイド性骨粗鬆症モデルにおける第 5 腰椎椎体及び右大腿骨骨幹部の骨強度に対するミノドロン酸水和物の作用 測定項目 正常群 対照群 ミノドロン酸水和物 (mg/kg/day po) リセドロネート 1 mg/kg/day po アレンドロネート 1 mg/kg/day po 第 5 腰椎椎体 181.7± ± ± ± ± ± ±7.9 絶対負荷 (N) 右大腿骨骨幹部絶対負荷 (N) 127.4± ± ± ± ± ± ±2.2 表中の値は 12 例の平均値 ± 標準誤差を示す. : 正常群に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,williams の多重比較検定 ). ( 添付資料 : ステロイド投与 F344/Jcl ラット, 雌, 表 1 を改変 ) 表 ラットステロイド性骨粗鬆症モデルにおける腰椎及び右大腿骨での骨密度と骨強度の相関 正常群及び対照群 対照群及びミノドロン酸水和物投与群 正常群, 対照群及びミノドロン酸水和物投与群 対照群及びリセドロネート投与群 正常群, 対照群及びリセドロネート投与群 対照群及びアレンドロネート投与群 正常群, 対照群及びアレンドロネート投与群 腰椎 右大腿骨 骨幹部表中の値は Pearson の相関係数を示す. 正常群 12 例, 対照群 12 例, ミノドロン酸水和物投与群 36 例, リセドロネート投与群 12 例, アレンドロネート投与群 12 例. : 有意な相関を示す (p<.5, 線形回帰分析法 ). ( 添付資料 : ステロイド投与 F344/Jcl ラット, 雌, 表 2 を改変 )

35 作用機序 メバロン酸代謝経路における酵素に対する阻害作用 添付資料 ,15 メバロン酸代謝経路の酵素である FPP 合成酵素活性を含む画分をカニクイザル肝臓から調製し, 窒素原子含有及び窒素原子を含まないビスホスホネートの FPP 合成酵素阻害作用を検討した. 窒素原子含有ビスホスホネートであるミノドロン酸水和物 (.1,.1,.1,.1,.1 及び 1 μm) は FPP 合成酵素を濃度依存的に阻害し, その IC 5 値は.81 μm であった ( 表 ). 窒素原子含有ビスホスホネートであるゾレドロン酸水和物 (.1,.1,.1,.1,.1 及び 1 μm) 及びパミドロネート (.1,.1,.1,1,1 及び 1 μm) も濃度依存的に FPP 合成酵素を阻害し, その IC 5 値はそれぞれ.13 及び.61 μm であった. なお, 窒素原子を含まないビスホスホネートであるクロドロネートは本酵素を 1 μm で 71% 阻害した. 表 FPP 合成酵素に対するビスホスホネートの阻害作用被験薬物ミノドロン酸水和物ゾレドロン酸水和物パミドロネート IC 5 値 (μm) (.68~.96) (.11~.15) (.48~.75) 括弧内は 95% 信頼区間を示す. ( 添付資料 : カニクイザル肝臓, 雄, 表 1 を改変 ) 一方, 同じくメバロン酸代謝経路の酵素の一つであるスクアレン合成酵素に対する本薬の作用を, ヒト肝癌細胞 HepG2 から調製したスクアレン合成酵素を用いて検討した. ミノドロン酸水和物 (.1,.1,.1,1,1,1 及び 1 μm) はスクアレン合成酵素を濃度依存的に阻害し, その IC 5 値は 5.3(95% 信頼区間 :2.2~9.4)μM であった

