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1 Page 1 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 1mL 第 2 部 ( モジュール 2):CTD の概要 ( サマリー ) 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 毒性試験の概要文 デンカ生研株式会社

2 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験の概要文 Page 2

3 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験の概要文 Page 3 目 次 毒性試験の概要文 まとめ 単回投与毒性試験 反復投与毒性試験 遺伝毒性試験 がん原性試験 生殖発生毒性試験 局所刺激性試験 その他の毒性試験 単回投与毒性試験 ラット単回皮下投与毒性試験 イヌ単回皮下投与毒性試験 反復投与毒性試験 ラット 4 週間間歇皮下投与毒性試験 遺伝毒性試験 がん原性試験 生殖発生毒性試験 ラット胚 胎児発生に関する試験 ラット出生前及び出生後の発生並びに母動物の機能に関する試験 雄ラット受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験 局所刺激性試験 ウサギ単回皮下投与刺激性試験 ウサギ 2 回反復皮下投与刺激性試験 ウサギ単回筋肉内投与刺激性試験 ウサギ 2 回反復筋肉内投与刺激性試験 その他の毒性試験 考察及び結論 参考文献一覧...15

4 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験の概要文 Page 4 略号及び用語表 略号 用語 ALT(GPT) A-04-01D DNA DPT ワクチン 略していない表現又は説明 alanine aminotransferase アラニンアミノトランスフェラーゼ 本品の治験成分記号 デンカ生研株式会社における開発コード 水酸化アルミニウムゲルをアジュバントとして添加した製剤 Deoxyribonucleic acid デオキシリボ核酸 Adsorbed diphtheria-purified pertussis-tetanus combined vaccine 沈降精製百日せきジフテリア破傷風混合ワクチン GLP Good Laboratory Practice HA haemagglutinin ヘムアグルチニン ( 赤血球凝集素 ) LDH NOAEL lactase dehydrogenase 乳酸脱水素酵素 No Observed Adverse Effect Level 無毒性量

5 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験の概要文 毒性試験の概要文 Page まとめ A-04-01D の毒性試験として ラット及びイヌを用いた単回投与毒性試験 ラットを用いた反復投与毒性試験 ラットを用いた生殖発生毒性試験 ウサギを用いた局所刺激性試験をそれぞれ GLP 基準に準拠して実施した 実施した毒性試験を表 に示す 表 毒性試験プログラム 試験の種類及び期間投与経路動物種 単回投与毒性試験皮下ラット及びイヌ 反復投与毒性試験 4 週間間歇投与皮下ラット 生殖発生毒性試験 胚 胎児発生に関する試験出生前及び出生後の発生並びに母動物の機能に関する試験受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験 皮下皮下 皮下 ラットラット ラット 局所刺激性試験 単回及び 2 回反復投与 皮下及び筋肉内 ウサギ 単回投与毒性試験ラット単回皮下投与毒性試験では 10 ml/kg まで死亡例は認められず 概略の致死量は 10 ml/kg を上回った イヌ単回皮下投与毒性試験では 5 ml/kg まで死亡例は認められず 概略の致死量は 5 ml/kg を上回った ラット及びイヌのいずれにおいても投与部位に結節がみられ 病理組織学的検査で肉芽腫の形成がみられた イヌでは投与局所の炎症に伴う白血球数及び好中球数の増加傾向 LDH 及び γ-グロブリンの上昇傾向が認められた ラットでは被験物質の大量投与に起因した一過性の体重の減少あるいは増加抑制が投与翌日にみられた 反復投与毒性試験ラット 4 週間間歇皮下投与毒性試験では 投与部位に白色結節が 0.25 及び 0.5 ml/kg 投与群の雌雄に用量依存的に発生し その病理組織学的所見は 肉芽腫及び炎症性細胞浸潤であった 投与部位における局所変化は A-04-01D がアジュバントとして用いた水酸化アルミニウムを添加したワクチン製剤であることに起因した炎症反応と考えられた その他 死亡はなく 一般状態 体重 摂餌量 尿検査 眼科学的検査 血液学的検査 血液生化学的検査及び器官重量に A-04-01D 投与に起因した変化は認められなかった したがって 雌雄ともに無毒性量 (NOAEL) は 0.5 ml/kg と判断した

6 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験の概要文 Page 遺伝毒性試験該当試験なし がん原性試験該当試験なし 生殖発生毒性試験ラット胚 胎児発生に関する試験では ラット胎児の着床から硬口蓋閉鎖の期間 母動物に間歇皮下投与した その結果 0.5 ml/kg まで母動物及び胚 胎児発生に及ぼす影響は認められず 母動物の一般毒性及び生殖機能並びに胚 胎児発生に関する無毒性量は 0.5 ml/kg と判断した ラット出生前及び出生後の発生並びに母動物の機能に関する試験では ラット胎児の着床から離乳までの期間 母動物に間歇皮下投与した その結果 0.5 ml/kg まで母動物並びに出生児の発生 成長 発達 行動及び機能に及ぼす影響は認められず 母動物の一般毒性及び生殖機能並びに出生児に対する無毒性量は 0.5 ml/kg と判断した ラット 4 週間間歇皮下投与毒性試験の結果 0.5 ml/kg 群の雄の前立腺及び精嚢に器官重量で陰性対照群と比較して有意な低値と用量依存性が認められた 試験施設における器官重量の背景データとの比較では有意差はなく 病理組織学的所見に異常は認められなかった しかしながら 病理組織学的な異常を伴わずに受胎能に影響を及ぼす可能性を完全には否定できないことから 交配前 4 週間及び交配中に間歇投与した雄ラットを用いた受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験を実施した その結果 0.5 ml/kg まで生殖機能並びに初期胚発生に及ぼす影響は認められず 雄の生殖機能及び初期胚発生に関する無毒性量は 0.5 ml/kg と判断した また ラット 4 週間間歇皮下投与毒性試験では 雄の前立腺及び精嚢の器官重量低下を除き 雌雄の生殖器官に対する肉眼所見 器官重量及び病理組織学的検査において被験物質投与に起因した影響が認められなかったことと合わせ 0.5 ml/kg までは雌雄ラットの生殖機能に対する影響はないものと推測された 局所刺激性試験ウサギを用いた局所刺激性試験では 皮下又は筋肉内に A-04-01D の 0.5 ml/ 部位を単回及び 2 回反復投与した結果 局所刺激性は DPT ワクチンとほぼ同等で 筋肉内投与では A-04-01D の炎症性反応は DPT ワクチンより速く回復することが示唆された いずれの投与経路で反復投与 (14 日間隔で 2 回 ) しても A-04-01D の刺激性は増強されなかった 筋肉内投与では 投与後 7 日までの炎症性細胞反応は皮下投与に比べやや強い傾向があるものの 炎症性反応の回復は筋肉内投与の方が速かった その他の毒性試験該当試験なし

7 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験の概要文 Page 単回投与毒性試験 A-04-01D の単回投与毒性試験を SD 系ラット及びビーグル犬を用いて皮下投与により実施した ラット単回皮下投与毒性試験 参照 1 群雌雄各 5 匹の SD 系ラットに 成人の体重あたりの予定臨床用量 (HA 含量として 15 μg/0.5 ml/ ヒト ) の約 200 倍及び 1000 倍に相当する 2 及び 10 ml/kg(ha 含量として 60 及び 300 μg /kg) の A-04-01D を単回皮下投与し 14 日間観察した 対照群には生理食塩液 10 ml/kg を同様に投与した いずれの投与群にも死亡例はなく 一般状態に異常は認められなかった 10 ml/kg 投与群の雄では体重の増加抑制が投与翌日にみられ 観察期間中 雄の体重は対照群に比べ低値であった 雌では投与翌日に体重が減少したが 以後 対照群と差はみられなかった 剖検では 10 ml/kg 投与群の全例で投与部位に淡褐色の結節が認められ 雌 2 例で結節内に嚢胞が認められた 病理組織学的検査の結果 結節は肉芽腫であり 被験物質と推定される無定形物質の貯留 マクロファージ 形質細胞浸潤及び出血が認められた 以上の結果より A-04-01D の概略の致死量は 10 ml/kg を上回った イヌ単回皮下投与毒性試験 参照 1 群雄 2 匹のビーグル犬に 成人の体重あたりの予定臨床用量 (HA 含量として 15 μg/0.5 ml/ ヒト ) の約 100 倍及び 500 倍に相当する 1 及び 5 ml/kg(ha 含量として 30 及び 150 μg/kg) の A-04-01D を単回皮下投与し 14 日間観察した 対照群には生理食塩液 5 ml/kg を同様に投与した いずれの投与群にも死亡例はなく 体重 摂餌量及び尿検査に異常は認められなかった 一般状態では触診で 5 ml/kg 投与群の 1 例に投与部位の皮下結節がみられた 剖検では 1 及び 5 ml/kg 投与群の全例で投与部位に赤褐色の結節が認められた 病理組織学的検査の結果 結節は肉芽腫であり 肉芽腫の中心には被験物質と推定される無定形物質の貯留がみられ 肉芽腫周囲にはマクロファージ 形質細胞浸潤又はリンパ球浸潤が認められた 血液学的検査及び血液生化学的検査では 5 ml/kg 投与群で好中球数及び白血球数の増加傾向 LDH 及び γ-グロブリンの上昇傾向が認められた 以上の結果より A-04-01D の概略の致死量は 5 ml/kg を上回った 反復投与毒性試験 A-04-01D の反復投与毒性試験を SD 系ラットを用いて皮下投与により実施した ラット 4 週間間歇皮下投与毒性試験 参照 1 群雌雄各 10 匹の SD 系ラットに A-04-01D を成人の体重あたりの予定臨床用量 (HA 含量として 15 μg/0.5 ml/ ヒト ) の約 25 倍及び 50 倍に相当する 0.25 及び 0.5 ml/kg(ha 含量として 7.5 及び 15 μg/kg) を 1 週間間隔で計 5 回皮下投与した また 生理食塩液 0.5 ml/kg を投与する対照

