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かんじほうねん
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1 SNP & Variation Suite 8 ~ GWAS 解析編 ~ フィルジェン株式会社バイオサイエンス部 (biosupport@filgen.jp)

2 Golden Helix 企業概要アメリカのモンタナ州にて1998 年に設立遺伝子解析のリーダー的企業遺伝子解析ソフトウェアおよび解析サービスを提供世界中に数百の大学政府研究機関などのクライアントを保有戦略的パートナー Harvard School of Public Health Affymetrix Gene Chip Compatible Illumina iconnect Charter Partner Agilent Glaxo Smith Kline GeneGo

強力な統計解析機能柔軟性操作性 Applications Genotype Analysis DNA sequence

3 SNP & Variation Suite (SVS) SVS: マイクロアレイや次世代シークエンス (NGS) データから遺伝学的解析をするソフトウェア Core Features パワフルなデータマネジメント豊富なビジュアライゼーション機能強力な統計解析機能柔軟性操作性 Applications Genotype Analysis DNA sequence analysis CNV Analysis RNA-seq differential expression Family Based Association GenomeBrowse

4 SNP & Variation Suite (SVS) 研究 Human genome Plant DNA Animal DNA 医療疾患の診断や最適な治療オプションの決定におけるゲノム情報の利用教育遺伝学的解析に要するコンピューターサイエンス知識の負担を軽減

5 SNP & Variation Suite 使用例 1 ベーチェット症候群に関連する遺伝子の統計解析に SVS が利用されている Kirino, Y et al. (2013) Targeted resequencing implicates the familial Mediterranean fever gene MEFV and the toll-like receptor 4 gene TLR4 in Behçet disease. PNAS, doi: /pnas

(2010) A candidate gene association study on muscat flavor

6 SNP & Variation Suite 使用例 2 Vitis vinifera L. における遺伝子関連解析に SVS が使用されている Emanuelli, F et al. (2010) A candidate gene association study on muscat flavor in grapevine (Vitis vinifera L.). BMC Plant Biology, 10:241, doi: /

7 SVS はこれまでに 800 件以上の論文で引用されている

8 SNP & Variation Suite 8 - 基本機能 -

9 SVS 起動画面 : Welcome Screen A) プロジェクトやチュートリアルへのリンク D) Golden Helix 社テクニカルサポートの連絡先 B) アノテーションやマーカーマップの管理 Helpメニューへのアクセス E) 使用しているライセンス情報 C) 最新のアップデートやバグなどのサポート情報 F) 利用できる機能情報

10 Project 画面 : Project Navigator A B C A) Project Navigator Window: インポートデータや解析データが表示 B) Node Change Log: 実行した操作のログ情報 C) User Notes: プロジェクトやデータに関するメモを入力

11 データのインポート各データフォーマットに最適化されたインポートウィザードを搭載 Affyetrix (CHP, CEL, CNT, CNCHP, CYCHP, etc) Illumina (DSF, Final Report, Matrix Text File, etc) Family Pedigree (FBAT Pedigree/ Phenotype, etc) Agilent Files NimbleGen Data Summary Files Variant Call Format (VCF) Files Complete Genomics Var Files PED/TPED/BED Text Third Party Public Data HapMap Impute2 GWAS Files MACH Output Golden Helix DSF and more

12 データ画面 : Spread Sheet データは Spreadsheet 形式で表示 Marker Map 情報は緑色のタブで表示

13 Spread Sheet の編集柔軟性のあるデータ編集機能エクセル形式で編集可能カテゴリーデータのバイナリデータへの変換行列の複製や追加入れ替え数値や名前の編集変更点は赤色で表示

14 その他データ編集機能例複数の Spreadsheet を統合 : Joining or Merging Spreadsheets Appending Spreadsheets

15 ゲノムアセンブリ / リファレンス / アノテーショントラック各生物種のゲノムアセンブリ ( ゲノミックビルド ) の取得や管理をおこなう専用のツールを搭載リストから任意のデータを選択してダウンロード

16 ゲノムアセンブリ / リファレンス / アノテーショントラック各生物種のリファレンスデータやアノテーショントラックの取得や管理をおこなう専用のツールを搭載リストから任意のデータを選択してダウンロード Information から生物種やデータタイプ取得するリンク先などを確認できる

