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1 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 1 of 毒性試験の概要文の目次 まとめ 単回投与毒性試験 げっ歯類を用いた単回投与毒性試験 非げっ歯類を用いた単回投与毒性試験 反復投与毒性試験 ( トキシコキネティクス評価を含む ) マウスを用いた反復投与毒性試験 マウス 2 週間混餌投与試験 マウス 13 週間混餌投与試験 (1 回目 ) マウス 13 週間混餌投与試験 (2 回目 ) ラットを用いた反復投与毒性試験 ラット 2 週間混餌投与試験 ラット 4 週間経口投与試験 ラット 13 週間経口投与試験 ラット 13 週間混餌 ( 用量調整 ) 投与試験 ラット 26 週間経口投与試験 非げっ歯類を用いた反復投与毒性試験 イヌ 4 週間経口投与試験 イヌ 13 週間経口投与試験 イヌ 26 週間経口投与試験 イヌ 52 週間経口投与試験 遺伝毒性試験 In vitro サルモネラ / ミクロソーム試験 (Ames 試験 ) チャイニーズハムスター V79 細胞を用いる染色体異常試験 (in vitro) In vivo マウス小核試験 マウス骨髄細胞染色体異常試験 がん原性試験 ( トキシコキネティクス評価を含む ) マウスがん原性試験 ラットがん原性試験... 31

2 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 2 of 生殖発生毒性試験 ( 用量設定試験及びトキシコキネティクス評価を含む ) ラット受胎能及び初期胚発生に関する試験 ラット胚 胎児発生に関する試験 ウサギ胚 胎児発生に関する試験 ラット出生前 出生後発生に関する試験 幼若動物を用いた試験 幼若ラットパイロット 2 週間経口投与試験 幼若ラット 4/13/14 週間経口投与試験 局所刺激性試験 ウサギ静脈内投与局所刺激性試験 イヌ冠動脈内投与局所刺激性試験 その他の毒性試験 抗原性試験 免疫毒性試験 作用機序に関する試験 成体ラットを用いた骨密度及び骨形態に関する試験 依存性試験 代謝物に関する試験 代謝物 M-1(BAY ) の単回投与毒性試験 代謝物 M-1(BAY ) の反復投与毒性試験 マウスを用いた反復投与毒性試験 ラットを用いた反復投与毒性試験 イヌを用いた反復投与毒性試験 代謝物 M-1(BAY ) の遺伝毒性試験 代謝物 M-1(BAY ) のがん原性試験 代謝物 M-1(BAY ) の生殖毒性試験 代謝物 M-1(BAY ) のその他の試験 T3 NRU( ニュートラルレッド取り込み ) 光毒性試験 腎毒性の機序に関する試験 バルデナフィルとの併用毒性試験 不純物の毒性 原薬及び製剤中の不純物の毒性評価 製造中間体の Ames 試験 その他の試験 T3 NRU( ニュートラルレッド取り込み ) 光毒性試験... 57

3 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 3 of 局所リンパ節試験 / 皮膚反応の識別のための統合モデル (LLNA/IMDS) 考察及び結論 引用文献一覧... 81