8 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験の概要文 Page 8 群を設定した 動物を毎日観察し 体重及び摂餌量を週 1 回測定した 投与 4 週に眼科学的検査及び尿検査を 試験終了時に血液学的検査 血液生化学的検査 剖検 器官重量及び病理組織学的検査を実施した いずれの投与群にも死亡はなく 一般状態 体重 摂餌量 尿検査及び眼科学的検査において 被験物質投与に起因する異常は認められなかった なお 血液学的検査では 0.5 ml/kg 投与群の雌雄に白血球分画の好酸球の割合に有意な増加が認められたが 好酸球数には有意差はなかったことから 被験物質投与による影響ではないと考えられた また 血液生化学的検査では 0.25 及び 0.5 ml/kg 投与群の雌の ALT(GPT) に有意な低値が認められたが 投与量に依存した変動ではなかったことから 被験物質に起因したものではないと考えられた 投与部位に白色結節が 0.25 及び 0.5 ml/kg 投与群の雌雄に認められ その発現例数は用量に依存してみられた 病理組織学的検査では 投与部位に軽度の肉芽腫及び軽度から中等度のびまん性炎症性細胞浸潤が用量依存的に認められた 投与部位における局所変化は A-04-01D がアジュバントとして水酸化アルミニウムを添加したワクチン製剤であることによる炎症反応と考えられた なお 0.5 ml/kg 投与群の前立腺及び精嚢の重量に対照群と比較して有意な低値と用量依存性が認められたが 試験施設における背景データとの比較では有意差はなく 病理組織学的検査で重量低下を示す所見は認められなかった しかしながら 病理組織学的な異常を伴わずに受胎能に影響を及ぼす可能性を完全には否定できないことから 雄ラット受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験を実施したところ 雄性生殖器官重量 交尾率 受胎率及び初期胚発生への影響はみられなかったことから ( 雄ラット受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験参照 ) A-04-01D 投与には関連のない偶発性の変動と考えられた 以上の結果から A-04-01D の 0.25 及び 0.5 ml/kg を 4 週間間歇皮下投与した時 投与部位に局所性の炎症反応が認められたものの 全身的な毒性徴候は認められなかった したがって 雌雄ともに無毒性量 (NOAEL) は 成人の体重あたりの予定臨床用量の約 50 倍に相当する 0.5 ml/kg と判断した 遺伝毒性試験本剤の有効成分は不活化全粒子インフルエンザウイルスであり ウイルスの培養に発育鶏卵を用いている DNA に直接影響を与える可能性は極めて低いと考えられるため 遺伝毒性試験は実施しなかった がん原性試験ラット 4 週間間歇皮下投与毒性試験において がん原性が懸念される所見はなく 本剤の添加物として がん原性の確認が必要な物質は含まれていない 本剤の予定される用法はおよそ 3 週間間隔で 2 回投与されるのみであり 投与回数が限定されることから がん原性試験は実施しなかった

9 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験の概要文 Page 生殖発生毒性試験 A-04-01D の生殖発生毒性試験に関して ラット胚 胎児発生に関する試験及びラット出生前及び出生後の発生並びに母動物の機能に関する試験を実施した また A-04-01D の雌雄ラットを用いた 4 週間間歇皮下投与毒性試験の結果 病理組織学的所見に異常は認められなかったものの 0.5 ml/kg 群の雄の前立腺及び精嚢に器官重量で陰性対照群と比較して有意な低値と用量依存性が認められた ( ラット 4 週間間歇皮下投与毒性試験参照 ) 試験施設における器官重量の背景データとの比較では有意差はないものの 病理組織学的な異常を伴わずに受胎能に影響を及ぼす可能性を完全には否定できないことから 雄ラット受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験を実施した なお 4 週間間歇皮下投与毒性試験において 雄の前立腺及び精嚢の器官重量低下を除き 雌雄の生殖器の肉眼的所見 器官重量及び病理組織学的検査に毒性変化は認められなかった ラット胚 胎児発生に関する試験 参照 1 群 18~20 匹の SD 系妊娠ラットを用い A-04-01D を成人の体重あたりの予定臨床用量 (HA 含量として 15 μg/0.5 ml/ ヒト ) の約 25 倍及び 50 倍に相当する 0.25 及び 0.5 ml/kg(ha 含量として 7.5 及び 15 μg/kg) を妊娠 7 日 12 日及び 17 日の計 3 回皮下投与した また 生理食塩液 0.5 ml/kg を投与する対照群を設定した 母動物を妊娠 20 日に剖検し 母動物及び胎児に対する影響について評価した 母動物では 死亡はなく 一般状態 体重 摂餌量 剖検 黄体数及び着床数に被験物質投与に起因した影響は認められなかった 胎児では 生存胎児数 着床後死亡率 体重及び性別 胎盤重量に被験物質投与の影響は認められなかった また 胎児の形態学的検査において 外表異常及び骨格異常はいずれの投与群にも認められず 内臓異常及び骨格変異 骨化進行度にいずれの投与群にも被験物質の影響は認められなかった 以上の結果から A-04-01D をラット胎児の着床から硬口蓋閉鎖の期間に間歇投与した時 母動物及び胚 胎児発生に及ぼす影響は認められなかった したがって 母動物の一般毒性及び生殖機能並びに胚 胎児発生に関する無毒性量は いずれも成人の体重あたりの予定臨床用量の約 50 倍に相当する 0.5 ml/kg と判断した ラット出生前及び出生後の発生並びに母動物の機能に関する試験 参照 1 群 19~22 匹の SD 系妊娠ラットを用い A-04-01D を成人の体重あたりの予定臨床用量 (HA 含量として 15 μg/0.5 ml/ ヒト ) の約 25 倍及び 50 倍に相当する 0.25 及び 0.5 ml/kg(ha 含量として 7.5 及び 15 μg/kg) を妊娠期間中は妊娠 7 日 12 日及び 17 日 授乳期間中は分娩後 0 日 7 日 14 日及び 21 日の計 7 回皮下投与した また 生理食塩液 0.5 ml/kg を投与する対照群を設定した すべての母動物を分娩させて離乳時まで哺育させ 分娩後 22 日に剖検した F 1 出生児の一部は離乳時 10~11 週齢時にそれぞれ剖検し 残りの動物は生殖機能観察終了後に剖検した 本試験は F 0 母動物の妊娠及び授乳期に対する影響 受胎産物並びに出生児の発生 成長 発達 行動及び

