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1 表ニ-27 ラットの受胎能及び着床までの初期胚の発生への影響に関する試験 ( 投与期間 ) - 雌投与試験 - ラット Crj : CD(SD) IGS (SPF) 9 週齢 :2 匹 / 群 体重 :29~267g サテライト群 : 各 3 匹 / 群 ( 血漿中濃度測定 ) 動物種 系統 週齢 性 体重 投与方法及び期間 被験物質 対照 ( 媒体 ) タ ミ バ ロ テ ン 投与量 (mg/kg/day) 動物数 死亡数 一般状態 体重 ( 増加量 ) 妊娠,3~7 日 摂餌量 妊娠 3 日 親動物 親動物 : 低値 性周期観察 交尾数 (%) 受胎数 (%) 交尾成立日数帝王切開時剖検 黄体数 着床数 初期死亡数胎 ( 着床前死亡率 ) 児生存胚数死亡胚数 (F1) ( 着床後死亡率 ) 一般毒性 生殖機能 初期胚に対する無毒性量 -: 特記すべき所見なし : 平均値 ± 標準偏差 * :p <.5 ** :p <.1.25% メチルセルロース水溶液を交配前 2 週間 交配期間中及び交尾成立後 妊娠 7 日まで反復経口投与 2/2 (1) 2/2 (1) 18/2 (9.) 2/2 (1) 2.7±1. 2.6±.9 17.± ±1.9 精巣の小型化及び軟不妊又は交尾不成化 精巣上体の小型立の相手 の剖検化 16.7± ±1.2 3 (.9±2.2) 3 (.9±3.1) 15.6± ± (7.5±6.5).3mg/kg/day 2/2 (1) 19/2(95.) 2/2 (1) 19/19(1) 2.6±1. 2.5± ± ±1.7 ** 15.2±1.8 * 14.7±1.6 ** 9 (2.8±6.1) 2 (.6±1.9) 14.4±1.8 有核上皮細胞又は白血球増加をみる発情前期及び発情後期像の持続 ( 投与 1~14 日 ) 12.9±2.1 ** 12 (3.7±5.) 17 (5.6±5.4) 33 (12.1±7.1) 164

2 表ニ -28 ラットの受胎能及び着床までの初期胚の発生への影響に関する試験 ( 回復期間 ) - 雌投与試験 - 動物種 系統 週齢 性 体重 ラット Crj : CD(SD) IGS (SPF) 9 週齢 :2 匹 / 群 体重 :29~267g 投与方法及び期間.25% メチルセルロース水溶液を交配前 2 週間反復経口投与 1 週間休薬後交配 親動物 親動物 被験物質 投与量 (mg/kg/day) 死亡数 一般状態 体重 ( 増加量 ) 摂餌量 性周期観察 交尾数 (%) 受胎数 (%) 交尾成立日数 帝王切開時剖検 不妊又は交尾不成立の相手 の剖検 対照 ( 媒体 ) 動物数 19 不整咬合により上切歯を切断 (1 例 ) 19/19 (1) 19/19 (1) 2.6±1.2 黄体数 15.±2.2 着床数 13.9±3.6 タミバロテン 有核上皮細胞の増加をみる発情後期又は発情後期と休止期の持続 ( 回復 ~5 日 ) 19/19 (1) 17/19 (89.5) 2.5± ± ±2.8 胎 児 (F1) 初期死亡数 ( 着床前死亡率 ) 生存胚数 死亡胚数 ( 着床後死亡率 ) -: 特記すべき所見なし : 平均値 ± 標準偏差 * :p <.5 2 (8.3±17.5) 12.5± (13.1±14.4) 1 (3.6±5.2) 13.2± (8.3±15.) * 表ニ -29 ラットの受胎能及び着床までの初期胚の発生への影響に関する試験に係わるトキシコキネティクス - 雌投与試験 - 投与量 (mg/kg/day) 投与 14 日目 2 時間後 4 時間後 回復期間 7 日目.6 3.8±6.6 ND ND.3 36.± ±2.4 ND ± ±22.6 ND 平均値 ± 標準偏差 (n=3) ND:Not Detectable(1.ng / ml 未満 ) 単位 :ng/ml 165

3 (3) ラットにおける出生前及び出生後の発生並びに母体の機能への影響に関する試験添付資料ニ 本試験に用いたタミバロテンの投与量は TOS-8 のラットにおける受胎能及び着床までの初期胚の発生への影響に関する試験 - 雌投与量試験 - 添付資料ニ -11) TOS-8 のラットにおけ -13) る胚 胎児発生への影響に関する試験 - 予備試験 - 添付資料ニ及び TOS-8 のラットにおける4 週間反復経口投与毒性試験 添付資料ニ -5) の試験結果を参考にし 最高投与量は明らかに毒性が発現すると考えられる 1.2 mg/kg/day とし 以下公比約 4として.3 及び.8mg/kg/day を設定した タミバロテンを雌性ラットに mg/kg/day で妊娠 7 日から分娩 21 日まで毎日 1 回経口投与した後 母動物及び出生児に及ぼす影響を検討した 1.2 mg/kg では 21 例の母動物に妊娠が認められたものの 死産児を分娩した1 例以外はいずれも分娩するまでには至らず 胎児はすべて初期死亡胚であった しかし 母動物には被験物質に起因する異常は認められなかった.3 及び.8 mg/kg では 母動物の一般状態 体重 摂餌量 分娩 哺育状態及び剖検所見等に異常は認められなかった 出生児 (F1) の発生について.8 及び.3 mg/kg では用量依存的に体格の小型化などの成長阻害が認められた また 頭部への催奇形性を示唆する所見 すなわち紅涙等の眼科的異常 脳の異常が認められたほか 出生児の外観 胸腹部器官及び尿検査値などに全身的な影響を示唆する所見が認められた その他 雄の出生児には性成熟の遅延及び精子形成異常が認められ生殖機能障害を示唆する所見が観察された 一方 雌動物では卵巣 子宮及び膣などの生殖器には異常は観察されず 生殖機能には影響は認められなかった これらの結果より生殖機能検査における F1 出生児の交尾率の減少傾向及び受胎率の減少は タミバロテン投与による雄性動物への生殖機能障害に起因するものと考えられた 更に.3 mg/kg では出生から離乳までの期間における4 日生存率の減少 出生後から性成熟に至るまでの間の体重の増加抑制が認められた また 口蓋裂 耳の形態学的異常及び機能的異常 ( 耳介反射不全 ) 等の催奇形性を示唆する所見が認められた 出生児の行動機能については.8 及び.3 mg/kg に異常は認められなかった トキシコキネティクスでは 各投与群とも初回投与 ( 妊娠 7 日 ) 及び最終投与 ( 分娩 21 日 ) いずれも投与後 2 時間がピークを示し 血漿中濃度は初回及び最終回投与いずれも用量依存的に増加した 最終回投与における投与前の血漿中濃度は各投与群ともに検出限界 (1.ng/mL) 未満であったことから 本被験物質の生体内への蓄積性は低いものと考えられた 以上の結果より 本試験条件下における母動物に対する一般毒性学的無毒性量は 1.2 mg/kg/day 生殖機能に対する無毒性量は.3 mg/kg/day 出生児への影響に対する無毒性量は.8 mg/kg/day 未満であった なお 結果を表ニ-3 31 に示した 166