4 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 4 of 毒性試験の概要文 まとめ リオシグアト (BAY ) の毒性及びトキシコキネティクスの特性を明らかにするために 包括的な毒性試験プログラムを実施した プログラムは リオシグアトの長期使用に対する現行の毒性試験法ガイドライン並びに規制要件に従った 毒性試験プログラムの概要を表 及び に示す 最大推奨臨床用量 (MRHD) は 2.5mg の 1 日 3 回経口投与 (7.5mg/ 日 ) である 非臨床におけるリスク評価及び安全域の推定は この推奨される最大 1 日用量に基づいて行った 臨床適用経路に従い 動物試験の投与経路は経口とした 単回投与毒性試験はマウス及びラットを用いて実施した 患者への長期投与を支持するための反復投与毒性試験は 投与期間がラットで最長 26 週間まで イヌで最長 52 週間までの試験により評価した 非げっ歯類の動物種として 代謝及び動態プロファイルがヒトに類似しており 更にリオシグアトの薬理学的作用に応答するイヌを使用した また 広範な遺伝毒性試験に加えて一連の生殖発生毒性試験をラット及びウサギを用いて実施した 短期パイロット試験を含む投与期間が 13 週間までのマウス及びラットによる用量設定試験を実施し がん原性試験の投与量 投与用調製物及び投与経路を設定し ラット及びマウスを用いてリオシグアトの 2 年間投与によるがん原性試験を実施した ヒトにおける絶対的バイオアベイラビリティ試験を支持するために ウサギを用いてリオシグアトの静脈内投与による局所刺激性試験を実施した 加えて 冠状動脈内投与によるリオシグアトの局所刺激性を評価する試験を実施した リオシグアトは 290~720nm の波長範囲で軽微な光吸収を示すことから in vitro 光毒性試験及び局所リンパ節試験を実施した 更に リオシグアトの主代謝物である M-1(BAY ) については別の化合物として臨床開発中であったことから 包括的な毒性試験プログラム ( 表 ) を実施した 主要な試験のすべては GLP に準拠して実施した 特に断らない限り 試験はすべて Bayer HealthCare 社毒性部門 ( ブッパタール ドイツ ) にて実施した

5 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 5 of 83 表 リオシグアトの毒性試験一覧 Type of Study/ Treatment duration Single-Dose Toxicity Single-dose toxicity Single-dose toxicity Repeat-Dose Toxicity Species & Strain Mouse, NMRI Method of Admin. Oral, Intravenous Doses/ Concentrations Oral: up to 2000 mg/kg IV: up to 200 mg/kg GLP Yes Report No. PH Rat, Wistar Oral up to 2000 mg/kg Yes PH week Mouse, CD-1 Oral, feeding 13-week Mouse, CD-1 Oral, feeding 13-week Mouse, CD-1 Oral, feeding 0, 50, 200, 800 ppm No PH , 16, 80, 400 ppm Yes PH , 200 ppm Yes PH week Rat, Wistar Oral, feeding 0, 50, 200, 800 ppm No PH week Rat, Wistar Oral 0, 1.5, 5, 15, 30 mg/kg Yes PH week Rat, Wistar Oral 0, 3, 10, 30 mg/kg Yes PH week Rat, Wistar Oral, 0, 4, 20, 100 mg/kg Yes PH feeding 26-week Rat, Wistar Oral 0, 2.5, 10, 40 mg/kg Yes PH week Dog, Beagle Oral 0, 0.3, 1, 3 (bid) mg/kg Yes PH week Dog, Beagle Oral 0, 0.3, 1, 3 mg/kg Yes PH week Dog, Beagle Oral 0, 0.3, 1, 3 mg/kg Yes PH week Dog, Beagle Oral 0, 0.3, 1, 3 mg/kg Yes A45725 a Genotoxicity Ames Test Cytogenetics in vitro Micronucleus Test Cytogenetics in vivo Carcinogenicity Salmonella strains In vitro Up to 5000 µg/plate Yes PH V79 cells In vitro Up to 450 µg/ml Yes PH Mouse, NMRI Mouse, NMRI Intraperitoneal Intraperitoneal 2-year Mouse, CD1 Oral, feeding 2-year Rat, Wistar Oral, feeding 0, 100, 200, 400, 800 mg/kg Yes PH , 200, 400, 800 mg/kg Yes PH , 50, 100, 200 ppm Yes PH , 5, 10, 20 mg/kg Yes PH a performed at Bayer HealthCare AG, Department of Toxicology, Berlin, Germany