36 骨吸収抑制作用に及ぼすメバロン酸代謝経路関連物質の影響 添付資料 ミノドロン酸水和物の骨吸収抑制作用に及ぼすメバロン酸代謝経路の関連物質の影響を検討した. ウサギ破骨細胞培養系において, ミノドロン酸水和物 (.3 μm) とともにメバロン酸代謝経路の関連物質であるゲラニルゲラニオール, ファルネソールあるいはスクアレン ( それぞれ 1 μm) を破骨細胞の培養液に添加し, 培養後 3 日の培養液中 CTX 濃度を骨吸収の指標として測定した. ミノドロン酸水和物により培養液中 CTX 濃度は低下し, ゲラニルゲラニオールはこの低下作用を減弱させた. 一方, ファルネソール及びスクアレンはミノドロン酸水和物の作用に影響を及ぼさなかった ( 図 ). 15 培養液中 CTX 濃度 (nm) 1 5 対照群 1 DMSO 対照群 2 DMSO GGOH FOH スクアレン GGOH FOH スクアレン 蒸留水ミノドロン酸水和物 (.3 μm ) 蒸留水図 ミノドロン酸水和物の骨吸収抑制作用に及ぼすメバロン酸代謝経路関連物質の影響図中の各カラムは 8 例の平均値 ± 標準誤差を示す. : 対照群 1 に対する有意差を示す (p<.5,student の t 検定 ). : 対照群 2 に対する有意差を示す (p<.5,dunnett の多重比較検定 ). GGOH,FOH 及びスクアレン濃度は 1 μm とした. DMSO: ジメチルスルホキシド,GGOH: ゲラニルゲラニオール,FOH: ファルネソール ( 添付資料 : ウサギ骨組織由来破骨細胞, 図 1 を改変 )

37 クレアチンキナーゼ遊離作用 添付資料 ミノドロン酸水和物による破骨細胞からの CK 遊離作用を検討した. ウサギ長管骨から調製した破骨細胞をミノドロン酸水和物で前処理したウシ骨スライス上で 3 日間培養した. 培養終了後, 培養液中の CK 活性, 破骨細胞数及び骨吸収マーカーである培養液中の CTX 濃度を測定した. また, ミノドロン酸の破骨細胞への取り込みを抑制するため, 液胞型プロトンポンプの阻害剤であるバフィロマイシン (1 nm) を添加し, その作用を検討した. ミノドロン酸水和物 (.3,1 及び 3 μm) はいずれの濃度においても培養液中の CK 活性を上昇させ ( 図 ),1 μm 以上では破骨細胞数を減少させた ( 図 ). これらの作用はバフィロマイシンの添加によりほぼ完全に抑制された. 一方, 骨吸収の指標である培養液中の CTX 濃度はミノドロン酸水和物の処理で低下した ( 図 ). 4 培養液中 CK 活性 (U/L) 対照群 エタ バフィロ エタ バフィロ エタ バフィロ エタ バフィロ ノール マイシン ノール マイシン ノール マイシン ノール マイシン 蒸留水ミノドロン酸水和物 (μm) 図 ミノドロン酸水和物によるウサギ破骨細胞からの CK 遊離作用図中の各カラムは 1 例の平均値 ± 標準誤差を示す. : 対照群との有意差を示す (p<.5,tukey 検定 ). : ミノドロン酸水和物各濃度におけるバフィロマイシン非存在下との有意差を示す (p<.5,tukey 検定 ). なお,Tukey 検定の結果は対照群とその他の処置の間, 及び各濃度のミノドロン酸水和物処置群におけるバフィロマイシン非存在下と存在下の間のみ記載した. ( 添付資料 : ウサギ骨組織由来破骨細胞, 図 2 を改変 )