10 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験の概要文 Page 10 生殖機能に対する影響について評価した 母動物 (F 0 ) では 死亡はなく 一般状態 摂餌量 剖検 分娩 哺育能には被験物質投与の影響は認められなかった なお 0.5 ml/kg 投与群の妊娠 11~20 日の体重増加量に対照群と比較して有意な低値が認められたが 体重には統計学的有意差はなく 試験施設の背景データの範囲内であった また 胚 胎児発生に関する試験 ( 項 ) において 妊娠期間中の母動物には体重増加量に影響が認められなかった これらのことから 高用量群でみられた体重増加量の変動は被験物質投与による影響ではなく 偶発的変動と考えられた 出生児 (F 1 ) では 出生時の状態 一般状態 剖検 4 日生存率 離乳率 身体発達 ( 授乳期間中の発育分化 生殖器の発育分化 ) 初期行動 感覚機能 オープンフィールド 条件回避学習能 交尾能 受胎能 胚 (F 2 ) の着床及び生存に被験物質投与の影響は認められなかった なお 0.5 ml/kg 投与群の離乳後の 28 日齢以降 平均体重が対照群と比べ有意な低値が認められたが 試験施設の同系統の背景データの範囲内にあり 毒性学的に意義のない変動と考えられた 以上の結果から A-04-01D をラット胎児の着床から離乳までの期間に間歇投与した時 母動物並びに出生児の発生 成長 発達 行動及び機能に及ぼす影響は認められなかった したがって 母動物の一般毒性及び生殖機能並びに出生児に対する無毒性量は いずれも成人の体重あたりの予定臨床用量の約 50 倍に相当する 0.5 ml/kg と判断した 雄ラット受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験 参照 1 群 20 匹の雄性 SD 系ラットを用い A-04-01D を成人の体重あたりの予定臨床用量 (HA 含量として 15 μg/0.5 ml/ ヒト ) の約 25 倍及び 50 倍に相当する 0.25 及び 0.5 ml/kg の A-04-01D を交配前 4 週間及び交配を経て剖検までの間 1 週間に 1 回 ( 計 8 回 ) 皮下投与し 同系統の無処置雌動物と交配して交尾 受胎に及ぼす影響について評価した 対照群の雄には生理食塩液 0.5 ml/kg を投与した 交配は開始 7 日間以内に全例の交尾が成立した 交尾後 雌は妊娠 13 日に剖検し 初期胚発生への影響について評価した 雄は雌の剖検終了後に剖検した 雄では 死亡はなく 一般状態 体重 摂餌量 雄性生殖器官重量 交尾率 受胎率及び交尾成立までの日数に被験物質投与の影響は認められなかった 雄性生殖器官重量は 精巣 精巣上体 前立腺及び精嚢の実重量及び体重比重量において 低及び高用量群のいずれも対照群との間に統計学的有意差は認められなかった なお 対照群及び低用量群の各 1 例に片側 ( 左 ) 精巣の小型が観察され いずれも同側の精巣上体の重量低下を伴うものであったが その他に異常は認められなかった 片側精巣小型は対照群及び低用量群に認められ 高用量群に認められなかったことから 被験物質投与と関連のない偶発性の変化と判断した また 片側精巣小型を示した上記 2 例の雄においても交尾能及び受胎能が確認された 初期胚発生では 黄体数 着床数 着床前死亡率 着床後死亡率及び生存胚数に被験物質投与の影響は認められなかった 以上の結果から A-04-01D を雄に交配前 4 週間及び交配中に間歇投与した時 雄の一般毒性学的影響 生殖機能及び初期胚発生に関する無毒性量は いずれも成人の体重あたりの予定臨床用量の約 50 倍に相当する 0.5 ml/kg と判断した

11 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験の概要文 Page 局所刺激性試験 A-04-01D の局所刺激性試験は ウサギを用いて皮下又は筋肉内に単回及び 2 回反復投与 (14 日間隔 ) することにより実施した ウサギ単回皮下投与刺激性試験 参照 A-04-01D を 6 匹の日本白色種ウサギの片側の腹部皮下に単回投与し 反対側の腹部皮下には生理食塩液を投与した 比較対照として DPT ワクチンを片側の腹部皮下に投与する群を設けた 投与量は A-04-01D の成人における臨床予定用量の 0.5 ml/ 部位 (HA 含量として 15 μg) とした 投与から剖検日まで一般状態観察及び体重測定を実施し 投与後 2 日及び 7 日に各群 3 匹ずつ剖検して 投与部位皮下について肉眼的観察及び病理組織学的検査を行った 一般状態及び体重に変化はみられなかった 肉眼的観察では A-04-01D 投与群の投与後 2 日の皮下組織に淡赤色斑が認められ 投与後 7 日に 1 匹で白色斑がみられた DPT ワクチン投与群では投与後 2 日に暗赤色斑がみられたが 投与後 7 日に変化はみられなかった 生理食塩液投与群では変化は認められなかった 病理組織学的検査では投与後 2 日の検査で A-04-01D 投与群及び DPT ワクチン投与群ともに 投与物質の貯留物と思われる無定形物質が認められ 単核細胞浸潤が同程度に観察された A-04-01D 投与群では更に 軽度の貧食マクロファージ及び偽好酸球の浸潤が認められた 投与後 7 日の検査では両投与群ともに無定形物質 単核細胞浸潤 貧食マクロファージ及び偽好酸球の浸潤並びに線維化が認められ 発現頻度及び程度に明らかな差はみられなかった 生理食塩液投与群では変化は認められなかった A-04-01D 投与群で投与後 2 日の炎症性細胞の反応が DPT ワクチン投与群と比較してやや強くみられたが 投与後 7 日の変化は両投与群で差がみられなかったことから A-04-01D と DPT ワクチンの刺激性に差はないと判断した また 炎症性反応は無定形物質に対する炎症性細胞浸潤が主体で 周囲組織の変性等がみられなかったことから 刺激性は軽微なものと考えられた 以上の結果 A-04-01D は皮下組織に対し軽微な刺激性を有するが DPT ワクチンと同程度の刺激性であると判断した ウサギ 2 回反復皮下投与刺激性試験 参照 A-04-01D を 6 匹の日本白色種ウサギの片側の腹部皮下に 1 回目の投与を行い 初回投与後 14 日目に反対側の腹部皮下に 2 回目の投与を行った 比較対照として DPT ワクチンを同様に投与する群を設けた 投与量は A-04-01D の成人における臨床予定用量の 0.5 ml/ 部位 (HA 含量として 15 μg) とした 投与から剖検日まで 一般状態観察及び体重測定を実施し 2 回目投与後 2 日及び 7 日 (1 回目投与後 16 日及び 21 日 ) に各群 3 匹ずつ剖検して 投与部位について肉眼的観察及び病理組織学的検査を行った 一般状態及び体重に変化はみられなかった 1 回目投与部位の肉眼的観察では 投与後 16 日及び 21 日ともに A-04-01D 投与群及び DPT ワクチン投与群で皮下組織に白色斑あるいは淡褐色斑が認められた 病理組織学的検査では 皮下

12 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験の概要文 Page 12 組織に投与物質の貯留物と思われる無定形物質が観察され 単核細胞浸潤 貧食マクロファージ及び偽好酸球の浸潤並びに線維化が認められた これらの変化の程度において投与物質間の差は明確ではなかった 2 回目投与部位の肉眼的観察では 投与後 2 日及び 7 日ともに A-04-01D 投与群及び DPT ワクチン投与群で皮下組織に白色斑あるいは淡褐色斑が認められた 病理組織学的検査では 皮下組織に投与物質の貯留物と思われる無定形物質が観察され 主に単核細胞浸潤及び偽好酸球の浸潤が認められた 投与後 7 日では投与後 2 日に比べ貧食マクロファージがやや顕著であったが 線維化の程度は 1 回目投与部位に比べると軽度のままであった 2 回目投与部位の変化の程度において投与物質間の差は明確ではなかった なお 腹壁で A-04-01D 投与群及び DPT ワクチン投与群ともに肉眼的に赤色点がみられ 病理組織学的検査で皮膚側の結合組織に単核細胞浸潤及び偽好酸球の浸潤が認められた しかし 筋層には浸潤していないことから皮下組織の炎症の一部と考えられた 皮下による単回投与試験と 2 回反復投与試験を比較すると 両物質とも炎症性反応は単回投与後 2 日に比べ 2 回反復投与後 2 日で高度であったが 2 回反復投与後 7 日では単回投与後 7 日と同程度であった 以上の結果 A-04-01D の反復皮下投与試験では単回皮下投与試験と同様に皮下組織に対し軽微な刺激性を有するが DPT ワクチンと同程度の刺激性であると判断した ウサギ単回筋肉内投与刺激性試験 参照 A-04-01D を 6 匹の日本白色種ウサギの片側の後肢外側広筋に単回投与し 反対側の後肢外側広筋には生理食塩液を投与した 比較対照として DPT ワクチンを片側に投与する群を設けた また 陽性対照として片側に 0.75v/v% 酢酸 その反対側に 6v/v% 酢酸を投与する群を設けた 投与量は A-04-01D の成人における臨床予定用量の 0.5 ml/ 部位 (HA 含量として 15 μg) とした 投与から剖検まで 一般状態観察及び体重測定を実施し 投与後 2 日及び 7 日に各群 3 匹ずつ剖検して投与部位を含む筋肉組織について肉眼的観察及び病理組織学的検査を行った 肉眼所見は Shintani 1) らの分類に従って判定し 病理組織学的検査の結果から 注射剤の局所障害性に関する試験法 ( 案 ) の検討について ( 昭和 54 年 1 月 12 日薬安第 2 号 ) に基づく判定基準に従って局所障害性を総合的に評価した 一般状態及び体重に変化はみられなかった Shintani らの分類に従った肉眼的観察の結果は A-04-01D 投与群 DPT ワクチン投与群 生理食塩液投与群 0.75v/v% 酢酸投与群及び 6v/v% 酢酸投与群で投与後 2 日にはそれぞれ slight slight slight mild 及び moderate 投与後 7 日にはそれぞれ slight slight none mild 及び mild と分類された 病理組織学的検査では A-04-01D 投与群及び DPT ワクチン投与群ともに 投与物質の貯留物と思われる無定形物質が認められ 単核細胞浸潤 貧食マクロファージ及び偽好酸球浸潤がみられた 筋線維の変性 / 壊死は軽度から中等度にみられ 水腫あるいは石灰化もみられた これらの変化は投与後 2 日及び 7 日ともに生理食塩液投与群より強かった A-04-01D 投与群及び DPT