6 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 6 of 83 表 リオシグアトの毒性試験一覧 ( 続き ) Type of Study/ Treatment duration Species & Strain Reproductive and Developmental Toxicity Fertility and early developmental toxicity Developmental toxicity Developmental toxicity Pre- and postnatal development Method of Admin. Doses/ Concentrations GLP Report No. Rat, Wistar Oral, 0, 3, 10, 30 mg/kg Yes PH Rat, Wistar Oral 0, 1, 5, 25 mg/kg Yes PH Rabbit, Himalayan Oral 0, 0.5, 1.5, 5 mg/kg Yes PH Rat, Wistar Oral 0, 1.5, 5, 15 mg/kg Yes PH Juvenile Animal studies 2-week Rat, Wistar Oral 0, 3, 10, 30 mg/kg No PH /13/14-week Rat, Wistar Oral 0, 0.3, 1, 3 mg/kg Yes PH Local Tolerance Single Dose Single Dose Other Studies 3T3 NRU test LLNA/IMDS Chronic mechanistic study on bone findings Rabbit, New Zieland White Dog, Mongrel Mouse fibroblasts (3T3.A31 cells) Mouse, NMRI Intravenous Intracoronary 25 ml of clinical formulation used in the total BA study 10 ml of clinical formulation used in the total BA study Yes No A42058 a PH In vitro Up to 300 µg/ml Yes PH Oral 0, 3, 10, 30 mg/kg Yes PH Rat, Wistar Oral 0, 10, 50/25 mg/kg Yes A43289 a a performed at Bayer HealthCare AG, Department of Toxicology, Berlin, Germany

7 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 7 of 83 表 代謝物 M-1(BAY ) の毒性試験一覧 Type of Study/ Treatment duration Single-dose toxicity Single dose toxicity Single dose toxicity Species & Strain Mouse, NMRI Method of Admin. Oral, Intravenous Doses/ Concentrations Oral: 2000 mg/kg IV: up to 200 mg/kg GLP Yes Report No. PH Rat, Wistar Oral 2000 mg/kg Yes PH Repeat-dose toxicity 2-week Mouse, CD-1 Oral, feeding 14-week Mouse, CD-1 Oral, feeding 0, 150, 500, 1500 ppm No PH , 100, 300, 1000 ppm Yes PH week Rat, Wistar Oral, 0, 150, 500, 1500 ppm No PH feeding 4-week Rat, Wistar Oral 0, 4, 20, 100 mg/kg Yes PH Version 2 13-week Rat, Wistar Oral M: 0, 5, 15, 50 mg/kg F: 0, 10, 30, 100 mg/kg Yes PH week + Rat, Wistar Oral M: 0, 50 mg/kg Yes PH week rec. F: 0, 100 mg/kg 13-week Rat, Wistar Oral 0, 10, 30, 100 mg/kg Yes PH week Rat, Wistar Oral 0, 3, 10, 30 mg/kg Yes PH week Rat, Wistar Oral 0,1, 5 mg/kg Yes A46694 a combination study with vardenafil 2-week Dog, Beagle Oral 0, 1, 3, 10 mg/kg Yes PH week Dog, Beagle Oral 0, 0.5, 1.5, 5 mg/kg Yes PH week Dog, Beagle Oral 0, 0.3, 1, 3 mg/kg Yes PH week Dog, Beagle Oral 0, 0.3, 1, 3 mg/kg Yes PH Genotoxicity Ames test Cytogenetics in vitro Salmonella In vitro Up to 5000 µg/plate Yes PH strains V79 cells In vitro Up to 400 µg/ml Yes PH Micronucleus test Mouse, NMRI Intraperitoneal 0, 25, 50, 100 mg/kg Yes PH a performed at Bayer HealthCare AG, Department of Toxicology, Berlin, Germany