17 ゲノムアセンブリ / リファレンス / アノテーショントラック対応生物種一覧 Anopheles gambiea PEST Heterocephalus glaber Anopheles S Pimperena Homo Sapiens Arabidopsis thaliana Leishmania infantum JPCMS Bos taurus Macaca mulatta Brassica rapa Mus musculus Caenorhabitis elegans Mycobacterium tuberculosis H37Rv Canis familiaris Nomascus leucogenys Capra hircus Oncorhynchus mykiss Capsicum annuum Oryza sativa Carica papaya Prunus persica Citrullus lanatus Rattus norvegicus Cricetulus griseus Setaria italica Danio rerio Solanum lycopersicum Drosophila melanogaster Solanum tuberosum Equus caballus Sorghum bicolor Eucalyptus grandis Staphylococcus aureus N315 Felis catus Staphylococcus aureus USA 300 FPR3757 Glycine max Sus scrofa Gossypium raimondii Vicugna pacos Gullus gullus Zea mays 上記リスト以外にもパブリックデータベースから取得した生物種のカスタムアノテーションを作成することも可能

18 クオリティコントロールクオリティコントロール Call rateやmaf, Hardy Weinberg 平衡 (HWE) によるフィルタリング Identity by Descent (IBD) の検証 Population StratificationやBatch effectの検証 Read Depth (DP) やGenotype Quality (GQ), Allelic Depth (AD) によるフィルタリング多重検定の補正 (Bonferoni, FDR) 外れ値の検証... など

19 解析アプリケーション : SNP 関連解析複数の遺伝学モデル統計検定法多重比較法に対応し PCA 補正も可能マンハッタンプロットを簡単に作成可能インタラクティブなビジュアライゼーション機能により多面的なデータ検証が可能

20 解析アプリケーション : CNV 解析サンプル間での CNV の比較や統計解析が可能 CNV 領域を高精度に検出する CNAM Optimal Segmenting を搭載

21 解析アプリケーション : LD 解析, Haplotype 解析複数の連鎖不平衡解析ツールを搭載ハプロタイプ頻度の推定や関連解析ハプロタイプブロックの検出が可能複数の検定法多重比較法に対応

22 解析アプリケーション : 遺伝子発現差解析 (DESeq) RNA-seq などのハイスループットシークエンスデータからの遺伝子発現解析が可能遺伝子発現の統計解析には DESeq を採用 Volcano plot などのプロット作成

23 解析アプリケーション : Variant のアノテーション付フィルタリング Variantのアノテーション付フィルタリング機能遺伝子のexon 内 / 外にあるバリアントのフィルタリングパブリックデータベース (dbsnpなど) に登録されているバリアントのフィルタリング SIFTやPolyphen2, Mutation tasterなどによるスコアリングフィルタリング PhastConsやPhlyop2などのスコアリングフィルタリング NS Functional Prediction (dbnsfp) によるアノテーション付フィルタリングパブリックデータベースに未登録のバリアントの検証アノテーション付フィルタリングマイクロアレイデータや NGS データでは数十万 ~ 数百万単位の変異データが取得可能 SVS は膨大な変異データにアノテーション付やフィルタリングを実行するツールを多数搭載

24 解析アプリケーション : Rare variant 関連解析 SVS のレアバリアント関連解析では Combined Multivariate and Collapsing Method (CMC method) や Kernel-Based Adaptive Collapsing Method (KBAC method) によるアプローチが可能複数の検定法多重比較法に対応

25 解析アプリケーション一覧 1 Genotype menu: Genotype Statistics by Marker Genotype Filtering by Marker Genotype Statistics by Sample Quality Assurance Menu: Identity by Descent Estimation Fixation Index Fst Fixation Index Fst (by Marker) GBLUP Genomic Relation Matrix Filter Sample by Call Rates LD Pruning SNP Density Mendelian Error Check Inbreeding Coefficients LD Reports Menu Genotype Principal Component Analysis PBAT Family-Based QA PBAT Genotype Analysis Genotype Association Tests Haplotype Association Tests Haplotype Block Detection Runs of Homozygosity Compute Genomic BLUP (GBLUP) Mixed Linear Model Analysis DNA-Seq menu: Set Genotypes to No-Call based on Additional Spreadsheets Filter based on VCF Quality Metrics Calculate Alt Read Ratio Annotate and Filter Variants Activate Variants by Sample Genotypes Filter Variants in Reference Sample Spreadsheet Subset Informative Genotype by Category Variant Binning by Frequency source Variant Classification Classify by Inheritance Pattern Find de Novo Candidate Variants Score Variants by Recessive Model Score Compound Heterozygous Regions Score Variants by dominant Model Collapsing Methods: Count Variants per Gene CMC with Hotelling T Squared Tests CMC with Regression KBAC with Permutation Testing KBAC with Regression