4 表ニ -3 ラットにおける出生前及び出生後の発生並びに母体の機能への影響に関する試験 動物種 系統 週齢 性 体重 被験物質投与量 (mg/kg/day) 妊娠動物数 母動物 胎児 (F1) 離乳までの所見 (F1) 投与方法及び期間 体重 ( 増加量 ) 摂餌量 妊娠数 (%) 19/2(95.) 21/21(1.) 22/22(1.) /21(.) 妊娠期間 ( 日 ) b) b) 着床数 22.± ± ±.5 * 15.1± ± ± ±3.3 出産率 (%) b) 86.7± ± ±7.7. 分娩及び哺育状態 b) 出生児数 b) 生存児数 b) 4 日生存率 b) 離乳率 ラット Crj: CD(SD)IGS(SPF) :12 週齢 ( 同居開始時 ) 体重 : 交尾成立時 ( 妊娠 日 )221~34g サテライト群 :.8 及び.3mg/kg は 各 5 匹 / 群 1.2mg/kg は 4 匹 / 群 ( 血漿中濃度測定用 ).25% メチルセルロース水溶液を妊娠 7 日から分娩 21 日まで反復経口投与 対照 ( 媒体 ) 死亡数 一般状態乳腺未発達 (1) F1 離乳時の剖検所見 生存胎児の性比 ( / ) /127 外表異常 一般状態体格小型化紅涙 体格小型化 発育 分化及び反射機能 タミバロテン.3 22 乳腺未発達 (4) 一過性の減少 乳腺未発達 (4) 乳腺の腫瘤 (1) 死産児数 死産児及び出生後死亡児の病理所見 13.6± ±3.7 1.±. 14.2± ± ± ± / ± ±3.2 1.±. 陰茎亀頭と包皮の分離遅延 148/ ± ±18.7 口蓋裂 赤色尿 耳介欠損 脳被膜内出血等 紅涙 体格小型化 耳介欠損 外耳道欠損等 開眼不全 陰茎亀頭と包皮の分離遅延 乳腺未発達 (1) 膣周囲の出血痕 (1) 妊娠 17~2 日低値 妊娠 18 2 日低値 乳腺未発達 (1) 膣内血様物 (1) 1.. / 1 離乳時の剖検所見 紅涙 体格小型化 腎盂拡張 紅涙 体格小型化 腎盂拡張 腹部膨満 回腸にガス貯留 167

5 ( 表ニ -3 の続き ) 被験物質対照 ( 媒体 ) タミバロテン 投与量 (mg/kg/day) 一般状態 尾部先端の痂皮 脱落等 紅涙 眼球混濁等 紅涙 体格小型化 耳介変形 外耳道欠損等 行動機能検査 行動機能検査動物の剖検所見 精巣 精巣上体の小型化 精巣 精巣上体の小型化 紅涙 眼球混濁 斜視 交尾成立母動物の妊娠中の一般状態と体重 体重の増加 紅涙 離乳後の所見 (F1) 交尾成立母動物の剖検所見 生殖機能検査 生殖機能検査用雄動物の剖検所見 腎盂拡張 腎盂に白色液の貯留 受胎率減少傾向 精巣 精巣上体の小型化 左眼球混濁と小型化及び瞳孔散瞳 紅涙 眼球混濁 受胎率低値 精巣 精巣上体の小型化 紅涙 眼球混濁 外耳道欠損 初期胚 (F2) への影響 着床前死亡数の高値 死亡胚数の低値 精子数 精子の運動性 病理組織学的所見 精子数の低値 右精巣湿重量の低値 生殖細胞の限局性消失 多核巨細胞形成等 精子数の低値 運動性低下 右精巣湿重量の低値 生殖細胞の消失 変性 壊死 多核巨細胞形成等 無毒性量母動物 :1.2mg/kg/day 生殖機能:.3mg/kg/day 出生児 :.8mg/kg/day 未満 -: 特記すべき所見なし /: 離乳児が得られず評価対象外 : 生存胎仔が得られた個体数 / 妊娠した個体数 1 b) : 平均値 ± 標準偏差 *:p<.5 表ニ -31 ラットにおける出生前及び出生後の発生並びに母体の機能への影響に関する試験に係わるトキシコキネティクス 投与量 (mg/kg/day) 妊娠 7 日目 2 時間後 4 時間後 投与前 分娩 21 日目 2 時間後 4 時間後.8 (n=5) 4.±8.9 2.±4.5 ND 2.±4.5 ND.3 (n=5) 35.7± ±16. ND 32.4± ± (n=4) 19.5± ±6.1 ND 117.9± ±44.6 平均値 ± 標準偏差 ND(Not Detectable):1.ng / ml 未満 単位 :ng/ml 168

6 (4) ラットにおける胚 胎児発生への影響に関する試験 ( 予備試験 ) 添付資料ニ 試験に用いたタミバロテンの投与量は TOS-8 のラットにおける受胎能及び着床までの初期胚の発生への影響に関する試験 - 雌投与量試験 - 添付資料ニ -11) の試験結果を参考に 高用量を 1.5 mg/kg/day とし 以下公比 5として.3 及び.6 mg/kg/day を設定した タミバロテンを雌性ラットに.6.3 及び 1.5 mg/kg/day の投与量で妊娠 7 日から 17 日まで連続経口投与し タミバロテンの母動物及び胚 胎児の発生に及ぼす影響を予備的に検討した 母動物への影響として.3 mg/kg 以下の用量に死亡はみられず また 一般状態 体重 摂餌量及び帝王切開時の肉眼的所見にも異常は認められなかった 1.5 mg/kg では死亡はみられなかったが 対照に比べて体重及び体重増加量の減少が認められた 胚 胎児発生への影響として.6 mg/kg 量では生存胎児数 生存胎児の性比 生存胎児体重 胎盤重量 死亡胎児数 胎児の外形 内臓及び骨格に異常はみられず 骨格変異の発現率及び骨化進行状態にも対照との間に有意差は認められなかった.3 mg/kg では生存胎児の性比 ( 雄 / 雌 ) の有意な低値 外形異常 ( 口蓋裂 外脳及び眼球低形成 ) の発現率の有意な増加 骨格変異 ( 頸肋 腰肋 ) の発現率の有意な増加が認められた 1.5 mg/kg では胎児がすべて死亡胚であった 妊娠 17 日における血漿中のタミバロテン濃度を測定した結果.6 mg/kg では検出限界 (1.ng/mL) 未満であったが.3 及び 1.5 mg/kg では用量依存的に上昇した 以上の結果より 本試験条件下における母動物に対する一般毒性学的及び生殖機能に対する無毒性量は.3 mg/kg/day 胚 胎児への影響に対する無毒性量は.6 mg/kg/day であった なお 結果を表ニ に示した 169

7 母動物 胎児 (F1) 妊娠動物数死亡数一般状態 体重 ( 増加量 ) 摂餌量剖検所見 黄体数 着床数胎盤重量 (mg) 生存胎児数死亡胎児数 ( 着床後死亡率 ) b) 性比 ( / ) 胎児重量 (g) 外表異常 (%) 内臓異常 (%) 1.33(85/64) 3.58± ±.19 (.) 1(1.3) 6(12.2±31.1).89(59/66) 3.51± ±.33 (.) (.) 妊娠 17~2 日低値 ( 妊娠 14~16,18,2 日 ) 低値 骨格 (%) 異常 (.) (.) (.) 変異 18(25.4) 1(16.4) 38(67.9) ** 骨化進行状態 無毒性量 母動物及び生殖機能 :.3mg/kg/day 胚 胎児 :.6mg/kg/day -: 特記すべき所見なし /: 胎児がすべて死亡胚のため評価対象外 : 平均値 ± 標準偏差 b): 着床後死亡率 ( 死亡胎児数 / 着床数 1) * :p<.5 表ニ -32 ラットにおける胚 胎児発生への影響に関する試験 ( 予備試験 ) 動物種 系統 週齢 性 体重 投与方法及び期間被験物質投与量 (mg/kg/day) ** :p<.1 ラット Crj: CD(SD)IGS(SPF) :11 週齢 ( 同居開始時 ) 体重 : 交尾成立時 ( 妊娠 日 )221~281g サテライト群 : 3 匹 / 群 ( 血漿中濃度測定用 ).25% メチルセルロース水溶液を妊娠 7 日から妊娠 17 日まで (11 日間 ) 反復経口投与 対照 ( 媒体 ) タミバロテン 妊娠 2 日低値 16.± ± ± ± ± ± ± ± ±46 44±41 454± ± ±4.6.±. ** 7(4.5±4.2) 14.1±2.3 9(7.±1.9) 158(1±.) **.79(56/71) * 3.58± ±.21 1(7.9) * 3(4.9) 表ニ -33 ラットにおける胚 胎児発生への影響に関する試験 ( 予備試験 ) に係わるトキシコキネティクス 投与量 (mg/kg/day) 妊娠 17 日目 2 時間後 4 時間後.6 ND ± ±56.5 ND 29.5± ±2.3 平均値 ± 標準偏差 (n=3) ND:Not Detectable(1.ng / ml 未満 ) 単位 :ng/ml 17