8 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 8 of 83 表 代謝物 M-1(BAY ) の毒性試験一覧 ( 続き ) Type of Study/ Treatment duration Species & Strain Method of Admin. Reproductive and developmental toxicity Fertility & early embryonic development Embryo-fetal development Embryo-fetal development Phototoxicity 3T3 test Mechanistic studies Doses/ Concentrations GLP Report No. Rat, Wistar Oral 0, 1, 4, 20, 100 mg/kg Yes PH PH Rat, Wistar Oral 0, 2, 10, 50 mg/kg Yes PH Rabbit, Himalayan Mouse fibroblasts (3T3.A31 cells) 3-day Rat, Wistar Oral M: 15, 50 mg/kg Oral 0, 0.5, 1.5, 5 mg/kg Yes PH In vitro Up to 125 µg/ml Yes PH F: 30, 100 mg/kg No PH week Rat, Wistar Oral F: 0, 100 mg/kg Yes PH 以下にリオシグアトの非臨床安全性プロファイルを要約する リオシグアトの単回経口投与及び単回静脈内投与により 非特異的な毒性徴候が認められたのみであった 高用量で認められた臨床症状及び死亡は リオシグアトの過剰な血行動態作用に関連したものと考えられた 単回及び反復投与による毒性発現は雌雄間で質的及び量的に大差はなかった 反復投与による毒性プロファイルは細胞内 cgmp 増加に伴う二次的な影響として特徴付けられる 試験したすべての動物種で この薬理学的作用機序の結果として過度の平滑筋弛緩に起因した影響が観察された - マウスでは 高用量で血行動態作用による死亡が認められた 試験したほぼすべての用量で 平滑筋弛緩に続く消化管の運動性低下による消化管不忍容が認められた この慢性的な運動性低下の結果として 腸内毒素症及び粘膜の変性 / 再生を伴う慢性炎症が認められた - ラットでは 血行動態作用及びそれに続発する変化 並びに幼若及び若齢ラットにおける骨の代謝及び形態の変化が認められた 骨所見は成長が完了した成体ラットにはみられなかったことから この成長期の動物に認められた骨所見は 成人患者集団に対しては問題になるものではないと考えられる - イヌでは 消化管及び心血管系が平滑筋弛緩に関連する作用機序に最も感受性が高かった

9 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 9 of 83 リオシグアトは妊孕性及び初期胚発生に影響しなかった 主に母動物の忍容性 及び胚 胎児並びに出生前後発生がリオシグアトの薬理学的特性による影響を受けた ラット胎児に心臓奇形の増加が認められたが リオシグアトの血行動態作用及び心臓発生期における間葉系細胞への影響によるものと推察される 幼若動物試験では 成体ラットでの試験と比較して新たな毒性所見及び毒性標的臓器はみられなかった リオシグアトは広範な in vitro 及び in vivo 遺伝毒性試験バッテリーにおいて陰性であったことから 患者に対する遺伝毒性リスクはないものと考えられる マウスがん原性試験において リオシグアト投与により大腸の前腫瘍性及び腫瘍性病変が増加した これは消化管の平滑筋弛緩により生じた 慢性的な運動性低下 腸内毒素症 慢性炎症 粘膜の変性 再生及び再生性過形成 更には腫瘍に至る二次的な影響と考えられ マウスにおいてよく知られた病理発生機序である ラットでは 投与に関連した総腫瘍発現率又は個々のタイプの腫瘍発現率の増加は認められなかった マウスにおいてよく知られた消化管腫瘍の発生機序 ラットではがん原性を示唆する徴候はみられなかったこと イヌでは一般状態観察で明らかな消化管の運動性障害が認められたにもかかわらず消化管に炎症性変化が生じなかったこと 及びリオシグアトの臨床試験において腸の慢性的な炎症性変化が認められなかったことを考慮すると ヒトに対するがん原性リスクはないものと考えられる ヒト ラット マウス及びイヌにおいて リオシグアトの酸化的代謝によって主代謝物 M-1 (BAY ) が生じる すべての主要なリオシグアトの毒性試験において リオシグアトの最大推奨臨床用量の 7.5mg 投与時のヒトでの M-1 曝露量を超える曝露が動物で確認された 加えて M-1 は別の新規化合物として開発中であったことから 広範な in vitro 及び in vivo の毒性試験において評価した 全般的に M-1 の毒性プロファイルはリオシグアトと同様であった ラットに対して ヒト曝露量の 37 倍以上 (AUC) 及び 115 倍以上 (C max) の高曝露レベル ( いずれもたん白結合率の種差を考慮し補正 ) の M-1 投与により 腎毒性が認められた しかしながら M-1 の腎毒性に対して 13 倍の安全域があること 及びリオシグアトでは全く問題とならない腎臓の安全性プロファイルを考慮すると ヒトに対する危惧はないものと考えられる 総括すると 非臨床安全性評価に適切と考えられるマウス ラット及びイヌを用いた単回及び反復投与毒性試験において リオシグアトは臓器特異毒性を示さなかった 認められた影響は主に細胞内 cgmp 濃度の上昇に伴うリオシグアトの過度の薬理作用によるものと考えられる 遺伝毒性試験 幼若動物試験及びがん原性試験では 特に危惧すべき所見はなかった 生殖発生毒性試験では ラット胎児で心臓奇形が増加した この所見は リオシグアト固有の催奇形性というよりも 発生段階の心臓に対する血行動態又は間葉系細胞に対する本薬の薬理作用に起因した可能性が考えられるが リオシグアトは妊婦には禁忌とすべきである