38 15 破骨細胞数 ( 個 ) 1 5 対照群 エタバフィロエタバフィロエタバフィロエタバフィロノールマイシンノールマイシンノールマイシンノールマイシン 蒸留水ミノドロン酸水和物 (μm) 図 ウサギ破骨細胞数に対するミノドロン酸水和物の作用図中の各カラムは 1 例の平均値 ± 標準誤差を示す. : 対照群との有意差を示す (p<.5,steel-dwass 検定 ). : ミノドロン酸水和物各濃度におけるバフィロマイシン非存在下との有意差を示す (p<.5,steel-dwass 検定 ). なお,Steel-Dwass 検定の結果は対照群とその他の処置の間, 及び各濃度のミノドロン酸水和物処置群におけるバフィロマイシン非存在下と存在下の間のみ記載した. ( 添付資料 : ウサギ骨組織由来破骨細胞, 図 3 を改変 ) 3 培養液中 CTX 濃度 (nm) 2 1 対照群 エタ バフィロ エタ バフィロ エタ バフィロ エタ バフィロ ノール マイシン ノール マイシン ノール マイシン ノール マイシン 蒸留水 ミノドロン酸水和物 (μm) 図 ウサギ破骨細胞培養液中の CTX 濃度に対するミノドロン酸水和物の作用図中の各カラムは 1 例の平均値 ± 標準誤差を示す. : 対照群との有意差を示す (p<.5,tukey 検定 ). なお,Tukey 検定の結果は対照群とその他の処置の間のみ記載した. ( 添付資料 : ウサギ骨組織由来破骨細胞, 図 1 を改変 )

39 破骨細胞の形態に及ぼす影響 添付資料 成長期雄性ラットを用いて 破骨細胞の形態に及ぼすミノドロン酸水和物の影響を検討した ラットに蒸留水 対照群 あるいはミノドロン酸水和物 1 mg/kg を単回経口投与し 投与 後 1 3 及び 7 日に左右大腿骨を採取した 骨組織標本を作製し 破骨細胞の形態変化を電子顕 微鏡下で観察した 骨吸収を行っている破骨細胞は組織学的に明帯と呼ばれる領域で骨と密接に接着し 明帯の 内側の吸収窩では波状縁構造をとり そこから閉鎖空間に酸や蛋白分解酵素を分泌することに より 骨成分を溶解及び分解している ミノドロン酸水和物の投与後 1 3 及び 7 日で破骨細胞 の空胞は消失し 骨基質に接する面における波状縁や明帯構造は不明瞭になり 破骨細胞に形 態変化が誘導された 図 また 一部の破骨細胞ではアポトーシスが誘導されている 像が観察された 図 ラットの大腿骨における破骨細胞の微細形態に対するミノドロン酸水和物の作用 A 対照群 B 投与後 1 日 C 投与後 3 日 D 投与後 7 日 N 核 V 空胞 Cz 明帯 Rb 波状縁 骨基質に接する面を示す 添付資料 F344/Jcl ラット 雄 図

40 作用部位 骨との結合に関する性質 添付資料 ミノドロン酸水和物と骨との結合及び解離に関する性質を明らかにする目的で, 14 C-ミノドロン酸水和物 (1 μm,1 pmol,6.22 MBq/mg) を含む緩衝液 (ph7.) にウシ骨スライスを加え 1,2,5 及び 2 時間室温で反応させた後に, 骨スライスに結合した放射能量を測定した. また, 14 C-ミノドロン酸を 2 時間室温で反応させた後に, 更に種々の ph(2,2.5,3,3.5 及び 7) の緩衝液中で 5 時間反応させ, 骨スライスに結合している放射能量を測定した. 得られた放射能量はミノドロン酸水和物に換算して記載した. 14 C-ミノドロン酸は時間依存的に骨スライスに結合し, 反応開始後 5 時間以降はほぼ一定の結合量であった ( 図 ). 骨スライスに結合した 14 C-ミノドロン酸は ph2.5 以下の緩衝液で処理すると骨スライスから解離した. A: 骨スライスへの結合 B:pH 依存的遊離 結合化合物量 (pmol/slice) 結合化合物量 (pmol/slice) 反応時間 (h) ph 図 C-ミノドロン酸の (A) 骨スライスへの結合及び (B) 骨スライスからの ph 依存的遊離図中の各点は 3 例の平均値 ± 標準誤差を示す. ( 添付資料 : ウシ骨スライス, 図 1 及び 4)