13 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験の概要文 Page 13 ワクチン投与群の投与後 7 日における炎症性の細胞反応は 0.75v/v% 酢酸投与群に比べて強かったが 炎症性の細胞反応は無定形物質に対する反応と考えられること 筋線維の変性 / 壊死 石灰化及び水腫は 0.75v/v% 酢酸投与群に比べ軽度であることから 0.75v/v% 酢酸より刺激性の程度は軽度であると考えられた したがって 筋肉組織に対する障害性の程度は 判定基準に従うと A-04-01D 及び DPT ワクチンともに生理食塩液より強く 0.75v/v% 酢酸より弱い グレード 2 と判断され A-04-01D は DPT ワクチンと同程度の刺激性であると判断した ウサギ 2 回反復筋肉内投与刺激性試験 参照 A-04-01D を 6 匹の日本白色種ウサギの片側の後肢外側広筋に 1 回目の投与を行い 初回投与後 14 日目に反対側の後肢外側広筋に 2 回目の投与を行った 比較対照として DPT ワクチンを同様に投与する群を設けた 投与量は A-04-01D の成人における臨床予定用量の 0.5 ml/ 部位 (HA 含量として 15 μg) とした 投与から剖検日まで 一般状態観察及び体重測定を実施し 2 回目投与後 2 日及び 7 日 (1 回目投与後 16 日及び 21 日 ) に各群 3 匹ずつ剖検して投与部位を含む筋肉組織について肉眼的観察及び病理組織学的検査を行った 肉眼所見は Shintani らの分類 1) に従って判定した 一般状態及び体重に変化はみられなかった 1 回目投与部位において Shintani らの分類に従った肉眼的観察の結果は A-04-01D 投与群及び DPT ワクチン投与群ともに投与後 16 日で slight 投与後 21 日で none に分類された 病理組織学的検査では 投与後 16 日に A-04-01D 投与群及び DPT ワクチン投与群ともに単核細胞浸潤 貧食マクロファージ 偽好酸球の浸潤 筋線維の変性 / 壊死が観察されたが 投与物質間で明らかな差はみられなかった 投与後 21 日では DPT ワクチン投与群では投与後 16 日の変化とほぼ同程度の変化が観察されたが A-04-01D 投与群では単核細胞浸潤及び偽好酸球浸潤の程度は投与後 16 日の変化と比べ非常に軽度であった 2 回目投与部位において Shintani らの分類に従った肉眼的観察の結果は A-04-01D 投与群及び DPT ワクチン投与群で投与後 2 日にそれぞれ slight 及び mild 投与後 7 日でともに slight に分類された 病理組織学的検査では投与後 2 日及び 7 日に A-04-01D 投与群及び DPT ワクチン投与群ともに単核細胞浸潤 貧食マクロファージ 偽好酸球の浸潤 筋線維の変性 / 壊死が観察されたが 投与物質間で明らかな差はみられず 1 回目投与後 16 日の変化ともほぼ同程度であった 2 回目投与部位では A-04-01D 投与群及び DPT ワクチン投与群ともに投与物質の貯留物と思われる無定形物質の貯留が高度に認められた 筋肉内による単回投与試験と 2 回反復投与試験との比較では 炎症性反応は単回投与後 2 日及び 7 日と比べ 2 回反復投与後 2 日及び 7 日で高度であったが 肉眼的観察では単回投与後 7 日 2 回反復投与後 7 日ともに slight に分類された 以上の結果 A-04-01D の反復筋肉内投与試験では単回筋肉内投与試験と同様に筋肉組織に対し軽微な刺激性を有するが DPT ワクチンと同程度の刺激性であると判断した また 1 回目投与後 21 日の A-04-01D 投与群における炎症性細胞浸潤は DPT ワクチン投与群に比べ軽度であったこ

14 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 とから 炎症性反応の回復が速いことが示唆された 毒性試験の概要文 Page その他の毒性試験該当試験なし 考察及び結論 A-04-01D の毒性試験として ラット及びイヌを用いた単回投与毒性試験 ラットを用いた反復投与毒性試験 ラットを用いた生殖発生毒性試験 ウサギを用いた局所刺激性試験を実施した 単回投与毒性試験における概略の致死量は ラットで 10 ml/kg( 成人の体重あたりの予定臨床用量の約 1000 倍に相当 ) イヌで 5 ml/kg( 成人の体重あたりの予定臨床用量の約 500 倍に相当 ) をそれぞれ上回った 投与部位の皮下では結節がみられ 病理組織学的検査では肉芽腫であった 肉芽腫の中心には無定形物質の貯留がみられたことから 大量投与により被験物質が残留したと考えられ 肉芽腫は被験物質に対する炎症反応と考えられた イヌでみられた好中球数及び白血球数の増加並びに LDH 及び γ-グロブリンの上昇は炎症反応に起因するものと考えられた ラットでは投与翌日に体重の一過性の減少あるいは増加抑制がみられたが 被験物質の大量投与によるものと推察された 反復投与毒性試験では ラット 4 週間間歇皮下投与試験を実施し 投与部位において 肉眼所見として白色結節 病理組織学的所見として軽度の肉芽腫及び軽度から中等度のびまん性炎症性細胞浸潤が認められた これは A-04-01D がアジュバントとして水酸化アルミニウムを用いたワクチン製剤であることに起因した局所炎症反応と考えられた 投与部位の変化を除き A-04-01D 投与に起因する毒性変化は認められず 無毒性量は雌雄ともに 0.5 ml/kg( 成人の体重あたりの予定臨床用量の約 50 倍に相当 ) と判断した 生殖発生毒性試験では ラット胚 胎児発生に関する試験及びラット出生前及び出生後の発生並びに母動物の機能に関する試験を実施し いずれの試験においても毒性学的変化は認められなかった したがって 母動物の一般毒性学的無毒性量及び生殖機能に対する無毒性量 F 1 の発生 成長 行動 機能に対する無毒性量は 0.5 ml/kg( 成人の体重あたりの予定臨床用量の約 50 倍に相当 ) と判断した また ラット 4 週間間歇皮下投与毒性試験において 0.5 ml/kg 群の雄の前立腺及び精嚢に器官重量で陰性対照群と比較して有意な低値と用量依存性が認められた 試験施設における器官重量の背景データとの比較では有意差はなく 病理組織学的所見に異常は認められなかった しかしながら 病理組織学的な異常を伴わずに受胎能に影響を及ぼす可能性を完全には否定できないことから 交配前 4 週間及び交配中に間歇投与した雄ラットを用いた受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験を実施した その結果 雄性生殖器官重量 交尾率 受胎率及び初期胚発生への影響がみられなかったことから A04-01D 投与には関連のない偶発性の変動と考えられた 4 週間間歇皮下投与毒性試験において 雄の前立腺及び精嚢の器官重量低下を除き 雌雄の生殖器の肉眼的所見 器官重量及び病理組織学的検査に毒性変化は認められなかった