8 (5) ラットにおける胚 胎児発生への影響に関する試験添付資料ニ 試験に用いたタミバロテンの投与量は TOS-8 のラットにおける胚 胎児発生への影響に -13) 関する試験 ( 予備試験 ) 添付資料ニ及び TOS-8 のラットにおける出生前及び出生後の発生並びに母体の機能への影響に関する試験 添付資料ニ -12) の試験結果を参考に 毒性が確実に発現すると考えられる.3 mg/kg/day を高用量とし 以下公比 4として.8 及び.2mg/kg/day を設定した 雌性ラットにタミバロテンを.2.8 及び.3 mg/kg の3 用量で妊娠 7 日から 17 日 ( 着床から硬口蓋の閉鎖までの期間 ) まで反復経口投与し 妊娠 2 日に帝王切開を行い 母動物及び胚 胎児の発生に及ぼす影響を検討した 母動物への影響として.3 mg/kg/day まで投与しても死亡例はみられず 一般状態 体重 摂餌量及び帝王切開時の肉眼的所見に異常は認められなかった 胚 胎児発生への影響として.3 mg/kg では生存胎児体重の有意な低値 後期死亡胎児数 ( 主に吸収胚 ) の増加が認められた 胎児の外形及び内臓異常として口蓋裂 顔面裂 無眼球 小眼球 眼瞼開存 口角部の裂 外脳 髄膜瘤 耳介形態異常 骨格変異である頸肋 胸椎体ダンベル状骨化 胸椎体二分骨化 短小過剰肋骨及び完全過剰肋骨の多発 骨化遅延が認められた.8 mg/kg では口蓋裂 短小過剰肋骨の多発.2 mg/kg では口蓋裂が認められた 初回投与 ( 妊娠 7 日 ) 及び最終投与 ( 妊娠 17 日 ) における血漿中のタミバロテン濃度は.2 mg/kg では検出限界 (1.ng/mL) 未満であったが.8 及び.3 mg/kg では用量依存的に増加した 以上の結果より 本試験条件下における母動物に対する一般毒性学的及び生殖機能に対する無毒性量は.3 mg/kg/day 胚 胎児への影響に対する無毒性量は.2 mg/kg/day 未満であった なお 結果を表ニ に示した 171

9 表ニ -34 ラットにおける胚 胎児発生への影響に関する試験 動物種 系統 週齢 性 体重 母動物 胎児 (F1) 投与方法及び期間被験物質投与量 (mg/kg/day) 妊娠動物数死亡数一般状態体重 ( 増加量 ) 摂餌量 剖検所見 ラット Crj: CD(SD)IGS(SPF) :11 週齢 ( 同居開始時 ) 体重 : 交尾成立時 ( 妊娠 日 )224~38g サテライト群 : 5 匹 / 群 ( 血漿中濃度測定用 ).25% メチルセルロース水溶液を妊娠 7 日から妊娠 17 日まで反復経口投与 対照 ( 媒体 ) タミバロテン 右腋窩に硬結節 (1) 肝臓肥大 脾臓肥大及び一部黄白色化 (1) 乳腺腫 (1) 黄体数 16.8± ± ± ±1.8 着床数 15.8± ± ± ±1.8 胎盤重量 (mg) 399±34 47±43 47±44 42±48 生存胎児数 14.9± ± ± ±2.5 死亡胎児数 ( 着床後死亡率 ) b) 19(5.6±7.1) 2(5.6±7.3) 17(5.6±7.1) 25(6.6±12.) 性比 ( / ).96(161/167) 1.8(177/164) 1.3(15/145).83(154/185) 胎児重量 (g) 3.67± ± ± ±.34 ** 3.47± ± ± ±.26 ** 外表異常 (%) (.) 4(1.2) 4(1.4) * 35(1.3) ** 内臓異常 (%) 5(3.) 8(4.6) 3(2.) 17(1.8) * 骨格 (%) 異常 (.) (.) (.) (.) 変異 14(8.8) 24(14.7) 37(26.4) ** 117(8.1) ** 胸骨分節 前肢の末 骨化進行状態 節骨及び中手骨の遅 延 無毒性量 母動物及び生殖機能 :.3mg/kg/day 胚 胎児 :.2mg/kg/day 未満 -: 特記すべき所見なし : 平均値 ± 標準偏差 b): 着床後死亡率 ( 死亡胎児数 / 着床数 1) * :p<.5 ** :p<.1 表ニ -35 ラットにおける胚 胎児発生への影響に関する試験に係わるトキシコキネティクス 投与量 (mg/kg/day) 妊娠 7 日目 2 時間後 4 時間後 妊娠 17 日目 投与前 2 時間後 4 時間後.2 ND ND ND ND ND ± ±7. ND 2.1± ± ± ±4.7 ND 25.8± ±3.7 平均値 ± 標準偏差 (n=5) ND(Not Detectable):1.ng/mL 未満単位 :ng/ml 172

10 (6) ウサギにおける胚 胎児発生への影響に関する試験 - 投与量設定試験 - 添付資料ニ 試験に用いたタミバロテンの投与量は 新規合成レチノイド Am-8 の生殖 発生毒性試験 ( 第 3 報 )- 経皮投与によるウサギ胎児器官形成期投与試験 - 参考資料ニ -7) の試験結果を参考に 予定臨床用量である.4 mg/kg/day を高用量とし 以下公比 5として.8 及び.16 mg/kg/day を設定した しかしながら.4 mg/kg/day を投与しても明らかな変化が認められなかったため 1.6 mg/kg/day を追加設定した ウサギの胚 胎児発生への影響に関する試験 ( 本試験 ) の投与量を設定する目的で タミバロテンを非妊娠ウサギに 15 日間経口投与したときの毒性を検討した 更に妊娠ウサギの着床から硬口蓋の閉鎖までの期間に相当する妊娠 6 ~ 2 日まで タミバロテンを経口投与したときの母動物及び胚 胎児の発生に及ぼす影響について予備的に検討した 非妊娠動物では 1.6mg/kg において体重増加量及び摂餌量の有意な減少が認められた.8mg/kg 及び.4mg/kg では 体重の増加抑制傾向と一時的な摂餌量の減少が認められた しかし.16mg/kg 群ではタミバロテンの影響は認められなかった 非妊娠動物に対する無毒性量は.16mg/kg/day であった 非妊娠動物の試験結果より 妊娠動物への投与量を 及び 1.6 mg/kg とし これに媒体投与の対照を含めて 5 用量を設定した その結果.1 mg/kg では母動物及び胚 胎児ともにタミバロテンの影響は認められなかった.1 mg/kg 以上では流産が頻発し.4 及び 1.6 mg/kg では生存胎児が得られなかった また.4 mg/kg 以上では体重減少が認められ 更に 1.6 mg/kg では一時的な摂餌量の減少傾向が認められた.1 mg/kg の生存胎児には 催奇形性を示唆するような所見はみられなかった タミバロテンの血漿中濃度は用量に依存して上昇し 非妊娠動物と妊娠動物における投与量と血漿中濃度には相関性が認められた 以上の結果より 本試験条件下における母動物に対する一般毒性 生殖機能及び胚 胎児への影響に対する無毒性量は.1 mg/kg/day であった 本試験では.1~.1 mg/kg の間で投与量を設定するのが妥当であると考えられた なお 結果を表ニ に示した 表ニ -36 ウサギにおける胚 胎児発生への影響に関する投与量設定試験 ( 非妊娠ウサギ ) 動物種 系統 週齢 性 体重 投与方法及び期間被験物質投与量 (mg/kg/day) 動物数死亡数一般状態体重 ( 増加量 ) 摂餌量 剖検所見無毒性量 -: 特記すべき所見なし 対照 ( 媒体 ) 3 ウサギ Kbl: NZW(SPF) :16 週齢 ( 購入時 ) 体重 : 投与開始時 3.5~3.85kg.25% メチルセルロース水溶液を15 日間反復経口投与 タミバロテン 一時的な減少 (2) 投与 4 日に有意な低値.16mg/kg/day 増加抑制傾向 一時的な減少 (1) ( 投与 8 日以降低値 ) 全例減少投与 11~13 日に有意な低値 173

