フローサイトメトリープロトコル集 イムノフェノタイピング アポトーシス 細胞周期 作成日 2017 年 5 月 Version 1.0 研究目的でのみ使用できます 診断には使用できません
A. 細胞表面マーカーの染色 蛍光標識した細胞表面マーカーとフローサイトメトリー解析を組み合わせることにより 分化や発生のステージ また細胞機能に基づいた細胞集団サブセットの同定が可能になります これらの表面マーカーには様々なタイプまたは機能があり 例えば可溶性かつ細胞結合リガンドに対する受容体 イオンチャンネル 糖タンパク質 リン脂質などが含まれます 例えば CD4 はヘルパー T 細胞の表面マーカーであり さらにその分化の過程を他のケモカインレセプターや CD (cluster of differentiation) マーカーの発現量に応じて解析します 抗体染色した生細胞を染色パターンに応じて分類することにより その後の実験へ応用することも出来ます 注記事項 最良の結果を得るために 蛍光標識抗体のバイアルは遮光下 2-8 で保存してください ( 凍結は不可 ) 抗体使用前には 抗体の入ったバイアルを軽くスピンダウンしてから蓋を開けてください この際 ボルテックスはしないでください プロトコル内で特に記載が無い限り 染色ステップは氷上または 2-8 遮光下で行ってください 準備 12 x 75 mm round-bottom テストチューブ 細胞表面抗原に対する標識一次抗体 (FITC, Alexa Fluor 488, RPE, APCなど ) 蛍光標識二次抗体 ( 上記で未標識一次抗体またはビオチン標識一次抗体を用いる場合 ) [Optional]Anti-Mouse CD16/32 Purified (cat. no. 14-0161) または Human FC Receptor Binding Inhibitor Purified (cat. no. 14-9161) Flow Cytometry Staining Buffer (cat. no. 00-4222) またはPBS+1% BSA [Optional] 細胞の生死判定用試薬 : o 7-AAD Viability Staining Solution (cat. no. 00-6993) o Propidium Iodide Staining Solution (cat. no. 00-6990) o Invitrogen 固定可能な生存率解析用試薬 Fixable Viability Dyes efluor 455UV (cat. no 65-0868), efluor 450 (cat. no. 65-0863), efluor 506 (cat. no. 65-0866), efluor 660 (cat. no. 65-0864) and efluor 780 (cat. no. 65-0865) 操作 Note: 抗体結合の反応速度は温度に依存します 例えば 氷上で染色する場合は室温よりもインキュベーション時間が長くなります さらに 抗体の種類によっては推奨の反応条件がある物もございますので 詳細は製品添付のテクニカルデータシートをご参照ください 1. 必要数の細胞懸濁液を細胞種に応じて調製します 詳細は下記リンク先より細胞調製プロトコルもご参照いただけます https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cell-preparation-for-flow-cytometery.pdf 2. [Optional] Fcレセプター結合による抗体の非特異的反応をブロックする : o マウス細胞の場合 : 抗体標識前に100 µl あたり0.5-1 μg の Anti-Mouse CD16/CD32 Purified を加え 2-25 Cで10-20 分間インキュベートします o ヒト細胞の場合 : 抗体標識前に100 µl あたり20 μl の Human Fc Receptor Binding Inhibitor Purifiedを加え 2-25 Cで10-20 分間インキュベートします 3. 細胞懸濁液を50 ul( 約 10 5-10 8 cells) ずつチューブに分注します 4. 推奨量の一次抗体をFlow Cytometry Staining Bufferと混合し 最終全容量を100 µl とします 例えば 50 µlの細胞懸濁液に対して50 µlの一次抗体ミックスを加え 穏やかに撹拌します o Note: 未標識一次抗体またはビオチン標識一次抗体を用いる場合は ステップ8に続きます 5. 遮光条件下 2-8 C または氷上で30 分以上インキュベートします 6. Flow Cytometry Staining Buffer( またはPBS+1% BSA) をチューブあたり2mL 加えて洗浄します 室温下 400-600 x g で5 分間遠心分離し ペレット化した細胞を乱さないように注意しながら上清を除去します 7. [Optional] ステップ6を繰り返します o Note: 蛍光標識一次抗体を用いる場合は ステップ14に続きます 8. 遮光条件下 2-8 C または氷上で60 分間インキュベートします 1