26 解析アプリケーション一覧 2 Numeric menu: Numeric Principal Component Analysis Numeric Association Tests Numeric Regression Analysis CNV QA Menu: RNA-Seq menu: Activate Genes by Minimum Read Threshold Normalization and Log Transformation DESeq Analysis Dendrograms and Heatmaps Derivative Log Ratio Spread Percentile Based Winsorizing Wave Detection/ Correction CNAM Optimal Segmenting CNAM Output Analysis Statistics (per Column) Statistics (per Row) Multidimensional Outlier Detection Fishers Exact Test for Binary Predictors 解析アプリケーション要約 Genotype menu: SNPやハプロタイプの関連解析 DNA-Seq menu: バリアントの評価やレアバリアント解析 Numeric menu: CNV 関連解析や回帰分析主成分分析など各種数値的統計解析 RNA-Seq menu: RNA-seqデータによる遺伝子発現変動解析

27 ビジュアライゼーション and more 最新の SVS は GenomeBrowse を内蔵し強力なビジュアライゼーションを実現 SVS のプロットは各種パブリックデータベースとリンクし詳細な情報を得ることが出来る

28 プロット作成例ハプロタイプブロックやボルケノプロットヒストグラムスキャタープロットヒートマップなど多数プロット可能

29 Demonstration - アレイデータを用いた SNP-GWAS 解析 -

30 Genome Wide Association Study ゲノム上の SNPs を網羅的に検証し特定の形質と関連性のある SNP を探索するこれまでに盛んに研究がなされ多数の疾患感受性遺伝子が同定されている図. GWAS 論文件数の推移 * *The National Human Genome Research Institute, Published GWA Reportsより一部改編

31 Genome Wide Association Study 課題データの前処理 ( クオリティコントロール ) が多段階からなる : 数十万数百万単位のマーカーを扱うことから僅かなエラーでもバイアスとなり得る多重比較や集団の構造化の問題 : 解析が多段階の検定からなるため偽陽性が生じてしまう民族性などに相関する多型が特定の形質と相関していると誤って解釈されてしまう

32 SNP-GWAS 解析例使用するデータ (GEO* に登録されている Affymetrix 500K array データ, 565 例 ) ADS( 自閉症スペクトラム ) 患者 : 282 例健常者 : 283 例解析対象 SNP 数 : 499,264 *GEO: Gene Expression Omnibus マイクロアレイや次世代シークエンスデータなどによるゲノム情報を登録したパブリックデータベース SVS によるシームレスな解析 1. クオリティコントロール SNP Call Rate の検証 IBD の検証集団階層化の検証 SNP の検証 (Call rate, MAF, HWE) 2. SNP 関連解析遺伝学モデル統計検定多重検定の補正 PCA 補正

33 クオリティコントロール : SNP call rate の検証 Genotype Statistics by Sample: SNP の Call Rate が低いサンプルは DNA の品質および濃度に問題があると考えられる Genotype Statistics Sample で各サンプルの SNP Call Rate を計算して検証する

未満だったサンプルは解析から除外される Activate by Threshold により閾値に基づくフィルタリングが可能 : フィルタリングされたサンプルは灰色に表示される

34 クオリティコントロール : 各サンプルの SNP call rate 検証 Genotype Statistics Sample で Call Rate の他にもコールされたジェノタイプや Heterozygosity Rate などを算出 SNP Call Rate が 93%~97% 未満が一般的な指標として用いられ未満だったサンプルは解析から除外される Activate by Threshold により閾値に基づくフィルタリングが可能 : フィルタリングされたサンプルは灰色に表示されるフィルタリングしたサンプルのサブセットを作成可能 Heterozygosity Rate を基にレポート上の性別情報と染色体情報から推定される性別情報の一致不一致も検証しフィルタリングをおこなうことも可能

35 クオリティコントロール : IBD の検証 Identity by Descent Estimation: ジェノタイプ関連解析では各サンプルが独立であることが基本とされている ( サンプル間に血縁関係などがあるとバイアスの原因となる可能性がある ) 検証の指標として Identity by descent(ibd) が推定される IBD 推定値によりサンプル間のコンタミやサンプルのデュプリケーションも検証される

クオリティコントロール : IBD の検証サンプル間のコンタミや血縁関係にあることが疑われる IBD 推定値は 0~1 の数字で表される一般的に推定値が 0.

36 クオリティコントロール : IBD の検証サンプル間のコンタミや血縁関係にあることが疑われる IBD 推定値は 0~1 の数字で表される一般的に推定値がよりも大きい値を示すペアのうち一方が除外される図は IBD 推定値をプロットしたグラフ (IBD 推定値が 1 に近い程赤色に表示されるように設定 ) 同一サンプルの組合せは 1 になるがそれ以外で 1 に近い値を示す場合サンプル間のコンタミや家族関係にあることが示唆される

37 クオリティコントロール : 集団階層化の検証 Genotype Principal Component Analysis: 集団間の相違に起因する SNP の有意差が, ある形質の有無との関連性に起因していると誤って解釈されることがある ( 集団階層化の問題 ) 集団の階層化の問題の検証に主成分分析 (PCA) が利用される計算する主成分数や標準化法などを設定可能