15 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験の概要文 Page 15 ことと合わせ 雌雄ラットの生殖機能に対する毒性は 0.5 ml/kg までは発現しないと考えられた ウサギを用いた局所刺激性試験では A-04-01D は単回及び 2 回反復投与ともに皮下あるいは筋肉に対する刺激性は DPT ワクチンとほぼ同等で 筋肉内投与時の炎症性反応の回復は DPT ワクチンより速いことが示唆された A-04-01D の単回投与試験と 2 回反復投与試験を比較すると 皮下投与では炎症性反応は単回投与後 2 日に比べ 2 回反復投与後 2 日で高度であったが 2 回反復投与後 7 日では単回投与後 7 日と同程度であった 一方筋肉内投与では 炎症性反応は単回投与後 2 日及び 7 日と比べ 2 回反復投与後 2 日及び 7 日で高度であったが 肉眼的観察では単回投与後 7 日 2 回反復投与後 7 日ともに slight に分類された このため いずれの投与経路で反復投与しても A-04-01D の刺激性は増強されないものと考えられた A-04-01D の皮下と筋肉内に対する刺激性の比較では 投与後 2 日及び 7 日 ( 単回及び 2 回反復 ) における炎症性反応は皮下投与よりも筋肉内投与でやや強い傾向がみられたものの 投与後 21 日 (2 回反復 ) における炎症性細胞浸潤は筋肉内投与で軽度であった このことから 筋肉内投与では皮下投与に比べて投与後の貧食反応は短期間に生じるが 回復は速いと考えられた 以上より A-04-01D は DPT ワクチンとほぼ同等の局所刺激性を有するものの 毒性面において特段懸念される事象は観察されなかった 本剤を予定された用法 用量の範囲で臨床使用する限りでは 安全性上の特段の問題となる作用はなく 接種後の局所刺激性も許容されるものと考えられた 参考文献一覧 1)Shintani S, Yamazaki M, Nakamura M, Nakayama I. A new method to determine the irritation of drugs after intramuscular injection in rabbits. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1967; 11:

16 Page 1 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 1mL 第 2 部 ( モジュール 2):CTD の概要 ( サマリー ) 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 毒性試験概要表 デンカ生研株式会社

17 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page 2

18 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page 3 目 次 毒性試験概要表 毒性試験 : 一覧表 トキシコキネティクス : トキシコキネティクス試験の一覧表 トキシコキネティクス : トキシコキネティクス試験成績の一覧表 毒性試験 : 被験物質一覧 単回投与毒性試験 反復投与毒性試験 : 重要な試験以外の試験 反復投与毒性試験 : 重要な試験 In Vitro 遺伝毒性試験 In Vivo 遺伝毒性試験 がん原性試験 生殖発生毒性試験 : 重要な試験以外の試験 生殖発生毒性試験 : 受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験 生殖発生毒性試験 : 胚 胎児発生に関する試験 生殖発生毒性試験 : 出生前及び出生後の発生並びに母動物の機能に関する試験 新生児を用いた試験 局所刺激性試験 A 局所刺激性試験 ( ウサギ単回皮下 ) B 局所刺激性試験 ( ウサギ 2 回反復皮下 ) C 局所刺激性試験 ( ウサギ単回筋肉内 ) D 局所刺激性試験 ( ウサギ 2 回反復筋肉内 ) その他の毒性試験... 28

19 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page 4

20 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page 毒性試験概要表 毒性試験 : 一覧表 被験物質 :A-04-01D 試験の種類動物種 / 系統投与方法投与期間投与量 (ml/kg) a GLP 適用 実施施設 試験番号 記載箇所 ラット 10( 生理食塩液 ) 2 皮下単回 /Crl:CD(SD) 10 単回投与毒性試験 適 イヌ / ビーグル 皮下 単回 5( 生理食塩液 ) 1 5 適 反復投与毒性試験 ラット / 0.5( 生理食塩液 ) 0.25 皮下 4 週間適 Crl:CD(SD) ウサギ / 日本白皮下単回 0.5 ml/ 部位適色種 (Kbl:JW) 局所刺激性試験 ウサギ / 日本白皮下 2 回 0.5 ml/ 部位適色種 (Kbl:JW) ウサギ / 日本白筋肉内単回 0.5 ml/ 部位適色種 (Kbl:JW) ウサギ / 日本白筋肉内 2 回 0.5 ml/ 部位適色種 (Kbl:JW) ラット妊娠 7 日 12 日 17 日の 3 0.5( 生理食塩液 ) 0.25 皮下 /Crl:CD(SD) 回 0.5 適 妊娠 7 日 12 日 17 日 ラット 0.5( 生理食塩液 ) 0.25 皮下分娩後 0 日 7 日 14 日 生殖発生毒性試験 /Crl:CD(SD) 日の 7 回 適 雄性のみ 交配前 4 週間及ラット 0.5( 生理食塩液 ) 0.25 皮下び交配を経て剖検までの間 /Crl:CD(SD) 週間に 1 回 計 8 回 適 a: 特に記載のない場合 反復投与毒性試験の下線を施した投与量は 無毒性量を示す

21 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page トキシコキネティクス : トキシコキネティクス試験の一覧表 該当試験なし トキシコキネティクス : トキシコキネティクス試験成績の一覧表 該当試験なし

22 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page 毒性試験 : 被験物質一覧 ロット番号 a) 力価 (μgha/ml) 申請規格 (HA 含量 ( 相当値 ) として ) 表示値の % d) 卵アルブミン b) (ng/ml) 申請規格 ( 最終バルクとして ) 以下 < e) ( 最終バルク換算 < ) < e) ( 最終バルク換算 < ) 規格設定された不純物エンドトキシン b) (EU/mL) 申請規格 ( 最終バルクとして ) 以下 e) ( 最終バルク換算 ) e) ( 最終バルク換算 ) a) HA 含量試験 b) 原液の規格 c) 製剤の規格 d) 30μgHA 製剤の場合 : ~ μgha/ml e) 原液 ( バッチ番号 : ) における測定 f) 測定なし ただし最終バルクはと共通 g) 原液 ( バッチ番号 : ) における測定 ホルムアルデヒド c) (w/v%) 申請規格 以下 - f) 試験番号 ラット単回投与毒性試験 ラット 4 週間間歇投与毒性試験 試験の種類 ウサギ単回筋肉内投与刺激性試験 ウサギ 2 回反復筋肉内投与刺激性試験 ウサギ単回皮下投与刺激性試験 ウサギ 2 回反復皮下投与刺激性試験 イヌ単回投与毒性試験 158 ラット胚 胎児発生に関する試験 被験物質 :A-04-01D 157 ラット出生前及び出生後の発生並びに母動物の機能に関する試験 < g) g) 426 雄ラット受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験

23 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page 単回投与毒性試験 動物種 / 系統 ラット / Crl:CD(SD) イヌ / ビーグル 投与方法 ( 溶媒 / 投与形態 ) 皮下 (- / 懸濁液 ) 皮下 (- / 懸濁液 ) 投与量 (ml/kg) 性別及び動物数 / 群 2 10 a) 雄 :5 雌 :5 1 5 b) [ ] 内は CTD における記載箇所 a) 対照群には生理食塩液を高用量群と同じ 10 ml/kg で皮下に投与した b) 対照群には生理食塩液を高用量群と同じ 5 ml/kg で皮下に投与した 最大非致死量 (ml/kg) 概略の致死量 (ml/kg) 10 >10 雄 :2 5 >5 特記すべき所見 10 ml/kg: 体重 : 雄では観察期間中 対照群に比べ低値 雌では投与翌日にわずかに減少 以後 対照群と差はなし 剖検 : 投与部位に淡褐色の結節形成及び結節内に嚢胞 病理組織学的検査 : 肉芽腫 ( 無定形物質 マクロファージ及び形質細胞の浸潤 出血 ) 一般状態に変化はみられなかった 1 ml/kg: 剖検 : 投与部位に赤褐色の結節 病理組織学的検査 : 肉芽腫 ( 無定形物質 マクロファージ 形質細胞及びリンパ球の浸潤 ) 5 ml/kg: 一般状態 : 投与部位に皮下結節 血液学的検査 : 好中球数及び白血球数の増加傾向 血液生化学的検査 :LDH 及びγ-グロブリンの上昇傾向 体重 摂餌量及び尿検査に変化はみられなかった 被験物質 :A-04-01D 試験番号 [ ] [ ]

24 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page 反復投与毒性試験 : 重要な試験以外の試験 該当試験なし