9. Flow Cytometry Staining Buffer( または PBS+1% BSA) をチューブあたり 2mL 加えて洗浄します 室温下 400-600 x g で 5 分間遠心分離し ペレット化した細胞を乱さないように注意しながら上清を除去します 10. [Optional] ステップ 9 を繰り返します 11. 推奨量の標識二次抗体を Flow Cytometry Staining Buffer と混合して全量 100 µl とし 細胞ペレットを再懸濁します 遮光条件下 2-8 C または氷上で 30 分以上インキュベートします 12. Flow Cytometry Staining Buffer( または PBS+1% BSA) をチューブあたり 2mL 加えて洗浄します 室温下 400-600 x g で 5 分間遠心分離し ペレット化した細胞を乱さないように注意しながら上清を除去します 13. [Optional] ステップ 12 を繰り返します 14. [Optional] 生死判定用試薬を用いる場合は 各製品の推奨プロトコルに従って染色を行います 15. [Optional] 解析前にサンプルを保存する場合は 100 µl の Flow Cytometry Staining Buffer で再懸濁した後 100 µl の IC Fixation Buffer (cat. no. 00-8222) または 2 ml の 1-step Fix/Lyse Solution (cat. no. 00-5333) を添加します サンプルは遮光条件下 2-8 C で 3 日間まで保存可能です 16. 細胞ペレットを適切な量の Flow Cytometry Staining Buffer ( または PBS+1% BSA) で再懸濁します 17. サンプルをフローサイトメーターで測定します 2
B. 細胞内 ( 核内 ) タンパク質の染色 細胞表面マーカーと同時に細胞内抗原をフローサイトメトリー解析するためには 免疫染色の基礎プロトコルを修正する必要があります 一般的には ホルムアルデヒド処理により細胞膜を固定化し 界面活性剤やアルコールによって透過処理を行うことで 抗体が細胞内抗原にアクセス出来るようになり 細胞内染色が可能になります 本プロトコルでは Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (cat. no. 00-5523) を用いて固定透過処理をワンステップで行い 核内転写因子を染色する方法を御紹介します Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set は Foxp3 や Ki-67 などの転写因子や核タンパク質のほか サイトカインやケモカインに対する抗体を用いた染色用に調製 最適化されています 注記事項 最良の結果を得るために 蛍光標識抗体のバイアルは遮光下 4 で保存してください ( 凍結は不可 ) 抗体使用前には 抗体の入ったバイアルを軽くスピンダウンしてから蓋を開けてください この際 ボルテックスはしないでください プロトコル内で特に記載が無い限り 染色ステップは氷上または 4 遮光下で行ってください 細胞内抗原の検出に必要な固定透過処理を行うことによって 細胞の散乱光特性が変化し 非特異的バッグラウンドが増加する可能性があります 余剰なタンパク質 例えば BSA やウシ胎児血清 (Fetal Calf Serum, FCS) などを染色バッファーに加えることによって 非特異的バッグラウンドを低減できます 解析対象から死細胞集団を除去するためには Fixable Viability Dyes (FVD) の使用を推奨します 準備 12 x 75 mm round-bottom テストチューブ [Optional] Fixable Viability Dyes (FVD) efluor 455UV, 450, 506, 520, 660 and 780 (cat. nos. 65-0868, 65-0863, 65-0866, 65-0867, 65-0864, 65-0865) [Optional] Normal Mouse Serum (cat. no. 24-5544) [Optional] Normal Rat Serum (cat. no. 24-5555) 核内抗原に対する標識一次抗体 (FITC, Alexa Fluor 488, RPE, APCなど ) Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (cat. no. 00-5523) Flow