41 骨組織内の局在に関する検討 ( 癌骨転移ラットの非転移部 ) 添付資料 ヒト悪性黒色腫細胞 A375(1 6 cells/body) を成長期雄性ヌードラットの左心室より移植し, 骨転移が認められたラットを用いてミノドロン酸の大腿骨組織内の局在を検討した. 腫瘍移植後 4 週に 14 C-ミノドロン酸水和物 (1 mg/6.22 MBq/kg) を単回静脈内投与し, 投与後 2 時間,1, 3 及び 7 日に左右大腿骨を採取し, ミクロオートラジオグラフィーを実施して, 光学顕微鏡下で放射能を銀粒子として検出した. 非転移部を観察した結果, 投与後 2 時間では放射能は海綿骨及び皮質骨の表面の吸収面, 形成面及び休止面のいずれにも検出され, 更に多くの破骨細胞にも検出された ( 図 ). また, 投与後 1 及び 3 日では, ほぼすべての破骨細胞に放射能が検出された ( 図 ). 破骨細胞の円形化や核数の増加を含む大型化は投与後 3 日以降で増加し, 投与後 7 日では, ほぼすべての破骨細胞が同様の変化を示したが, 投与後 7 日では破骨細胞数は減少していた. 投与後 3 日以降では投与後 2 時間及び 1 日に比べ, 変性破骨細胞やアポトーシス小体様構造物の軽度な増加が観察され, それら胞体に放射能が検出されたが, 投与後 7 日では放射能が検出される胞体の数は軽度に減少していた. 一方, 骨芽細胞, 骨髄細胞及び骨細胞には全時間を通じて放射能は検出されなかった. なお, 転移部におけるミノドロン酸の局在も非転移部と同様の結果であった. A: 海綿骨 1 μm B: 皮質骨図 A375 骨転移ラットに 14 C-ミノドロン酸水和物を静脈内投与したときの大腿骨のミクロオートラジオグラム 骨表面への分布 : 骨表面の銀粒子を示す (A: 海綿骨,B: 皮質骨 ). ( 添付資料 : ヒト悪性黒色腫細胞 A375 移植 F344/N Jcl-rnu ラット, 雄, 図 8 を改変 )

42 1 μm C: 骨芽細胞 ( 投与後 2 時間 ) A: 破骨細胞 ( 投与後 2 時間 ) D: 骨髄細胞 ( 投与後 2 時間 ) E: 骨細胞 ( 投与後 2 時間 ) B: 変性破骨細胞 ( 投与後 3 日 ) 図 A375 骨転移ラットに 14 C-ミノドロン酸水和物を静脈内投与したときの大腿骨のミクロオートラジオグラム 破骨細胞への分布 : 各細胞 (A: 破骨細胞,B: 変性破骨細胞,C: 骨芽細胞,D: 骨髄細胞,E: 骨細胞 ) を示す. ( 添付資料 : ヒト悪性黒色腫細胞 A375 移植 F344/N Jcl-rnu ラット, 雄, 図 9) 骨石灰化に及ぼす影響 ラットにおける骨石灰化に及ぼす影響 添付資料 成長期雄性ラットを用いて, 骨石灰化に及ぼすミノドロン酸水和物の影響を検討した. 蒸留水 ( 対照群 ), ミノドロン酸水和物 (.1,.1,1 及び 1 mg/kg/day) 及びエチドロネート (3, 1,3 及び 1 mg/kg/day) は 1 日 1 回 2 週間反復経口投与した. 最終投与翌日に左脛骨を摘出し,μCT 像をもとに骨量増加の指標として海綿骨量を, また骨石灰化障害の指標として骨端軟骨板の幅を測定した. 海綿骨量及び骨端軟骨板の幅を測定した結果, ミノドロン酸水和物は.1 mg/kg/day 以上の用量で海綿骨量を増加させたが,1 mg/kg/day においても骨端軟骨板の幅に影響を及ぼさなかった ( 図 ). 一方, エチドロネートは 3 mg/kg/day において海綿骨量を増加させたが, 3 mg/kg/day 以上の用量で骨端軟骨板の幅を増大させた