10 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 10 of 単回投与毒性試験 げっ歯類を用いた単回投与毒性試験 参照項目 : PH リオシグアトの急性毒性を ラット 系統 :Wistar (Hsd Cpb:WU) を用いて経口投与により また マウス ( 系統 :Hsd WIN: NMRI) を用いて経口投与及び静脈内投与により検討した 経口投与ではリオシグアト ( バッチ ) を 0.5%Tylose 水溶液に懸濁し 投与容量 10mL/kg で強制経口投与した 静脈内投与ではリオシグアト ( バッチ ) を PEG 400 を用いて調製し 投与容量は 5mL/kgとした 経口投与及び静脈内投与後に リオシグアトに特異的な毒性症状は認められなかった 剖検においても 投与に関連した所見は認められなかった 最大非致死量 最小致死量及び概略の致死量を表 に示す ラット及びマウスを用いた単回投与毒性試験の結果 ラット及びマウスへの経口投与により 300mg/kg まで死亡は認められなかった 表 ラット及びマウスを用いた急性毒性試験の結果 Species Sex Route of administration Approximate lethal dose [mg/kg] Highest nonlethal dose [mg/kg] Lowest lethal dose [mg/kg] Mouse F Oral 300< < Rat F Oral 300< < Mouse F Intravenous 30 n.e. 30 n.e.= not established 非げっ歯類を用いた単回投与毒性試験 参照項目 : PH 非げっ歯類を用いた単回投与毒性試験は実施しなかった そのため イヌを用いた 4 週間反復経口投与毒性試験 ( ) における初回投与後又は投与初期の所見により リオシグアトの非げっ歯類における急性毒性を評価した イヌ 4 週間反復投与毒性試験では 1 群雌雄各 3 例のビーグル犬 ( 系統 :Bor:BEAG) にリオシグアトの 及び 3mg/kg を 1 日 2 回投与 ( 及び 6mg/kg/ 日 ) した リオシグアトは 0.5%Tylose 水溶液に懸濁し 投与容量 5mL/kg で強制経口投与した リオシグアトは 2mg/kg/ 日の用量まで良好な忍容性を示し 投与に関連した毒性症状は何ら認められなかった 高用量の 6mg/kg/ 日で 投与初期から全身状態の悪化 筋肉の痙攣 流涎 嘔吐の増加 肛門しぶり及び不安定歩行が観察された 死亡は 6mg/kg/ 日の用量まで認められなかった 以上の結果より イヌにおける単回経口投与時の概略の致死量は 6mg/kg/ 日を超える用量と判断された