25 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page 反復投与毒性試験 : 重要な試験 報告書の題名 : 沈降新型インフルエンザワクチンのラットを用いた 4 週間間歇皮下投与毒性試験 被験物質 :A-04-01D 動物種 / 系統 : ラット /Crl:CD(SD) 投与期間 :4 週間 (1 週間間隔で計 5 回投与 ) 試験番号 : 試験開始週齢 :6 週齢 休薬期間 : なし CTD における記載箇所 : 初回投与年月日 :20 年月日 投与方法 : 皮下投与溶媒 / 投与形態 :- / 懸濁液 GLP 適用 : 適 特記事項 : なし無毒性量 :0.5 ml/kg 投与物質 生理食塩液 ( 対照 ) A-04-01D 投与量 (ml/kg) 動物数 雄 :10 雌 :10 雄 :10 雌 :10 雄 :10 雌 :10 特記すべき所見死亡及び瀕死屠殺動物 体重 (% a) ) 344 g 226 g 摂餌量 (% a) ) 26.1 g/ 日 17.7 g/ 日 一般状態 眼科学的検査 血液学的検査白血球分画 ; 好酸球 (%) ** 2.3 ## 血液生化学的検査 ALT(IU/L) ** * 尿検査 器官重量 精嚢 (% b) ) 実重量 1266 mg / -9 / -17** / 体重比重量 402 mg% / -11 / -16* / 前立腺 (% b) ) 実重量 775 mg / -6 / -15* / 体重比重量 245 mg% / -8 / -14* / -: 特記すべき所見なし /: 該当せず *:p<0.05 **:p<0.01(dunnett s test) ## :p<0.01(steel s test) a) 投与期間終了時 対照群は平均値を示す 投薬群は対照群との差を % で示す 統計学的有意差は実測値に基づく ( 差の % ではない ) b) 対照群は平均値を示す 投薬群は対照群との差を % で示す 統計学的有意差は実測値に基づく ( 差の % ではない ) ( 続く )

26 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page 反復投与毒性試験 : 重要な試験 ( 続き ) 試験番号 : 被験物質 :A-04-01D 投与物質 生理食塩液 ( 対照 ) A-04-01D 投与量 (ml/kg) 動物数 雄 :10 雌 :10 雄 :10 雌 :10 雄 :10 雌 :10 特記すべき所見 ( 続き ) 剖検投与部位 : 白色結節 ( 発現例数 ) 病理組織学的検査 ( 発現例数 ) 投与部位 : 肉芽腫 - a) 炎症性細胞浸潤 ( びまん性 ) a) 病理組織学的変化のグレード -: 変化なし +: 軽度 ++: 中等度

27 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page In Vitro 遺伝毒性試験 該当試験なし In Vivo 遺伝毒性試験 該当試験なし がん原性試験 該当試験なし 生殖発生毒性試験 : 重要な試験以外の試験 該当試験なし

28 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page 生殖発生毒性試験 : 受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験 報告書の題名 : 沈降インフルエンザワクチン (H5N1 株 ) の雄ラットにおける受胎能及び着床までの初期胚発生に関する皮下投与試験 被験物質 :A-04-01D 試験計画 :ICH4.1.1 準拠 投与期間 : 交配前 4 週間及び交配を経て剖検までの間 試験番号 : 426 (1 週間に 1 回 計 8 回間歇投与 ) 動物種 / 系統 : ラット /Crl:CD(SD) 交尾成立日 : 妊娠 0 日 CTD における記載箇所 : 試験開始週齢 :9 週齢 ( 雄 ) 帝王切開日 : 妊娠 13 日 初回投与年月日 :20 年月日 投与方法 : 皮下投与 GLP 適用 : 適 溶媒 / 投与形態 :- / 懸濁液 特記事項 : なし無毒性量 : 雄動物 :0.5 ml/kg 初期胚発生 :0.5 ml/kg 投与物質 生理食塩液 ( 対照 ) A-04-01D 投与量 (ml/kg) F 0 雄動物 : 評価動物数 死亡及び瀕死屠殺動物数 一般状態 剖検 左精巣小 1 例 左精巣小 1 例 - 体重 (% a) ) 510 g 1 1 摂餌量 (% b) ) 28.9 g/ 動物 / 日 0 4 平均交配所要日数 交尾動物数 授胎動物数 : 特記すべき所見なし a) 投与期間終了時 対照群は平均値を示す 投薬群は対照群との差を % で示す 統計学的有意差は実測値に基づく ( 差の % ではない ) b) 交配開始時 対照群は平均値を示す 投薬群は対照群との差を % で示す 統計学的有意差は実測値に基づく ( 差の % ではない ) ( 続く )

29 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page 生殖発生毒性試験 : 受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験 ( 続き ) 試験番号 : 426 被験物質 :A-04-01D 投与物質 生理食塩液 ( 対照 ) A-04-01D 投与量 (ml/kg) F 0 母動物 : 評価動物数 死亡及び瀕死屠殺動物数 一般状態 剖検 交配前体重 (% a) ) 264 g 0-1 妊娠時体重 (% ab ) 334 g 1-1 平均交配所要日数 膣栓あるいは精子が確認された雌動物数 妊娠動物数 流産あるいは全胚吸収母体数 平均黄体数 平均着床数 平均着床前死亡率 (%) 平均生存胚数 平均吸収胚数 死亡胚数 平均着床後死亡率 (%) : 特記すべき所見なし a) 交配開始時 対照群は平均値を示す 投薬群は対照群との差を % で示す b) 帝王切開時 対照群は平均値を示す 投薬群は対照群との差を % で示す

30 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page 生殖発生毒性試験 : 胚 胎児発生に関する試験 報告書の題名 : 沈降新型インフルエンザワクチンのラットにおける胚 胎児発生に関する皮下投与試験 被験物質 :A-04-01D 試験計画 :ICH4.1.3 準拠 投与期間 : 妊娠 7~17 日 ( 妊娠 7 日 12 日 17 日に間歇投与 ) 試験番号 : 158 動物種 / 系統 : ラット /Crl:CD(SD) 交尾成立日 : 妊娠 0 日 CTD における記載箇所 : 試験開始週齢 :10~11 週齢 帝王切開日 : 妊娠 20 日 初回投与年月日 :20 年月日 投与方法 : 皮下投与 GLP 適用 : 適 溶媒 / 投与形態 :- / 懸濁液 特記事項 : なし無毒性量 : F 0 母動物 :0.5 ml/kg F 1 胎児 :0.5 ml/kg 投与物質 生理食塩液 ( 対照 ) A-04-01D 投与量 (ml/kg) F 0 母動物 : 母動物数 死亡及び瀕死屠殺動物数 流産あるいは全胚吸収母動物数 一般状態 剖検 体重 (% a) ) 364 g -2-1 摂餌量 (% a) ) 29.7 g/ 動物 / 日 -2 1 平均黄体数 平均着床数 平均着床前死亡率 (%) : 特記すべき所見なし a) 投与期間終了時 対照群は平均値を示す 投薬群は対照群との差を % で示す 統計学的有意差は実測値に基づく ( 差の % ではない ) ( 続く )

31 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page 生殖発生毒性試験 : 胚 胎児発生に関する試験 ( 続き ) 試験番号 : 158 被験物質 :A-04-01D 投与物質 生理食塩液 ( 対照 ) A-04-01D 投与量 (ml/kg) F 1 胎児 : 評価母動物数 平均生存胎児数 平均吸収胚 (%) 平均死亡胎児 (%) 平均着床後死亡率 (%) 平均胎児体重 (g) 雄 雌 平均胎盤重量 (g) 雄 雌 性比 ( 平均雄比 ) 外表異常 ( 発現例数 ) 内臓異常 ( 平均発現率 %) * 0.8** 骨格異常 ( 発現例数 ) 骨格変異 ( 平均発現率 %) 骨化進行度 : 特記すべき所見なし *:p<0.05 **:p<0.01 (Dunnett s non-paramtric multiple, t-test) a) 左臍動脈残存及び胸腺頸部残留.

32 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page 生殖発生毒性試験 : 出生前及び出生後の発生並びに母動物の機能に関する試験 報告書の題名 : 沈降新型インフルエンザワクチンのラットにおける出生前及び出生後の発生並びに 被験物質 :A-04-01D 母動物の機能に関する皮下投与試験 試験計画 :ICH4.1.2 準拠 投与期間 : 妊娠 7 日 ~ 授乳 21 日 ( 妊娠 7 日 12 日 17 試験番号 : 157 動物種 / 系統 : ラット / Crl:CD(SD) 試験開始週齢 :10~11 週齢 日 分娩後 0 日 7 日 14 日 21 日に間歇投与 ) 交尾成立日 : 妊娠 0 日 CTD における記載箇所 : 初回投与年月 :20 年月日 投与方法 : 皮下投与溶媒 / 投与形態 :- / 懸濁液 GLP 適用 : 適 特記事項 : なし 同腹児数の調整 / 非調整 :4 匹 / 性 / 腹 無毒性量 : F 0 母動物 :0.5 ml/kg F 1 出生児 :0.5 ml/kg 投与物質 生理食塩液 ( 対照 ) A-04-01D 投与量 (ml/kg) F 0 母動物 : 妊娠動物数 死亡及び瀕死屠殺動物数 全哺育児死亡母動物数 一般状態 剖検 妊娠時体重 (% a) ) 妊娠 20 日 404 g -2(396 g) -2(396 g) 授乳時体重 (% a) ) 分娩後 21 日 325 g -2(319 g) -1(321 g) 妊娠時体重増加量 (% a) ) 妊娠 0-11 日 71 g -7 (-5 g) -11* (-8 g) 妊娠 0-20 日 169 g -5 (-9 g) -8* (-13 g) 授乳時体重増加量 (% a) ) 分娩後 0-21 日 34 g +18 (6 g) +12 (4 g) 妊娠時摂餌量 (% a) ) 妊娠 12 日 29.7 g/ 日 -5-8* 妊娠 20 日 25.6 g/ 日 +2 0 授乳時摂餌量 (% a) ) 分娩後 14 日 63.2 g/ 日 : 特記すべき所見なし *:p<0.05(dunnett s test) 試験施設背景データ (19 ~20 年試験の対照群 ): 妊娠 20 日体重データ ;392~434g a) 対照群は平均値を示す 投薬群は対照群との差を % で示す 統計学的有意差は実測値に基づく ( 差の % ではない ) ( 続く )