11 表ニ -37 ウサギにおける胚 胎児発生への影響に関する投与量設定試験 ( 妊娠ウサギ ) 動物種 系統 週齢 性 体重 ウサギ Kbl: NZW(SPF) :18 週齢 :16 週齢 ( 購入時 ) 体重 : 同居開始時 3.5~3.85kg 投与方法及び期間.25% メチルセルロース水溶液を妊娠 6 日から妊娠 2 日まで (15 日間 ) 反復経口投与 被験物質 対照 ( 媒体 ) タミバロテン 投与量 (mg/kg/day) 妊娠動物数 死亡数 一般状態 流産 血様物排出流産 (1) 血様物排出 血様物排出 体重 ( 増加量 ) 一時的な減少 母摂餌量 一時的な減少動 流産例 : 子宮内にペースト状物質貯留物剖検所見 黄体数 1.± ± ±2.5 着床数 8.3± ± ± ± ±1.2 胎盤重量 (g) 5.85± ± ±.99 生存胎児数 7.3±3. 8.8± ±5.2 死亡胎児数 ( 着床前死亡率 ) 1) 7(2.6±29.5) 4(6.5±12.1) 7(3.5±36.8) ( 着床後死亡率 ) 2) 4(9.1±12.9) 4(6.1±9.8) 9 * (59.4±44.9) 34 ** (1.±.) 53 ** (1.±.) 胎 性比 ( / ) 1.64(18/11).66(21/32) 3.33(1/3) 47.8± ± 胎児重量 (g) 児 43.9± ± 外表異常 (F1) 内臓異常 4(8.1±6.6) 4 ** (12.1±21.) 骨格 異常 1(3.1±6.3) 1(3.±5.2) 変異 9(26.9±21.7) 2(35.8±18.8) * 骨化進行状態 無毒性量 母動物及び生殖機能 :.1mg/kg/day 胚 胎児 :.1mg/kg/day -: 特記すべき所見なし * :p<.5 ** :p<.1 /: 流産及び黄体退縮により観察できず 1): 着床前死亡率 :( 黄体数 - 着床数 )/ 黄体数 1 2): 着床後死亡率 : 死亡胎児数 / 着床数 1 : 平均値 ± 標準偏差 174

12 表ニ -38 ウサギにおける胚 胎児発生への影響に関する投与量設定試験に係わるトキシコキネティクス 投与量 (mg/kg/day) 非妊娠ウサギ ( 投与 15 日 ) 投与前 2 時間後 4 時間後.16 (n=3) ND 6.3±.9.8 (n=3) 5.6± ± ± ±9..4 (n=3) 23.8± ± ± (n=3) 121.9± ± ±51.6 投与量 (mg/kg/day) 妊娠ウサギ ( 妊娠 2 日 ) 投与前 2 時間後 4 時間後.1 (n=6) ND 3.4±1. 2.9±1.6.1 (n=5) 7.1± ± (n=6) 29.3± ± ± ± (n=6) 142.6± ± ±132.9 平均値 ± 標準偏差 ND:Not Detectable(2.ng / ml 未満 ) 単位 :ng/ml (7) ウサギにおける胚 胎児発生への影響に関する試験添付資料ニ 試験に用いたタミバロテンの投与量は TOS-8 のウサギにおける胚 胎児発生への影響に関する試験 投与量設定試験 添付資料ニ -15) の試験結果を参考に 無毒性量と考えられる.1 mg/kg/day 及び毒性量で胎児の得られた.1 mg/kg/day を設定し その間を公比約 3で.3 mg/kg/day を設定した タミバロテンを.1.3 及び.1 mg/kg の各投与量で 妊娠ウサギに妊娠 6 日 ~2 日まで経口投与したときの母動物及び胚 胎児の発生に及ぼす影響を検討した 母動物に対する影響は.1 mg/kg において妊娠 16 ~ 23 日の間に胎盤や血様物を排出する流産が認められ 有意な体重増加量の減少と一時的な摂餌量の減少が認められた.1 及び.3 mg/kg には タミバロテンによる影響は認められなかった 胚 胎児への影響は.1 mg/kg では帝王切開時に着床痕跡と胚の吸収が多く認められ 生存胎児数が有意な低値を 死亡胎児数及び着床後死亡率が有意な高値を示した また.1 mg/kg で得られた生存胎児の外表 内臓及び骨格異常数がいずれも有意な高値を示した その主な所見は顔面の異常 ( 疣贅 口角や鼻の形態 ) や水頭が認められ タミバロテン投与に起因するものと考えられた.1 及び.3 mg/kg では胚 胎児に タミバロテンによる影響はみられなか 175

13 った 血漿中タミバロテン濃度は妊娠 6 及び 2 日ともに用量に依存して上昇し 反復投与による蓄積はみられなかった 以上の結果より 本試験条件下における母動物に対する一般毒性 生殖機能及び胚 胎児への影響に対する無毒性量はともに.3 mg/kg/day であった なお 結果を表ニ-39 4 及び図ニ-5に示した 表ニ -39 ウサギにおける胚 胎児発生への影響に関する試験 動物種 系統 週齢 性 体重 ウサギ Kbl: NZW(SPF) :18 週齢 :16 週齢 ( 購入時 ) 体重 : 同居開始時 3.2~4.7kg 投与方法及び期間.25% メチルセルロース水溶液を妊娠 6 日から妊娠 2 日まで (15 日間 ) 反復経口投与 被験物質 対照 ( 媒体 ) タミバロテン 投与量 (mg/kg/day) 妊娠動物数 死亡数 一般状態体重 ( 増加量 ) 血様物排出 (6) 流産(1) 一時的な低値 母摂餌量 一時的な減少と増加動物剖検所見 子宮内血液貯留 (1) 黄体数 9.1± ±2. 9.6± ±2.3 着床数胎盤重量 (g) 7.2± ± ± ± ± ± ± ±.8 生存胎児数 7.1± ± ± ±2.3 ** 死亡胎児数 ( 着床前死亡率 ) 1) 33(2.1±22.3) 15 ** (9.3±8.5) 41(22.3±22.6) 22(14.5±21.7) ( 着床後死亡率 ) 2) 6(4.7±6.8) 7(4.1±8.) 12(6.9±15.2) 96 ** (64.7±28.9 ** ) 胎 性比 ( / ) 1.12(64/57).95(75/79) 1.16(74/64).73(22/3) 児 44.2± ± ± ±5.3 胎児重量 (g) 43.4± ± ± ±4.6 外表異常 1(.7±3.) (.±.) (.±.) 8 ** (19.6±34.8) (F1) 内臓異常 2(2.8±8.6) 2(1.1±3.2) 9(5.2±12.1) 5 * (1.1±18.6) 骨格 異常 2(1.5±4.3) 7(4.3±8.) 6(5.±11.9) 8 ** (19.5±29.4) 変異 56(47.1±18.5) 48 * (29.4±24.5) 49(36.1±23.1) 9 ** (16.1±27.6 ** ) 骨化進行状態 無毒性量 母動物及び生殖機能 :.3mg/kg/day 胚 胎児 :.3mg/kg/day -: 特記すべき所見なし : 平均値 ± 標準偏差 * :p<.5 ** :p<.1 1): 着床前死亡率 :( 黄体数 - 着床数 )/ 黄体数 1 2): 着床後死亡率 : 死亡胎児数 / 着床数 1 176

14 表ニ-4 ウサギにおける胚 胎児発生への影響に関する試験における薬物動態パラメーター 投与量 (mg/kg/day).1 (n=4).3 (n=5).1 (n=4) C max (ng/ml) 妊娠 6 日目 T max (hr) AUC -24 (ng hr/ml) C max (ng/ml) 妊娠 2 日目 T max (hr) AUC -24 (ng hr/ml) 4.6±.9 2.8± ± ±.9 3.3± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± (ng/ml) 7.1mg/kg.3mg/kg 6.1mg/kg (hr) ( 妊娠 6 日目 ) ( ng/ml) (hr) 妊娠 (2 日目 ).1mg/kg.3mg/kg.1mg/kg 図ニ-5 ウサギにおける胚 胎児発生への影響に関する試験の血漿中薬物濃度推移 (n=4.3mg/kg:n=5) 生殖 発生毒性に関するまとめ雄性ラットにタミバロテン.4mg/kg を 1 週間反復経口投与したのち雌性ラットと交配し 生殖機能及び着床前段階の胚発生の影響を調べたところ全例に精巣の軟化と精巣上体の小型化 精細管萎縮 精細管内の未成熟な精子細胞の出現や精子数及び精子の運動性に低下が認められた そしてこれらの症状は 18 週間の休薬でも回復性は認められなかった ラット及びイヌの反復投与毒性試験においても.4mg/kg で精巣にセルトリ細胞遺残 ( 高度の萎縮 ) 精巣上体では管腔内精子の消失と萎縮 管上皮空胞化が観察され雄性生殖器に対する強い毒性が認められるなどレチノイド特有の諸症状がみられた そこで男性に投与する場合は避妊を行うことが必要である 催奇形性についてはラットの妊娠 7 日から妊娠 17 日までの器官形成期にタミバロテンを投与し帝王切開して胚 胎児発生への影響を検討したところ.3mg/kg で胎児に口蓋裂 顔面裂 無眼球 外脳 耳介形態異常などの外形異常や内臓異常 骨格変異である頸肋 短小過 177