Cytometry Staining Buffer (cat. no. 00-4222) またはPBS+1% BSA 染色バッファーの調製 ( 要時 ) Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate 1 倍量に対して 3 倍量のFoxp3 Fixation/Permeabilization Diluent を混合することにより 1X Foxp3 Fixation/Permeabilization working solutionを要時調製します チューブ内で染色を行う場合 1サンプルあたり1 mlの1x working solutionが必要です 10X Permeabilization Buffer 1 倍量に対して 9 倍量の蒸留水を混合することにより 1X Permeabilization Buffer を要時調製します チューブ内で染色を行う場合 1サンプルあたり最大 8.5 mlの1x Permeabilization Bufferが必要です (Buffer 量は洗浄回数によります ) 操作 Note: 抗体結合の反応速度は温度に依存します 例えば 氷上で染色する場合は室温よりもインキュベーション時間が長くなります さらに 抗体の種類によっては推奨の反応条件がある物もございますので 詳細は製品添付のテクニカルデータシートをご参照ください 1. 必要数の細胞懸濁液を細胞種に応じて調製します 詳細は下記リンク先より細胞調製プロトコルもご参照いただけます https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cell-preparation-for-flow-cytometery.pdf 2. [Optional] 生死判定用試薬を用いる場合は 各製品の推奨プロトコルに従って染色を行います 3. 各種細胞表面マーカーの染色を行います ( 詳細はプロトコル A を参照 ) 4. 最後の洗浄ステップ終了後 ペレット化した細胞を乱さないように注意しながら上清を除去します チューブ底に残ったバッファー約 100 µl と一緒にボルテックスで穏やかに撹拌しながらペレット塊を再懸濁します 5. Foxp3 Fixation/Permeabilization working solution(1x) を各チューブ 1 ml ずつ加え 軽くボルテックスしま 3
す 6. 遮光条件下 2-8 C または室温で 30-60 分間インキュベートします マウスサンプルの場合は 遮光条件下 2-8 C で 18 時間までインキュベーション可能です 7. 1X Permeabilization Buffer を 2 ml ずつチューブに加え 室温下 400-600 x g で 5 分間遠心分離し ペレット化した細胞を乱さないように注意しながら上清を除去します 8. [Optional] ステップ 7 を繰り返します 9. 上清除去後 チューブ底に残った 1X Permeabilization Buffer( 約 100 µl) でペレット塊を再懸濁します 10. [Optional] 2% normal mouse/rat serum を 2 µl チューブに加え ブロッキングします 室温で 15 分間インキュベートします 11. 核内抗原に対する標識一次抗体を推奨量加え 遮光条件下 2-8 C または室温で 30 分以上インキュベートします 12. 1X Permeabilization Buffer を 2 ml ずつチューブに加え 室温下 400-600 x g で 5 分間遠心分離し ペレット化した細胞を乱さないように注意しながら上清を除去します 13. [Optional] ステップ 12 を繰り返します 14. 細胞ペレットを適切な量の Flow Cytometry Staining Buffer ( または PBS+1% BSA) で再懸濁します 15. サンプルをフローサイトメーターで測定します 4
C. Annexin V の染色 ( アポトーシス ) Annexin V は カルシウム依存性のリン脂質結合タンパク質の Annexin ファミリーの 1 種で ホスファチジルセリン (PS) を含むリン脂質二重層に高い親和性を持ちます 正常な生理学的条件下で PS は細胞膜の内側に多く分布しています アポトーシスが誘導されると PS はリン脂質二重層における非対称分布を失い 細胞膜の内側から外側へ移動することでファゴサイトーシスのターゲットとなります 細胞外環境へ露出した PS が 蛍光標識された Annexin V とカルシウム依存的に結合することにより アポトーシス細胞として同定されます アポトーシス初期では 生死判定用試薬 例えばPropidium Iodide (PI), 7-AAD, Invitrogen Fixable Viability Dyes (FVD) などは細胞膜を通過することができません