11 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 11 of 反復投与毒性試験 ( トキシコキネティクス評価を含む ) マウスを用いた反復投与毒性試験 マウスを用いたがん原性試験の用量選択の根拠となるデータを得るために リオシグアトの混餌投与による 13 週間投与試験を実施した そのパイロット試験として マウスを用いた 2 週間混餌投与試験を実施した マウスにおける毒性プロファイルは 平滑筋弛緩に起因した消化管の運動性低下による胃 腸の不忍容及び過度の血行動態作用 ( 高用量では死亡をもたらした ) により特徴付けられるものであった マウス 2 週間混餌投与試験 参照項目 : PH 週間混餌投与によるパイロット試験 ( 非 GLP) において 1 群雌雄各 5 例のマウス 系統 : Crl:CD-1(ICR)BR に リオシグアトを 及び 800ppm の濃度で混餌投与した トキシコキネティクス評価のためにサテライト群として 各薬物投与群ともに雌雄各 15 例 (1 採血時点当たり 3 例 ) を設けた 一般状態を 1 日 2 回観察し 体重 摂餌量及び摂水量を試験期間中定期的に測定した 臨床検査用の血液検体を投与 2 週に採取した 投与期間終了時に生存動物を屠殺し 剖検及び臓器重量測定を実施した 摘出した臓器 組織を適切な方法で固定後 病理組織学的検査を実施した 200ppm までマウスの生存性及び一般状態 ( 体重を含む ) への影響はみられなかった 50 及び 200ppm の雄各 1 例が死亡したが 死因を示唆する所見がみられず偶発的なものと考えられた 800ppm で全身状態の悪化及び腹部膨満が投与開始後 3 日以内に出現し この群では全例が計画屠殺前に死亡した 50ppm 以上の雄で軽度な摂餌量減少 及び 200ppm の雌で摂水量減少が認められた 200ppm の雄で赤血球数が軽度に減少し 網赤血球数が増加した 200ppm の雌で白血球数減少がみられた 50ppm 以上の雄及び 200ppm の雌で肝臓重量の軽度増加が 200ppm の雌雄で脾臓の肥大及び脾臓重量の増加が認められた 200ppm で血漿中のコレステロール トリグリセリド及び尿素の減少が また肝組織中の酵素活性の軽度な変動 (CA-T 増加 GLU-T 減少 ) が認められた 特記すべき病理組織学的所見として 50ppm 以上の雌雄に小腸の拡張及び上皮の扁平化 800ppm の雌に大腸粘膜の炎症 及び雌雄に腎臓の遠位尿細管の軽微な肥大が認められた 200ppm の雌に小腸のパネート細胞の明瞭化が認められ 雄に脾臓の髄外造血亢進が認められた 800ppm を投与した数例の動物に 大腿骨の成長板の軽微な肥厚が観察された 以上の結果より 50ppm で認められた軽度な摂餌量減少及び肝臓重量増加 ( いずれも雄のみ ) 及び小腸の変化 ( 薬理作用によると考えられる ) は毒性変化ではないと考え 本試験における無毒性量は 50ppm と判断された トキシコキネティクスデータを表 に要約する

12 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 12 of 83 表 マウス 2 週間混餌投与試験におけるリオシグアトの定常状態での曝露量 ( 雌雄合算 ) Dose [ ppm] a Dose [mg/kg] AUC(0-24) [µg h/l] AUC(0-24)norm [kg h/l] Cmax [µg/l] Cmax, norm [kg/l] tmax [h] RA1 [%] RA3 [%] MR [%] RA1 = Cmax, Day12 / Cmax, Day 2 RA3 = AUC(0-24), Day 12 / AUC(0-24), Day 2 MR = metabolic ratio of BAY AUC(0-24)norm/riociguat AUC(0-24)norm a No data available for 800 ppm Source: , PH マウス 13 週間混餌投与試験 (1 回目 ) 参照項目 : PH がん原性試験の用量選択の根拠となるデータを得るために 1 群雌雄各 10 例のマウス 系統 :Crl:CD-1(ICR)BR を用いて 13 週間混餌投与試験を実施した トキシコキネティクス評価のためのサテライト群として 各薬物投与群共に雌雄各 15 例 (1 採血時点当たり 3 例 ) を設けた マウスには 及び 400ppm の濃度でリオシグアト ( バッチ ) を混餌投与した 用量はマウス 2 週間混餌投与試験 ( PH-34519) に基づいて選択した 一般状態を 1 日 2 回観察し 体重 摂餌量及び摂水量を試験期間中定期的に測定した 血液学的検査を投与 11 週 血液化学的検査を投与 13 週に実施した 投与期間終了時に生存動物を屠殺し 剖検及び臓器重量測定を実施した 摘出した臓器 組織を適切な方法で固定後 病理組織学的検査を実施した トキシコキネティクス評価用の採血を投与 2 日目及び投与期間終了時に行った 1 日当たりの薬剤摂取量を表 に示す リオシグアトは 80ppm まで良好な忍容性を示した 400ppm でリオシグアトの平滑筋弛緩作用又はそれに伴う消化管の運動抑制に起因した蒼白 腹囲増加 腹部膨満及び全身状態の悪化が認められ 薬物投与に起因する死亡が雌雄に認められた 400ppm で摂水量減少がみられた 血液学的検査において 400ppm で赤血球パラメータの減少がみられ 網赤血球数の増加並びに脾臓及び肝臓における髄外造血の増加を伴っていた また 白血球数 好中球数 異型リンパ球数及び血小板数の増加並びにリンパ球数の減少が認められた 更に 400ppm では骨髄における造血亢進が認められ 剖検では 腸の拡張 伸長及び内容物変化に加え 重量増加を伴う脾臓の肥大が観察された