15 剰肋骨 完全過剰肋骨の多発などの催奇形性が認められた また.8mg/kg 及び.2mg/kg でも口蓋裂などの催奇形性が認められた ウサギについても器官形成期に投与すると.1mg/kg で顔面の異常や水頭などの外表異常 内臓及び骨格異常などの催奇形性が認められた タミバロテンの胎盤から胎児への移行について薬物動態試験を行ったところと妊娠ラット (13 日目 ) の器官形成期では胎盤通過性は低く 移行したタミバロテンの消失も速やかった 妊娠ラット (18 日目 ) では胎盤通過性は母体血漿中濃度の 19% と周産期においても胎盤通過性は低いが 消失は妊娠 13 日目に比べると緩慢であった 妊娠時期にかかわらず母体血漿中濃度に比べて移行濃度は低いものの胎盤を通して確実に胎児に移行することは明らかである アムノレイク錠 2mg の予想される臨床投与量は 6mg/m 2 であり 体重を 5kg/body として換算すると臨床投与量は.18mg/kg である この投与量は催奇形性が発現するラットの.2mg/kg と ウサギの.1mg/kg より高い投与量に相当することから臨床用量 6mg/m 2 での催奇形性の発現が示唆された よって妊婦又は妊娠している可能性のある婦人並びに妊娠する可能性のある婦人に対してアムノレイク錠 2mg を投与することは禁忌と考える さらに妊娠ラットの器官形成期から分娩後 21 日までタミバロテンを投与すると出生児 (F1) に体格の小型化などの成長阻害や紅涙等の眼の異常と脳の異常が認められたほか 出生児の外観 胸腹部器官などの全身的な影響を示唆する所見も認められた さらに雄の出生児には性成熟の遅延及び精子形成異常と交尾率の減少傾向及び受胎率の減少など生殖機能障害が認められるなど 母親から胎盤や乳汁を通して胎児や出生児への毒性発現が示唆された また分娩後 1~11 日の哺育中ラットにタミバロテンを投与する薬物動態試験において乳汁中濃度は緩やかに上昇し 投与後 12 時間で最高濃度を示した C max は血漿中濃度より約 52 倍と極めて高い濃度で移行することから 出生児に影響を及ぼすことは明らかである 従って授乳中の母親に投与することは乳汁を通してタミバロテンが新生児や乳児に移行し 副作用を発現することが示唆されることから 授乳婦に投与する場合は授乳を避けることが必須である 178

16 4. 依存性及びがん原性 ( 実施しなかった理由 ) 依存性試験を実施しなかった理由として 本剤には一般薬理試験で中枢神経作用が認められず 更に各毒性試験においても中枢神経作用等を示唆する所見は認められなかったことから依存性をみる必要性は低いものと判断した また がん原性試験を実施しなかった理由として 細菌を用いた復帰突然変異試験 チャイニーズハムスター由来の培養細胞 (CHL) 及びマウス骨髄細胞を用いた染色体異常試験より遺伝毒性は認められず 更にラット イヌの反復経口投与毒性試験ではがん原性を示唆する所見は認めなかったこと また本剤がオーファンドラッグとして患者が急性前骨髄球性白血病という極めて致死率の高い疾患に限定されており 救命的な短期投与であることから がん原性試験が想定するような長期の観察による毒性発現をみる必要性は低いものと判断した 5. 抗原性試験添付資料ニ-17 タミバロテンの抗原性を評価するためタミバロテン単独を投与する方法 タミバロテンとアジュバントを混合して投与する方法 タミバロテン- 蛋白結合物とアジュバントを混合して投与する3 種の方法でマウス及びモルモットに感作し タミバロテン特異抗体の産生の有無を検討した (1) マウス-ラット系を用いた受身皮膚アナフィラキシー (PCA) 反応 C3H / He 系雄性マウスにタミバロテンを腹腔内投与し感作した 得られたマウスの感作血清を SD 系雄性ラットの背部に皮内投与し 皮内感作後 24 時間に誘発抗原液を尾静脈に投与し PCA 反応を誘発した Ⅰ 用量 Ⅱ 用量及びⅣ 用量はすべて陰性であったが Ⅲ 用量を陽性対照物質の BGG で誘発したときは全例に陽性が認められ PCA 抗体価は4~ 128 倍であった また タミバロテン- BGG + Alum 感作の ELISA 抗体価は 5 ~ 25 倍であった なお 結果を表ニ に示した 179

17 表ニ -41 タミバロテンのマウス - ラットにおける抗原性試験 ( PCA 反応 ) 感作抗原 感作抗原量 回数 投与経路 誘発抗原 誘発抗原量 投与経路 PCA 反応 (24 時間 ) 2) Ⅰ Ⅱ Ⅲ タミバロテン 25μg/.125mL/ 匹週 3 回 ( 隔日 ) 計 9 回腹腔内投与タミバロテン + FCA 1μg/.2mL/ 匹週 1 回 計 6 回腹腔内投与 タミバロテン - BGG + Alum 2μg/.3mL/ 匹 2 週に1 回 計 3 回腹腔内投与 メチルセルロース (.25%).5mL/ 匹 Ⅳ 週 3 回 ( 隔日 ) 計 9 回腹腔内投与 1):1 % エバンスブルー溶液.5 ml を含む 2): 陽性動物数 / 検査動物数 FCA : Freund's Complete Adjuvant BGG : Bovine γ-globulin Alum : Aluminium hydroxide gel GSA : Guinea-pig Serum Albumin タミバロテン 1mg/mL 1)/ 匹静脈内投与タミバロテン + GSA 1mg/mL 1) / 匹静脈内投与 タミバロテン 1mg/mL 1) / 匹静脈内投与 タミバロテン + GSA 1mg/mL 1) / 匹静脈内投与 タミバロテン 1mg/mL 1) / 匹静脈内投与 タミバロテン + GSA 1mg/mL 1) / 匹静脈内投与 GSA 1mg/mL 1) / 匹静脈内投与 BGG 2mg/mL 1) / 匹静脈内投与 タミバロテン 1mg/mL 1) / 匹静脈内投与 タミバロテン + GSA 1mg/mL 1) / 匹静脈内投与 1 表ニ -42 タミバロテン感作マウスの血清抗体価 ( ELISA 法 ) 感作抗原 感作抗原量 ELISA 抗体価 タミバロテン.25 mg/ 匹 < 1 倍 タミバロテン + FCA.1 mg/ 匹 < 1 倍 タミバロテン - BGG + Alum 2μg/ 匹 メチルセルロース.5mL/ 匹 5 ~ 25 倍 < 1 倍 FCA : Freund's Complete Adjuvant BGG : Bovine γ-globulin Alum : Aluminium hydroxide gel 18