これらの細胞は Annexin V で染色されますが 生死判定用試薬では染色されないことから 初期アポトーシス細胞として同定されます アポトーシス後期では 細胞膜の完全性が失われ Annexin Vは細胞内部のPSにもアクセスできるようになります 生死判定用試薬を使用することで 後期アポトーシス細胞やネクローシス細胞 (Annexin V 陽性 ; 生死判定用試薬陽性 ) は 初期アポトーシス細胞 (Annexin V 陽性 ; 生死判定用試薬陰性 ) と区別できるようになります 注記事項 最良の結果を得るために Annexin V Apoptosis Detection Kit を選択する際 生死判定用試薬と 励起レーザーや検出器波長が互いに最も離れた蛍光色素の組み合わせとなることが理想的です Annexin V と PS の結合はカルシウム依存性があるため Annexin V 染色中は EDTA や他のカルシウムキレート剤を含むバッファーの使用は避けてください Annexin V は 細胞膜が損傷を受けていない場合に限りアポトーシスマーカーとして使用されます 損傷を受けることで膜完全性が失われ 細胞内 PS にも Annexin V が結合するようになります 準備 12 x 75 mm round-bottom テストチューブ 1X PBS Annexin V Apoptosis Detection kit (cat. nos. 88-8103, 88-8007, 88-8006, 88-8005, 88-8102, 88-8008) 10X Binding buffer Annexin V conjugate( PE-Cyanine7, APC, efluor 450, FITC, PE, PerCP-eFluor 710など Detection kitのcat. No. を参照 ) Propidium Iodide Staining Solution (cat. no. 00-6990) または 7-AAD Viability Staining Solution (cat. no 00-6993) Note: Cat. no. 88-8008(PerCP-eFluor 710) のキットには生死判定用試薬が含まれていません Invitrogen Fixable Viability Dye (FVD) の中から FVD efluor 660 (Cat. No. 65-0864), FVD efluor 506 (Cat. No. 65-0866), FVD efluor 780 (Cat. No. 65-0865) などの生死判定用試薬を替わりに使用することを推奨します 操作 1. 10X Binding Buffer 1 倍量に対して 9 倍量の蒸留水を混合することにより 1X Binding Buffer を要時調製します チューブ内で染色を行う場合 1サンプルあたり約 4-5 mlの1x Binding Bufferが必要です 2. 必要数のアポトーシス誘導細胞を回収します 3. 1X PBS で1 回洗浄後 1X Binding Buffer でも1 回洗浄します 4. 細胞濃度が100μL/testあたり約 10 5-10 8 cellsとなるように1x Binding Bufferで懸濁します 5. 100 μl の細胞懸濁液に対して 蛍光標識 Annexin V を5 μl 加えます 6. 遮光条件下 室温で10-15 分間インキュベートします 7. 1X Binging Buffer を2 ml ずつチューブに加え 室温下 400-600 x g で5 分間遠心分離し ペレット化した細胞を乱さないように注意しながら上清を除去します 8. 細胞ペレットを200 µlの1x Binding Bufferで再懸濁します 9. Propidium Iodide Staining Solution または 7-AAD Viability Staining Solution を5 μl 加え 氷上または室温で5-15 分間インキュベートします o Note: PI 7-AAD は測定中もバッファー中に存在する必要があるため 試薬添加後は洗浄を行わ 5
ないこと 10. サンプルをフローサイトメーターで測定します ( 細胞数が多い場合は 必要に応じて1X Binding Bufferで希釈します ) o Note: 染色後の細胞は4 時間以内に測定を終えるようにしてください PIや7-AADがバッファーに残存することで 時間経過とともに細胞生存率に対して副作用をもたらします しばらく測定を行わない場合は 遮光条件下 2-8 C で保存してください 6