33 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page 生殖発生毒性試験 : 出生前及び出生後の発生並びに母動物の機能に関する試験 ( 続き ) 試験番号 : 157 被験物質 :A-04-01D 投与物質 生理食塩液 ( 対照 ) A-04-01D 投与量 (ml/kg) F 0 母動物 ( 続き ): 平均妊娠日数 異常分娩 平均着床痕数 F 1 出生児 : 離乳前評価母動物数 平均産児数 平均出生児数 総死亡児数 平均出生率 (%) 平均 4 日生存率 (%) 平均離乳率 (%) 出生時体重 (g) 雄 / 雌 6.77 / / / 6.12 生後 4 日体重 (g) 雄 / 雌 / / / 9.63 生後 21 日体重 (g) 雄 / 雌 59.1 / / / 54.6 性比 ( 平均雄 %) 一般状態 a) 身体発達 b) 初期行動観察 剖検 : 特記すべき所見なし a) 耳介開展 毛生 切歯萌出及び眼瞼開裂 b) 背面立ち直り反射 負の走地性及び空中立ち直り反応 ( 続く )

34 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page 生殖発生毒性試験 : 出生前及び出生後の発生並びに母動物の機能に関する試験 ( 続き ) 試験番号 : 157 被験物質 :A-04-01D 投与物質 生理食塩液 ( 対照 ) A-04-01D 投与量 (ml/kg) F 1 雄 : 離乳後評価動物数行動検査用 / 生殖機能検査用 21 / / / 19 死亡及び瀕死屠殺動物数 一般状態 剖検 体重 28 日齢 (g) * 70 日齢 (g) a) 感覚機能 オープンフィールド 条件回避学習能 生殖器の発育分化 ( 包皮分離 ) 交尾成立率 (%) 授胎率 (%) F 1 雌 : 離乳後評価動物数行動検査用 / 生殖機能検査用 21 / / / 19 死亡及び瀕死屠殺動物数 一般状態 剖検 体重 28 日齢 (g) ** 70 日齢 (g) * a) 感覚機能 オープンフィールド : 特記すべき所見なし *:p<0.05 **:p<0.01(dunnett s test) 試験施設背景データ (19 ~20 年試験の対照群 ):28 日齢時体重 ( 雄 ;93~104 g 雌 ;84~96 g) 70 日齢時体重 ( 雄 ;408~449 g 雌 ;242~276 g) a) 視覚性起き直し反応 耳介反射 瞳孔反射 疼痛反応 ( 続く )

35 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page 生殖発生毒性試験 : 出生前及び出生後の発生並びに母動物の機能に関する試験 ( 続き ) 試験番号 : 157 被験物質 :A-04-01D 投与物質 生理食塩液 ( 対照 ) A-04-01D 投与量 (ml/kg) F 1 雌 : 離乳後 ( 続き ) 条件回避学習能 生殖器の発育分化 ( 膣開口 ) 交尾率 (%) 受胎率 (%) 妊娠動物数 平均黄体数 平均着床数 平均着床前死亡率 (%) F 2 胎児 : 平均生存胎児数 平均着床後死亡率 (%) : 特記すべき所見なし

36 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page 新生児を用いた試験 該当試験なし 局所刺激性試験 ( 次頁より記載 )

37 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page A 局所刺激性試験 ( ウサギ単回皮下 ) 報告書の題名 : 沈降新型インフルエンザワクチンのウサギを用いた単回皮下投与刺激性試験 被験物質 :A-04-01D 動物種 / 系統 : ウサギ / 日本白色種 (Kbl:JW) 投与回数 : 単回 試験番号 : 投与時週齢 :12 週齢 CTD における記載箇所 : 投与年月日 :20 年月日 投与方法 : 皮下投与 ( 腹部皮下 ) 溶媒 / 投与形態 :- / 懸濁液 GLP 適用 : 適 特記事項 : 剖検は投与後 2 日及び 7 日に実施した 剖検日 投与後 2 日 投与後 7 日 投与物質 生理食塩液 A-04-01D DPT ワクチン 生理食塩液 A-04-01D DPT ワクチン 投与量 (ml/ 部位 ) 動物数 雄 :3 a) 雄 :3 雄 :3 a) 雄 :3 特記すべき所見死亡及び屠殺動物数 一般状態 体重 剖検所見 ( 発現例数 ) 皮下組織 暗赤色斑 淡赤色斑 白色斑 病理組織学的検査 ( 個体のスコア b) ) 皮下組織 無定形物質の貯留 単核細胞浸潤 貧食マクロファージ 偽好酸球浸潤 線維化 出血 : 特記すべき所見なし DPT ワクチン : 沈降精製百日せきジフテリア破傷風混合ワクチン a) ウサギの左側腹部皮下に A-04-01D を投与 右側腹部皮下に生理食塩液を投与した b) 0: 変化が認められない 1( 軽度 ): 変化がわずかに観察される程度 もしくは観察組織の 1/4 以下程度に観察される 2( 中等度 ): 変化がやや目立つ程度 もしくは観 察組織の 1/2 以下程度に観察される 3( 高度 ): 変化がかなり目立つ程度 もしくは観察組織の 1/2 以上に観察される 4( 重篤 ): 顕著な変化 もしくは観察組織の 3/4 以上に観察される

38 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page B 局所刺激性試験 ( ウサギ 2 回反復皮下 ) 報告書の題名 : 沈降新型インフルエンザワクチンのウサギを用いた 2 回反復皮下投与刺激性試験 被験物質 :A-04-01D 動物種 / 系統 : ウサギ / 日本白色種 (Kbl:JW) 投与回数 :2 回 (14 日間隔 ) 試験番号 : 投与開始時週齢 :12 週齢 CTD における記載箇所 : 投与年月日 :20 年月日 投与方法 : 皮下投与 ( 腹部皮下 ) 溶媒 / 投与形態 :- / 懸濁液 GLP 適用 : 適 特記事項 :1 回目の投与は右側腹部皮下 2 回目の投与は左側腹部皮下に行った 剖検は 2 回目投与の 2 日後 ( 初回投与後 16 日 ) 及び 7 日後 ( 初回投与後 21 日 ) に実施した 投与物質 A-04-01D DPT ワクチン 動物数 雄 :3 雄 :3 雄 :3 雄 :3 観察部位 1 回目 2 回目 1 回目 2 回目 1 回目 2 回目 1 回目 2 回目 剖検日 ( 投与後日数 ) 投与後 16 日 投与後 2 日 投与後 21 日 投与後 7 日 投与後 16 日 投与後 2 日 投与後 21 日 投与後 7 日 投与量 (ml/ 部位 ) 特記すべき所見 死亡及び屠殺動物数 一般状態 体重 剖検所見 ( 発現例数 ) 皮下組織 白色斑 淡褐色斑 腹壁 赤色点散在 病理組織学的検査 ( 個体のスコア a) ) 皮下組織 無定形物質の貯留 単核細胞浸潤 貧食マクロファージ 偽好酸球浸潤 線維化 出血 腹壁 単核細胞浸潤 偽好酸球浸潤 : 特記すべき所見なし DPT ワクチン : 沈降精製百日せきジフテリア破傷風混合ワクチン a) 0: 変化が認められない 1( 軽度 ): 変化がわずかに観察される程度 もしくは観察組織の 1/4 以下程度に観察される 2( 中等度 ): 変化がやや目立つ程度 もし くは観察組織の 1/2 以下程度に観察される 3( 高度 ): 変化がかなり目立つ程度 もしくは観察組織の 1/2 以上に観察される 4( 重篤 ): 顕著な変化 もしくは 観察組織の 3/4 以上に観察される