18 (2) モルモット-モルモット系を用いた受身皮膚アナフィラキシー (PCA) 反応 Hartley 系雄性モルモットの背部にタミバロテンを皮下投与し感作した 得られた感作血清を Hartley 系雄性モルモットの背部に皮内投与し 皮内感作後 4 時間及び 24 時間に誘発抗原液を前肢あるいは後肢静脈に投与し PCA 反応を誘発した 4 時間の PCA 反応においてⅠ 用量 Ⅱ 用量 Ⅳ 用量はすべて陰性であったが Ⅲ 用量を陽性対照物質の BGG で誘発したときは全例に陽性が認められ PCA 抗体価は 4525 ~3624 倍であった 24 時間ではⅠ Ⅱ Ⅲ 及びⅣ 用量ともすべて陰性であった なお タミバロテン - BGG + FCA 感作用量 (Ⅲ) の ELISA 抗体価は 1 ~ 625 倍であった なお 結果を表ニ に示した 表ニ -43 タミバロテンのモルモットにおける抗原性試験 ( PCA 反応 ) 感作抗原 感作抗原量 回数 投与経路 Ⅰ Ⅱ Ⅲ タミバロテン.1mg/.5mL/ 匹週 3 回 ( 隔日 ) 計 9 回皮下投与タミバロテン + FCA.1mg/.2mL/ 匹週 1 回 計 6 回皮下投与 タミバロテン - BGG + FCA 1mg/.25mL/ 匹週 1 回 計 6 回皮下投与 メチルセルロース (.25%).5mL/ 匹 Ⅳ 週 3 回 ( 隔日 ) 計 9 回皮下投与 1): 陽性動物数 / 検査動物数 -: 実施せず FCA : Freund's Complete Adjuvant BGG : Bovine γ-globulin GSA : Guinea-pig Serum Albumin 誘発抗原 誘発抗原量 投与経路 タミバロテン 1mg/mL/ 匹静脈内投与 タミバロテン + GSA 1mg/mL/ 匹静脈内投与タミバロテン 1mg/mL/ 匹静脈内投与タミバロテン + GSA 1mg/mL/ 匹静脈内投与 タミバロテン 1mg/mL/ 匹静脈内投与 タミバロテン + GSA 1mg/mL/ 匹静脈内投与 GSA 1mg/mL/ 匹静脈内投与 BGG 2mg/mL/ 匹静脈内投与タミバロテン 1mg/mL/ 匹静脈内投与 タミバロテン + GSA 1mg/mL/ 匹静脈内投与 1) PCA 反応 4 時間 24 時間 1 181

19 表ニ -44 タミバロテン感作モルモットの血清抗体価 ( ELISA 法 ) 感作抗原 感作抗原量 ELISA 抗体価 タミバロテン.1mg/ 匹 < 1 倍 タミバロテン + FCA.1mg/ 匹 タミバロテン - BGG + FCA 1mg/ 匹 メチルセルロース.5mL/ 匹 < 1 倍 1 ~ 625 倍 < 1 倍 FCA : Freund's Complete Adjuvant BGG : Bovine γ-globulin (3) モルモットを用いた能動全身性アナフィラキシー (ASA) 反応 Hartley 系雄性モルモットの背部にタミバロテンを皮下投与し感作した 最終感作後 14 日に誘発抗原をモルモットの前肢あるいは後肢静脈内に投与し ASA 反応を誘発した Ⅰ 用量 Ⅱ 用量及びⅣ 用量は全身症状が認められず すべて陰性であった Ⅲ 用量はタミバロテン タミバロテン- GSA 及び GSA で誘発したときは陰性であったが BGG で誘発したときは全例陽性を示し 3 例が死亡した なお 結果を表ニ-45 に示した 以上の結果より マウス-ラット PCA 反応 モルモット-モルモット PCA 反応及びモルモットを用いた ASA 反応より タミバロテンの抗原性はいずれも認められなかった また ELISA 法においてもタミバロテン特異抗体の産生は認められなかった 182

20 表ニ -45 タミバロテンのモルモットにおける抗原性試験 ( ASA 反応 ) 感作抗原 感作抗原量 回数 投与経路 Ⅰ Ⅱ Ⅲ タミバロテン.1mg/.5mL/ 匹週 3 回 ( 隔日 ) 計 9 回皮下投与タミバロテン + FCA.1mg/.2mL/ 匹週 1 回 計 6 回皮下投与 タミバロテン - BGG + FCA 1mg/.25mL/ 匹週 1 回 計 6 回皮下投与 メチルセルロース (.25%).5mL/ 匹 Ⅳ 週 3 回 ( 隔日 ) 計 9 回皮下投与 1) : 陽性動物数 / 検査動物数 * :1 匹中 3 匹死亡 FCA : Freund's Complete Adjuvant BGG : Bovine γ-globulin GSA : Guinea-pig Serum Albumin 誘発抗原 誘発抗原量 投与経路 タミバロテン 1mg/.5mL/ 匹静脈内投与タミバロテン + GSA 1mg/.5mL/ 匹静脈内投与タミバロテン 1mg/.5mL/ 匹静脈内投与タミバロテン + GSA 1mg/.5mL/ 匹静脈内投与タミバロテン 1mg/.5mL/ 匹静脈内投与タミバロテン + GSA 1mg/.5mL/ 匹静脈内投与 GSA 1mg/.5mL/ 匹静脈内投与 BGG 2mg/.5mL/ 匹静脈内投与タミバロテン 1mg/.5mL/ 匹静脈内投与 タミバロテン + GSA 1mg/.5mL/ 匹静脈内投与 1) ASA 反応 1 * /5 /5 6. 遺伝毒性試験 (1) 細菌を用いる復帰突然変異試験添付資料ニ-18 ネズミチフス菌の TA1 TA1535 TA98 TA1537 株 大腸菌の WP2uvrA 株を用いた 復帰変異試験 ( プレインキュベーション法 ) を実施した 用量を設定するための予備試験を行ない タミバロテンの試験菌株に対する生育阻害作用を調べた結果を表ニ-46 に示した 試験菌株 TA1537 TA1 に対しては代謝活性化 非代謝活性化試験とも 625μg/plate 以上で生育阻害が認められ TA1535 に対しては非代謝活性化試験では 125μg/plate 以上 代謝活性化試験では 25μg/plate 以上で生育阻害が認められた TA98 WP2uveA に対しては代謝活性化 非代謝活性化試験とも生育阻害は認められなかったことより 本試験のタミバロテン濃度は表ニ-47 のように設定した 183

21 代謝活性化 試験 物質 復帰変異コロニー数 1) / plate 用量 S. Typhimurium E.coli μg / plate TA1 TA1535 TA98 TA1537 WP2uvrA 陰性対照 (H 2 O) 2) 陰性対照 (DMSO) 2) タミバロテン 1, 無 S9 Mix 2, , MMS 2 (H 2 O) 626 3) 陽性対照 NaN 3.5 (H 2 O) 329 μg/plate AF2.1(DMSO) 59 9AA 8 (DMSO) 4 ENNG 2 (DMSO) 566 有 S9 Mix 表ニ -46 タミバロテンの細菌株を用いる復帰突然変異試験 ( 予備試験 ) 試験方法プレインキュベーション法 陰性対照 (H 2 O) 2) 陰性対照 (DMSO) 2) タミバロテン 3) 陽性対照 μg / plate 2AA , , , (DMSO) 325 1(DMSO) 282 2(DMSO) (DMSO) : 未実施 1):2 枚の平板より得た平均値 2): 陰性対照 ( 溶媒対照 ) として 滅菌蒸留水 (H 2 O) 及びDMSO(Dimethyl sulfoxide) を用いた 3):MMS : Methylmethanesulfonate, NaN 3 : Sodium azide, ENNG : N-Ethyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine AF-2 : 2-(2-Furyl)-3-(5-nitro-2-furyl)acrylamide, 2AA : 2-Aminoanthracene 9AA : 9-Aminoacridine hydrochloride 表ニ -47 タミバロテンの試験菌株を用いる復帰突然変異試験 ( 本試験の群構成 ) Group No. 試料 S9 試験菌株濃度 (μg/plate) 1 コントロール -,+ 全菌株 2 タミバロテン -,+ 3 タミバロテン -,+ TA98 WP2uvrA TA1535 TA1537 TA1 5,25,125,625,313,156 5,25,125,625,313,156,78,39 184

22 タミバロテン処理用量において TA1 TA1535 TA98 TA1537 及び WP2uvrA のいずれの菌株に対しても S9 mix 添加の有無にかかわらず 溶媒対照 (DMSO) 平板と比較して復帰変異コロニー数の増加は認められなかった ただし TA1537 及び TA1 の試験菌株に対しては代謝 非代謝活性化試験ともに 625μg/plate 以上で TA1535 に対しては非代謝活性化試験で 125μg/plate 以上 代謝活性化試験では 25μg/plate 以上で生育阻害が認められ 復帰変異コロニー数が減少した しかし いずれの指示菌株においても S9 mix 添加の有無にかかわらず復帰変異コロニー数を増加させる作用は認められず 検体用量と復帰変異コロニー数との間にも用量作用相関は認められなかった これらの結果より タミバロテンの復帰変異原性は陰性と判断した なお 結果を表ニ-48 に示した 185