D. 細胞周期の染色 ( 固定細胞 ) 細胞増殖の際に見られる生活環を細胞周期 (Cell Cycle) と言い 細胞周期解析を行うことで G 0 /G 1 期 ( 細胞 1 個当たりの染色体が 1 セット ) S 期 (DNA 合成期 ) および G 2 /M 期 ( 染色体が 2 セット ) など 各ステージの割合や DNA の含有量の変化などの情報を得ることができます FxCycle PI/RNase Staining Solution は固定細胞における DNA 量のフローサイトメトリー解析に用いられます Propidium Iodide(PI) はポピュラーな赤色蛍光色素であり 塩基間にインターカレートして DNA に結合し 配列選択性がほとんどまたは全くなく 4~5 の DNA 塩基対あたり 1 色素の割合で反応します PI は RNA にも結合するため RNA と DNA の染色を区別するには RNase 処理が必要です 当 Propidium Iodide 溶液は DNase フリーの RNase A および透過処理用試薬を含んでいます 試薬はすぐに使える状態でお届けしますので 固定した細胞に染色溶液を添加して インキュベートし 洗浄せずにフローサイトメーターでデータを得るだけです 注記事項 最良の結果を得るために 細胞は単細胞懸濁液の状態で固定されることが大変重要です 固定ステップの過程で 細胞が凝集してしまう傾向があり それにより DNA の染色状態が不均一となりデータがばらつく可能性があります 核 DNA を蛍光色素で染色し その蛍光強度 (DNA 量 ) から細胞周期を求めます DNA 量のヒストグラムプロットは Linear Scale を用います サンプルの多重染色を行う場合は 製品推奨のプロトコルに従って他の染色および洗浄を終えてから 最後に FxCycle PI/RNase Staining Solution で染色します FxCycle PI/RNase Staining Solution で染色後は 細胞の洗浄は避けてください 準備 12 x 75 mm round-bottom テストチューブ または1.5 ml エッペンドルフチューブ 1X PBS 氷冷 70% エタノール FxCycle PI/RNase Staining Solution (cat. No.F-10797) 操作 1. 必要数の細胞を回収します 2. 細胞数が1 testあたり~1 x 10 6 cellsとなるようにチューブに分注します 3. 400-600 x g で5 分間遠心分離します 4. 細胞を凝集させないように注意しながら 細胞ペレットを1 ml 氷冷 70% エタノールで固定します o Note: 固定剤添加の際に細胞ペレットを軽くボルテックスにかけながら非常にゆっくりと固定剤を加えて ( 滴下 ) いくことで細胞の凝集を防ぐことに繋がります また 固定時間中も数分おきに軽くボルテックスをかけて 細胞がチューブの底に沈むのを防ぎます 5. 細胞を-20 で一晩静置します これらの細胞は 染色および測定まで -20⁰Cで数週間保存可能です 6. 固定済み細胞を遠心分離後 1X PBS で1 回洗浄し エタノールを除去します o Note: エタノール固定した細胞はペレット状になりにくく確認が難しいことがあります 細胞ペレットを吸引してしまうリスクを減らすためにも 上清を吸引除去するのではなく チューブを反転させて上清を除去するほうが簡単です 細胞密度がとても低い場合は このステップにおいてPBS + 1% BSA で細胞を再懸濁することもできます BSAを加えることで 細胞のペレット化が促進されます 7. 細胞ペレットにFxCycle PI/RNase Staining Solutionを0.5 ml 添加し よく撹拌します 8. 遮光条件下 室温で15-30 分間インキュベートします 9. 洗浄をせず サンプルをそのままフローサイトメーターで測定します 7
研究用にのみ使用できます 診断目的およびその手続上での使用はできません 記載の社名および製品名は 弊社または各社の商標または登録商標です 標準販売条件はこちらをご覧ください www.thermofisher.com/tc For Research Use only.not for use in diagnostic procedures. 2017 Thermo Fisher Scientifc Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientifc and its subsidiaries unless otherwise specifed. Printed in Japan. サーモフィッシャーサイエンティフィックライフテクノロジーズジャパン株式会社 本社 : 108-0023 東京都港区芝浦 4-2-8 テクニカルサポート 0120-477-392 jptech@thermofisher.com オーダーサポート TEL:03-6832-6980 FAX:03-6832-9584 営業部 TEL:03-6832-9300 FAX:03-6832-9580 www.thermofisher.com 2