39 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page C 局所刺激性試験 ( ウサギ単回筋肉内 ) 報告書の題名 : 沈降新型インフルエンザワクチンのウサギを用いた単回筋肉内投与刺激性試験 被験物質 :A-04-01D 動物種 / 系統 : ウサギ / 日本白色種 (Kbl:JW) 投与回数 : 単回 試験番号 : 投与時週齢 :12 週齢 CTD における記載箇所 : 投与年月日 :20 年月日 投与方法 : 筋肉内投与 ( 後肢外側広筋 ) 溶媒 / 投与形態 :- / 懸濁液 GLP 適用 : 適 特記事項 : 剖検は投与後 2 日及び 7 日に実施した 肉眼的観察の結果は Shintani らの分類に従って判定した 病理組織学的検査の結果は 注射剤の局所障害性に関する試験法 ( 案 ) の検討につい て に基づく判定基準に従って総合的に評価した 剖検日 投与後 2 日 投与後 7 日 投与物質 生理 DPT 0.75v/v% 6v/v% 生理 DPT 0.75v/v% 6v/v% A-04-01D A-04-01D 食塩液ワクチン酢酸酢酸食塩液ワクチン酢酸酢酸 投与量 (ml/ 部位 ) 動物数 雄 :3 a) 雄 :3 雄 :3 a) 雄 :3 a) 雄 :3 雄 :3 a) 特記すべき所見死亡及び屠殺動物数 一般状態 体重 剖検所見 投与部筋肉 個体のスコア b) 例の平均スコア c) 分類 slight slight slight mild moderate none slight slight mild mild -: 特記すべき所見なし DPT ワクチン : 沈降精製百日せきジフテリア破傷風混合ワクチン a) ウサギの右側後肢外側広筋に A-04-01D 又は 0.75v/v% 酢酸を投与 左側後肢外側広筋に生理食塩液又は 6v/v% 酢酸を投与した b) 0: 変化が認められない 1: 軽度の充血及び変色が認められる 2: 中等度の充血及び変色が認められる 3: 周囲組織に比し明瞭な変色が認められる 4: 小範囲の壊死を伴 う褐色変性が認められる 5: 広範囲の壊死が認められる 筋肉の大部分に膿瘍が観察される場合もある c) 平均スコアの分類 0.4 以下 :none 0.5~1.4:slight 1.5~2.4:mild 2.5~3.4:moderate 3.5~4.4:marked 4.5 以上 :severe ( 続く )

40 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page C 局所刺激性試験 ( ウサギ単回筋肉内 ) ( 続き ) 試験番号 被験物質 :A-04-01D 剖検日 投与後 2 日 投与後 7 日 投与物質 生理 DPT 0.75v/v% 6v/v% 生理 DPT 0.75v/v% 6v/v% A-04-01D A-04-01D 食塩液ワクチン酢酸酢酸食塩液ワクチン酢酸酢酸 投与量 (ml/ 部位 ) 動物数 M:3 a) M:3 M:3 a) M:3 a) M:3 M:3 a) 病理組織学的検査 ( 個体のスコア b) ) 投与部筋肉 無定形物質の貯留 単核細胞浸潤 貧食マクロファージ 偽好酸球浸潤 筋線維変性 / 壊死 石灰化 水腫 出血 線維化 筋線維再生 c) A-04-01D: グレード 2 総合判定 DPT ワクチン : グレード 2 DPT ワクチン : 沈降精製百日せきジフテリア破傷風混合ワクチン a) ウサギの右側後肢外側広筋に A-04-01D 又は 0.75v/v% 酢酸を投与 左側後肢外側広筋に生理食塩液又は 6v/v% 酢酸を投与した b) 0: 変化が認められない 1( 軽度 ): 変化がわずかに観察される程度 もしくは観察組織の 1/4 以下程度に観察される 2( 中等度 ): 変化がやや目立つ程度 もしくは観 察組織の 1/2 以下程度に観察される 3( 高度 ): 変化がかなり目立つ程度 もしくは観察組織の 1/2 以上に観察される 4( 重篤 ): 顕著な変化 もしくは観察組織の 3/4 以 上に観察される c) 総合判定基準 グレード 1: 注射の 2 日後及び 7 日後のいずれの判定結果においても生理食塩液に比し その局所障害性が同等もしくは弱いものとする グレード 2: 注射の 2 日後及び 7 日後のいずれの判定結果においても 0.75% 酢酸に比し その局所障害性が弱いが いずれかの判定結果が生理食塩液に比し その局所障害性 が強いものとする グレード 3: 注射の 2 日後及び 7 日後のいずれの判定結果においても 6% 酢酸に比し その局所障害性が弱いが いずれかの判定結果が 0.75% 酢酸に比し その局所障害性が 同等もしくは強いものとする グレード 4: 注射の 2 日後及び 7 日後のいずれの判定結果においても 6% 酢酸に比し その局所障害性が同等もしくは強いものとする

41 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page D 局所刺激性試験 ( ウサギ 2 回反復筋肉内 ) 報告書の題名 : 沈降新型インフルエンザワクチンのウサギを用いた 2 回反復筋肉内投与刺激性試験 被験物質 :A-04-01D 動物種 / 系統 : ウサギ / 日本白色種 (Kbl:JW) 投与回数 :2 回 (14 日間隔 ) 試験番号 : 投与時週齢 :12 週齢 CTD における記載箇所 : 初回投与年月日 :20 年月日 投与方法 : 筋肉内投与 ( 後肢外側広筋 ) 溶媒 / 投与形態 :- / 懸濁液 GLP 適用 : 適 特記事項 : 1 回目の投与は右側 2 回目の投与は左側に行った 剖検は 2 回目投与の 2 日後 ( 初回投与後 16 日 ) 及び 7 日後 ( 初回投与後 21 日 ) に実施した 肉眼的観察の結果は Shintani らの分類に従って判定した 投与物質 A-04-01D DPT ワクチン 動物数 雄 :3 雄 :3 雄 :3 雄 :3 観察部位 1 回目 2 回目 1 回目 2 回目 1 回目 2 回目 1 回目 2 回目 剖検日 ( 投与後日数 ) 投与後 16 日 投与後 2 日 投与後 21 日 投与後 7 日 投与後 16 日 投与後 2 日 投与後 21 日 投与後 7 日 投与量 (ml/ 部位 ) 特記すべき所見 死亡及び屠殺動物数 一般状態 体重 剖検所見 個体のスコア a) 例の平均スコア b) 分類 slight slight none slight slight mild none slight -: 特記すべき所見なし DPT ワクチン : 沈降精製百日せきジフテリア破傷風混合ワクチン a) 0: 変化が認められない 1: 軽度の充血及び変色が認められる 2: 中等度の充血及び変色が認められる 3: 周囲の組織に比し明瞭な変色が認められる 4: 小範 囲の壊死を伴う褐色変性が認められる 5: 広範囲の壊死が認められる 筋肉の大部分に膿瘍が観察される場合もある b) 平均スコアの分類 0.4 以下 :none 0.5~1.4:slight 1.5~2.4:mild 2.5~3.4:moderate 3.5~4.4:marked 4.5 以上 :severe ( 続く )

42 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page D 局所刺激性試験 ( ウサギ 2 回反復筋肉内 ) ( 続き ) 試験番号 被験物質 :A-04-01D 投与物質 A-04-01D DPT ワクチン 動物数 雄 :3 雄 :3 雄 :3 雄 :3 観察部位 1 回目 2 回目 1 回目 2 回目 1 回目 2 回目 1 回目 2 回目 剖検日 ( 投与後日数 ) 投与後 16 日 投与後 2 日 投与後 21 日 投与後 7 日 投与後 16 日 投与後 2 日 投与後 21 日 投与後 7 日 投与量 (ml/ 部位 ) 病理組織学的検査 ( 個体のスコア a) ) 投与部位 無定形物質の貯留 単核細胞浸潤 貧食マクロファージ 偽好酸球浸潤 筋線維変性 / 壊死 石灰化 水腫 線維化 出血 筋線維再生 DPT ワクチン : 沈降精製百日せきジフテリア破傷風混合ワクチン a) 0: 変化が認められない 1( 軽度 ): 変化がわずかに観察される程度 もしくは観察組織の 1/4 以下程度に観察される 2( 中等度 ): 変化がやや目立つ程度 もしくは観 察組織の 1/2 以下程度に観察される 3( 高度 ): 変化がかなり目立つ程度 もしくは観察組織の 1/2 以上に観察される 4( 重篤 ): 顕著な変化 もしくは観察組織の 3/4 以上に観察される

43 沈降インフルエンザワクチン H5N1 生研 毒性試験概要表 Page その他の毒性試験 該当試験なし