23 表ニ -48 タミバロテンの細菌株を用いる復帰突然変異試験 試験方法 プレインキュベーション法 代謝活性化 無 S9 M ix 有 S9 M ix *: 生育阻害 試験物 質 復帰変異コロニー数 1) / plate 用量 E.coli μg / plate S. Typhimurium TA1 TA1535 TA98 TA1537 WP2uvrA 陰性対照 (H 2 O) 2) 陰性対照 (DMSO) 2) タミバロテン * * 44 1,25 68 * 12 * 22 4 * 4 2,5 16 * 5 * 21 * 36 5, 15 * 2 * 15 * 32 MMS 2 (H 2 O) 55 3) 陽性対照 NaN 3.5 (H 2 O) 316 μg/plate AF2.1(DMSO) 478 9AA 8 (DMSO) 345 ENNG 2 (DMSO) 743 陰性対照 (H 2 O) 2) 陰性対照 (DMSO) 2) タミバロテン * * 42 1,25 98 * * 46 2,5 64 * 13 * 3 * 36 5, 11 * 7 * 2 * 37.5 (DMSO) 28 3) 陽性対照 1(DMSO) AA μg / p late 2(DMSO) (DMSO) : 未実施 1):2 枚の平板より得た平均値 2): 陰性対照 ( 溶媒対照 ) として 滅菌蒸留水 (H 2 O) 及びDMSO(Dimethyl sulfoxide) を用いた 3):MMS : Methylmethanesulfonate, NaN 3 : Sodium azide, ENNG : N-Ethyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine AF-2 : 2-(2-Furyl)-3-(5-nitro-2-furyl)acrylamide, 2AA : 2-Aminoanthracene 9AA : 9-Aminoacridine hydrochloride 186

24 (2) 哺乳類の培養細胞を用いる染色体異常試験添付資料ニ-19 チャイニーズ ハムスター由来の培養細胞 (CHL/IU) を用いて 直接法 (24 48 時間 ) 及び代謝活性化法 (+S9 mix -S9 mix) により染色体異常誘発性を検討した 細胞増殖抑制試験の結果を基に タミバロテンの用量は ED 5 値を CHL 細胞に作用させる被験物質の最高濃度とし 以下公比 2で階段希釈して設定した すなわち 直接法では μg/ml 代謝活性化法では μg/ml の濃度とした その結果 直接法では 24 時間及び 48 時間ともタミバロテンのすべての処理濃度において 染色体異常細胞の誘発性は認められなかった 代謝活性化法では S9 mix を添加しない場合 86 μg/ml の TA に染色体異常細胞が有意に誘発されたが S9 mix を添加して代謝活性化すると染色体異常誘発性は消失した なお 結果を表ニ-49 に示した 表ニ -49 タミバロテンの培養細胞を用いた染色体異常試験 使用細胞チャイニーズ ハムスター培養細胞 ( CHL / IU ) 群構成陰性対照群陽性対照群 タミバロテン群 用量 (μg/ml) DMSO 培養液 (.15%) MMC 直 処理時間 (hr) 接 法 試験成績 染色体異 TAG 常細胞の出現頻度 (%) TA 倍数性細胞の出現頻度 (%) ** 33.5 ** 群構成陰性対照群陽性対照群タミバロテン群 用量 (μg/ml) 培養液 DMSO (.1%) CPA 代代謝活性化 (S9) の有無無有無有無有無有無有無有謝活処理時間 (hr) 6 ~ 18 性化染色体異 TAG 法試常細胞の験出現頻度 TA ** ** 3. 成 (%) 績倍数性細胞の 出現頻度 (%) :p<.1 (Fisherの直接確率計算法) DMSO : Dimethyl sulfoxide MMC : Mitomycin C CPA : Cyclophosphamide TAG : Total number of aberrant cells including gaps TA : Total number of aberrant cells excluding gaps 187

25 (3) マウス骨髄細胞を用いる染色体異常試験添付資料ニ-2 in vivo 染色体異常試験を Jcl:ICR 系雄性マウスを用いて単回あるいは5 日間連続皮下投与したときの骨髄細胞における染色体異常誘発性を検討した 用量を設定するための予備試験を行い 単回皮下投与は 1 mg/kg を最高用量とし 以下公比 2で段階希釈した mg/kg の4 用量を また5 日間連続皮下投与では 5 mg/kg/day を最高用量とし 以下 mg/kg/day の投与量を設定した その結果 タミバロテンに起因すると考えられる染色体異常は認められなかったことから マウス骨髄細胞に変異原性を示さないと判断した なお 結果を表ニ-5 に示した 表ニ -5 タミバロテンのマウス骨髄細胞を用いた染色体異常試験 動物種 系統 週齢 性 体重 マウス Jcl:ICR 9 週齢 雄 32~45g 使用動物数 55 匹 (5 匹 / 群 ) 投与経路皮下投与 ( 陽性対照 MMC は腹腔内単回投与 ) 投与回数 標本染色方法 陽性対照薬 / 陰性対照薬 単回及び 5 日間連続皮下投与 ギムザ染色法 Mitomycin (MMC) /.25% methylcellulose 標本作製時期 単回 : 投与後 24 時間 連続 : 最終投与後 6 時間 群構成 陰性対照群 陽性対照群 (MMC) タミバロテン群 投与量 (mg/kg/day ) 単回投与 染色体異常細胞の出現頻度 (%) TAG TA 日連続投与 倍数性細胞の出現頻度 (%).1 投与量 (mg/kg/day) 染色体異常細胞の出現頻度 (%) TAG TA. 3. (1 回投与 ) * 倍数性細胞の出現頻度 (%) * p<.5 :5 匹中 1 匹死亡 TAG : Total number of aberrant cells including gaps TA : Total number of aberrant cells excluding gaps 188

26 7. その他の試験 (1) ラットにおける 2 週間反復経口投与トキシコキネティクス試験添付資料ニ ) ラット反復経口投与毒性試験添付資料ニ及びラットの生殖 発生毒性試験添付資料ニ 13 14) のトキシコキネティクスにおいて低用量ではいずれも検出限界 (1.ng/mL) 未満であった そこで 検出限界を 2. ng/ml に設定し 検出可能な最低投与量を検討するため6 週齢の雄性ラットにタミバロテン.16 mg/kg.32 及び.4mg/kg を単回経口投与し 投与後 2 時間の血漿中濃度を測定したところ.32 mg/kg 以上で検出が可能であった これらの結果を参考にパラメーターを算出できる低用量を.15 mg/kg とし用量依存性を確認するため約 2.7 倍の.4 mg/kg を高用量に設定した 1 群 2 匹 ( 採血時間ごとに各 5 匹 ) の雄性ラットに.15 及び.4 mg/kg/day の用量で2 週間反復経口投与し 初回投与 ( 投与 日 ) 及び最終投与 ( 投与 13 日 ) に経時的に採血し血漿中のタミバロテン濃度を測定した T max は.15 mg/kg では初回投与及び最終投与ともに投与後 1 時間.4 mg/kg では初回投与が投与後.5 時間 最終投与は投与後 1 時間であった その後はいずれも経時的に減少し投与後 24 時間では検出限界 (2. ng/ml) 未満となった また最終投与の投与前の血漿中濃度は.15 及び.4mg/kg でいずれも検出限界未満であった C max は.15 mg/kg の初回投与が 12.2 ng/ml 最終投与が 1.6 ng/ml であった 一方.4 mg/kg の初回投与が 38.8 ng/ml 最終投与が 34.6 ng/ml であった AUC ( 24) は.15 mg/kg の初回投与が ng hr/ml 最終投与が 13.9 ng hr/ml であった 一方.4 mg/kg の初回投与が 43.1 ng hr/ml 最終投与が 37.4 ng hr/ml であった.15 及び.4 mg/kg の C max 及び AUC ( 24) はいずれも用量に依存した増加傾向が認められた また各投与量における最終投与時の C max 及び AUC ( 24) は初回投与とほぼ同様であった なお 結果を表ニ-51 及び図ニ-6 に示した 表ニ-51 ラットにおける2 週間反復経口投与トキシコキネティクス試験における薬物動態パラメーター 投与量 (mg/kg/day) C max (ng/ml) 投与開始日 T max (hr) AUC -24 (ng hr/ml) C max (ng/ml) 投与 13 日目 T max (hr) AUC -24 (ng hr/ml)