43 A: 海綿骨量 BV/TV(%) 対照群 ミノドロン酸水和物 (mg/kg/day po) エチドロネート (mg/kg/day po) B: 骨端軟骨板の幅 骨端軟骨板の幅 (mm) 対照群 ミノドロン酸水和物 (mg/kg/day po) エチドロネート (mg/kg/day po) 図 成長期ラットの左脛骨 (A) 海綿骨量及び (B) 骨端軟骨板の幅に対するミノドロン酸水和物及びエチドロネートの作用図中の各カラムは 1 例の平均値 ± 標準誤差を示す. : 対照群に対する有意差を示す (p<.5,dunnett の多重比較検定 ). ( 添付資料 :CD(SD)IGS ラット, 雄, 図 2 及び 3 を改変 )

44 ラット骨折モデルにおける骨折治癒に及ぼす影響 添付資料 成熟雌性ラットの左腓骨を骨折させる実験系を用いて, ミノドロン酸水和物の骨折治癒に及ぼす影響を検討した. ミノドロン酸水和物 (.3 及び.3 mg/kg/day) は骨折前 4 週から骨折後 8 週まで,1 日 1 回 12 週間反復経口投与した. また, 骨折前あるいは骨折後に投与されたミノドロン酸水和物の影響を検討するために, ミノドロン酸水和物 (.3 mg/kg/day) を骨折前 4 週間のみ, あるいは骨折後 8 週間のみ 1 日 1 回反復経口投与した. なお, 対照群及び薬物投与群の薬物非投与期間には 1.5 w/v% メチルセルロース水溶液を同様に投与した. 最終投与の翌日に左腓骨を摘出し,X 線撮影により仮骨量をグレード分類し, 更に力学試験 (3 点折り曲げ試験 ) を実施した. 仮骨量を評価した結果, ミノドロン酸水和物を.3 mg/kg/day の用量で骨折前後に投与したところ, 仮骨量の増加は明らかでなかった ( 表 ). また, 本薬を.3 mg/kg/day の用量で骨折前にのみ投与した場合も同様に仮骨量の増加は明らかでなかったが, 骨折後 ( 骨折前後あるいは骨折後のみ ) に投与した場合は仮骨量を増加させる傾向を示した. 骨強度を評価した結果, ミノドロン酸水和物を.3 mg/kg/day の用量で投与した場合及び.3 mg/kg/day の用量で骨折前のみに投与した場合は骨強度に影響を与えなかったが,.3 mg/kg/day の用量で骨折後に投与した場合は骨強度を増加させた. 表 ラット腓骨骨折モデルにおける左腓骨仮骨量及び骨強度に対する ミノドロン酸水和物の作用 ミノドロン酸水和物 (mg/kg/day po) 測定項目 対照群.3.3 (n=8) 骨折前後に骨折前後に骨折前のみ骨折後のみ 投与 (n=7) 投与 (n=8) 投与 (n=8) 投与 (n=8) 仮骨量 ( 例数 ) なし少量中等量多量 左腓骨絶対負荷 (N) 5.9±.6 5.8±.9 1.5±1. 6.1±.4 9.3±.5 仮骨量は, なし, 少量, 中等量, 多量の 4 段階でスコア化した. 左腓骨絶対負荷の値は表中に示す例数 (7~8 例 ) の平均値 ± 標準誤差を示す. : 対照群に対する有意差を示す ( p<.5,dunnett の多重比較検定 ). ( 添付資料 : 腓骨骨折 CD(SD)IGS ラット, 雌, 表 1 及び 2 を改変 )