38 クオリティコントロール : 集団階層化の検証サンプル白人アジア人アフリカ人 PCA で算出した固有値をプロットすることで視覚的に集団の階層化を検証できる図ではリファレンスとして HapMap データ ( 白人アジア人アフリカ人 ) を含めた PCA をプロットしているサンプル集団は白人種やアジア系およびアフリカ系の 3 集団から構成されていることを示唆している

MAF, HWE が評価され Call Rate や MAF の低い SNP, HWE から大きく逸脱する SNP を除外する

39 クオリティコントロール : SNP の検証 (Call rate, MAF, HWE) Genotype Filtering by Marker: ジェノタイピングの不十分もしくはエラーの疑われる SNP を検証する標準的な操作として, Call Rate, MAF, HWE が評価され Call Rate や MAF の低い SNP, HWE から大きく逸脱する SNP を除外する一般的には以下の閾値が設定される Call Rate < 0.95, MAF < 0.01 ~ 0.05, HWE < ~ 5.7 x 10-7

40 SNP 関連解析 : 集団間で有意差のある SNP の同定 Full Data 図. 関連解析の遺伝学モデルおよび検定手法例 (D: メジャーアレル, d: マイナーアレル, a~f: ジェノタイプ数 ) 遺伝学モデルにはAdditive, Dominant, Recessive Modelがある Additive Model では DD, Dd, dd を分けて取り扱うのに対し, Dominant および Recessive Model では Dd を DD や dd と一緒にし, 2 グループとして取り扱う計算方法として Additive Model でトレンドテスト, Dominant や Recessive Model ではカイ二乗検定が用いられる Additive Model (Cochran- Armitage trend test) Dominant Model ((Pearson) Chi-Squared test)) Recessive Model ((Pearson) Chi-Sqared test) ジェノタイプ関連解析に用いられる遺伝学モデル計算方法

SNP 関連解析 : Genotype Association Test Genotype Association Test により SNP 関連解析を実行 SVS では各種遺伝学モデル検定手法に対応遺伝学モデルテスト Additive model Dominant model Recessive

41 SNP 関連解析 : Genotype Association Test Genotype Association Test により SNP 関連解析を実行 SVS では各種遺伝学モデル検定手法に対応遺伝学モデルテスト Additive model Dominant model Recessive model Basic allelic test Genotypic test 検定手法 Correlation/ Trend test Cochran-Armitage Trend test (Pearson) Chi-Squared P-P/ Q-Q plot 用データの作成 and more PCA による補正の設定

42 SNP 関連解析 : Genotype Association Test 結果 Genotype Association Test: 選択した遺伝学モデル検定方法に基づいて p-value が計算される P-P/ Q-Q plot オプションを設定しておくとそれらのプロットも作成可能

43 SNP 関連解析 : ビジュアライゼーション (GenomeBrowse) Plot Variable in GenomeBrowse により Manhattan plot を作成できる図では 6 番染色体上に有意な SNP が多くみられるテーブルアイコン ( 図中赤丸 ) をクリックするとテーブルデータが表示される ( 図中緑枠 )

44 SNP 関連解析 : ビジュアライゼーション (GenomeBrowse) Plot 中の任意の領域を拡大しリファレンス遺伝子上のどの位置に SNP があるかを確認できる任意の SNP を選択すると Console にその情報とパブリックデータベースとのリンクが表示される ( 図中青枠 ) テーブル中の任意のデータをクリックしてプロット上の当該箇所にジャンプすることも可能

FBAT Phenotype files) Family-based association tests

45 SVS 機能拡張用アドオン : PBAT PBAT: 家系データに基づく各種解析を可能にするアドオン各種家系データフォーマットのインポート (PED, TPED, BED, FBAT, Pedigree, and FBAT Phenotype files) Family-based association tests (FBAT) の実行 Family-based SNP Association Family-based CNV Association

46 SVS は今回ご紹介した以外にも多数の機能を搭載していますご興味のある方は以下のウェブサイトをご覧ください Filgen: /Product/Bioscience4/goldenhelix/index.html Golden Helix: /index.html SVS にはデモ版 (14 日間 ) がありますご興味のある方は弊社までご連絡ください biosupport@filgen.jp TEL:

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PowerPoint プレゼンテーション SNP & Variation Suite 8 ~ Rare Variant 解析編 ~ フィルジェン株式会社バイオサイエンス部 (biosupport@filgen.jp) 1 Golden Helix 企業概要アメリカのモンタナ州にて1998 年に設立遺伝子解析のリーダー的企業遺伝子解析ソフトウェアおよび解析サービスを提供世界中に数百の大学政府研究機関などのクライアントを保有戦略的パートナー