27 図ニ-6 ラットにおける2 週間反復経口投与トキシコキネティクス試験の血漿中薬物濃度推移 (n=5) (2) イヌを用いた血中動態試験添付資料ニ 開発過程で結晶多形として不安定なⅠ 型 安定なⅡ 型及びⅢ 型 (Ⅰ 及びⅡ 型の混合型 ) が確認された そこでⅠ 型及びⅡ 型の経口投与による薬物動態を比較するために ビーグルを用いてクロスオーバー法により血漿中薬物濃度を測定した 投与方法はビーグルの雄を1 群 1 匹とし2 群 (α β 群 ) を設定した 第 Ⅰ 期投与はα 群に Ⅱ 型をβ 群にはⅠ 型をそれぞれ.4mg/kg 投与した 採血時点は投与前 投与後 及び 48 時間の 1 点とした 投与後 1 週間の休薬期間をおき 第 Ⅱ 期投与はα 群にⅠ 型をβ 群にⅡ 型をそれぞれ.4mg/kg 投与し 第 Ⅰ 期と同様に採血した Ⅰ 型及びⅡ 型の T max C max 及び AUCtはそれぞれ 1.9 時間及び 2.2 時間 534. 及び ng/ml 及び ng hr/ml であった 両結晶の血漿中濃度の推移は類似していたが Ⅱ 型はⅠ 型に比べ血漿中濃度が低く C max 及び AUCtの比較では有意差が認められた 対数変換した C max 及び AUCtの 9% 信頼区間はそれぞれ log(.55)~ log(.83) log (.62)~ log(.91) と算出され いずれも許容域である log(.8)~ log(1.25) 外であった 従ってⅠ 型とⅡ 型は生物学的には同等でないと判定された 血漿中濃度はⅡ 型の方が低いことから 毒性に及ぼす影響はⅠ 型より少ないと示唆された またⅢ 型はⅠ 型とⅡ 型の混合物であるが混合比率を一定に調製することはできない しかし Ⅲ 型が混合物である以上 Ⅲ 型の血中濃度はⅠ 型とⅡ 型の中間の数値を示すものと考える なお 結果を表ニ-52 及び図ニ-7 に示した 19

28 表ニ-52 イヌを用いてⅠ 型及びⅡ 型のタミバロテンをクロスオーバー法により投与したときの薬物動態パラメーター 結晶型 C max (ng/ml) AUCt (ng hr/ml) AUC (ng hr/ml) T max (hr) T 1/2 (hr) Ⅱ 362.2±13.5* ±763.1* ± ±.9 5.7±1.8 Ⅰ 534.±12.5* ±517.8* ± ±.9 5.9±1.7 投与量 :.4mg/kg *:p<.5 6 Ⅰ 型 Ⅱ 型 (ng/ml) (hr) 図ニ-7 イヌを用いてⅠ 型及びⅡ 型のタミバロテンをクロスオーバー法により投与したときの血漿中薬物濃度推移 (n=1) 191

29 TK 試験及び PK 試験のまとめ 薬物動態パラメーター (AUC) を比較するためラットは 2 週間反復経口投与トキシコキネティクス試験の開始日を ウサギは胚 胎児発生への影響に関する試験の妊娠 6 日目を イヌは 4 週間反復経口投与毒性試験の投与 1 日目を引用した また ヒトは後期第 Ⅱ 相臨床試験で PK 試験を行い 投与量に近似した症例を引用した AUC の比較を表ニ-53 に示した 表ニ -53 AUC の比較表 投与量 (mg/kg) AUC(ng hr/ml) ラット ( ) ウサギ ( ) イヌ ( ) イヌ ( ) ヒト ( ) ヒト ( ) ± ± ) ) ± ) ) ± ± ヒトの投与量は体重から換算 :1).79mg/kg 2).77mg/kg 3).156mg/kg 4).144mg/kg ヒト :AUC ~ ラットについては単回及び反復経口投与毒性試験において 2 時間と 4 時間の血漿中濃度を比較するといずれの試験とも雌の吸収が雄より高い傾向が認められた しかしラットの薬物動態試験では雌雄の差は認められなかった またイヌも雌雄の差は認められなかった ラットの AUC はウサギやイヌに比べると明らかに小さく また 薬物動態試験においてもラットの AUC はイヌに比べて低く種差が認められた しかし ラットの暴露量がイヌに比べて少ないにもかかわらずいずれの動物に対しても強い精巣毒性を示した ヒトの PK 試験における AUC に性差は認められず 臨床試験における有害事象及び副作用の発現についても性差は認められなかった 予想臨床投与量は 6mg/m 2 ( 増減 :3~12mg/m 2 ) であり 平均体重を 5kg で換算すると投与量は概略.18mg/kg であることから臨床用量が動物の無毒性量を超えることになる 従って 安全性については動物の毒性を参考にじゅうぶん注意する必要がある 192

30 8. 統計学的処理単回経口投与毒性試験 反復経口投与毒性試験及び生殖 発生毒性試験の測定値について原則として下記の統計学的処理を実施した なお 有意水準は危険率 5% 及び1% とした 対照との有意差検定は Bartlett 法により等分散性の検定を行い 等分散の場合は更に一元配置分散分析を行い 有意な場合で各用量の例数が等しいときには Dunnett 法 例数が異なるときには Scheffé 法により平均値の比較を行った 不等分散の場合は Kruskal-Wallis の H 検定を行い 有意な場合は Dunnett 法又は Scheffé 法により平均順位の比較を行った ただし 各試験の統計学的処理として 以下に記した (1) 単回経口投与毒性試験各用量の死亡状況からプロビット法を用いて LD 5 値を求めた (2) 反復経口投与毒性試験 1) 眼科学的検査は Fisher の直接確率試験法で行った 2) 尿の定性検査 尿沈渣 血液学的検査の白血球型別百分率 骨髄型別分類については Kruskal-Wallis の H 検定を行い 有意な場合は同様に Dunnett 法又は Scheffé 法により平均順位の比較を行った 3) 定量データについて Bartlett 法により等分散性の検定を行い 等分散ならば Dunnett 法を不等分散ならば Non-parametric 型の Dunnett 検定を用いて 対照と比較した (3) 生殖 発生毒性試験 1) 交尾率 受胎率 出産率 生存胎児の性比 死亡胎児数 出生児の発育 分化及び反射機能検査 (T-maze 試験 ) 及び骨化遅延数は χ 2 検定あるいは Fisher の直接確率試験法で行った 2) 妊娠期間 着床前死亡率 着床後死亡率 精子の運動性 出生児の離乳率 4 日生存率 外形 内臓 骨格異常及び骨格変異の発現率 陰茎亀頭と包皮との分離 膣開口 行動機能検査 (T-maze 試験以外 ) 胸骨数 仙尾椎数 四肢の中手 中足 基節及び末節骨数は Kruskal-Wallis の H 検定を行い 有意な場合は Dunnett 法又は Scheffé 法により平均順位の比較を行った 193

31 参考資料 ニ-1) 北村忠久他 :Prog.Med. 15,585,1995 新規合成レチノイド Am-8 のラットおよびイヌにおける単回投与毒性試験ニ-2)Harling R.J. et al.: 社内資料 Am-8 oral toxicity study in beagle dogs (Final report single dose followed by 9 weeks recovery) ニ-3) 清水茂一他 : 社内資料 TOS-8 のビーグルにおける単回経皮投与毒性試験ニ-4) 加藤育雄他 :Preg.Med. 14,32,1994 新規合成レチノイド Am-8 のラットにおける 3 日反復経口投与毒性試験ニ-5) 伊藤文男他 :Prog.Med. 14,3213,1994 新規合成レチノイド Am-8 のラットにおける 3 ヶ月間反復経口投与毒性試験ニ-6)Harling R.J. et al.: 社内資料 Am-8 oral toxicity study in beagle dogs (Final report-repeated daily dosage for 5 days) ニ-7) 長谷川靖彦他 :Preg.Med. 15,1719,1995 新規合成レチノイド Am-8 の生殖 発生毒性試験 ( 第 3 報 ) - 経皮投与によるウサギ胎児器官形成期投与試験 - 194