13 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 13 of 83 病理組織学的検査では 400ppm の雌に盲腸の炎症が認められた 400ppm の雄及び 80ppm 以上の雌で 適応性の酵素誘導を示唆する肝臓重量の増加及び軽微 ~ 軽度の肝細胞肥大が認められた 肝臓における単細胞壊死が 400ppm の雌雄の各 1 例に観察された また 400ppm の雄及び 80ppm 以上の雌に小腸のパネート細胞の明瞭化が観察された 400ppm の雌で心臓重量の減少が認められ リオシグアトの血管拡張作用及び / 又は全身状態悪化に伴う心臓の脂肪組織の萎縮に関連したものと考えられた 更に 400ppm で 血漿たん白や尿素の減少及び様々な臓器の重量減少や萎縮性変化が観察された これらはこの用量で発現した顕著な毒性に起因した二次的なものと考えられ リオシグアトに特異的な臓器毒性を示すものではないと考えられた 以上の結果より 80ppm における肝臓及び小腸への影響はそれぞれ適応反応及び薬理作用によるもので毒性変化ではないと考え マウスに 13 週間混餌したときの無毒性量は 雌雄共に 80ppm と判断された 400ppm で腸の炎症性変化及び過度の血行動態作用が認められ 投与に関連した死亡が認められた トキシコキネティクスデータを表 に要約する 表 マウス 13 週間混餌投与試験 (1 回目 ) におけるリオシグアトの定常状態での曝露量 Sex Males Females Dose [ ppm] a a Dose [mg/kg] AUC(0-24) [µg h/l] AUC(0-24)norm [kg h/l] Cmax [µg/l] Cmax,norm [kg/l] Cmin/Cmax a [%] tmax [h] RA1 [%] n.c n.c. RA3 [%] n.c n.c. MR [%] n.c n.c. RA1 = Cmax, Day86/Cmax, Day 2 RA3 = AUC(0-24), Day 86/AUC(0-24), Day 2 MR = metabolic ratio of BAY AUC(0-24)norm / riociguat AUC(0-24)norm a Day 2 data only, Source: , PH n.c.= not calculated マウス 13 週間混餌投与試験 (2 回目 ) 参照項目 : PH 前述のマウス 13 週間混餌投与試験 ( 参照 ) では 400ppm で投与に関連した死亡が生じ 明らかに最大耐量 (MTD) を超えていた 一方 80ppm では明らかな毒性は認められなかった マウスにおける MTD により近い用量を明確にするために 200ppm の単一用量での 13 週間混餌投与による追加試験を 1 群雌雄各 10 例のマウス 系統 :Crl:CD-1(ICR)BR を用いて実施した トキシコキネティクス評価のためのサテライト群として 各群ともに雌雄各 15 例 (1 採血時点当たり 3 例 ) を設けた 検査項目は 1 回目の試験と同一とした

14 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 14 of 83 1 日当たりの薬剤摂取量とトキシコキネティクスデータを表 に示す 表 マウス 13 週間混餌投与試験 (2 回目 ) におけるリオシグアトの定常状態での曝露量 Sex Males Females Dose [ ppm] Dose [mg/kg] AUC(0-24) [ g h/l] AUC(0-24) norm [kg h/l] Cmax [ g/l] Cmax, norm [kg/l] Cmin/Cmax [%] tmax [h] RA1 [%] RA3 [%] MR [%] RA1 = Cmax, Day88/Cmax, Day 2 RA3 = AUC(0-24), Day 88/AUC(0-24), Day 2 MR = metabolic ratio of BAY AUC(0-24)norm / riociguat AUC(0-24)norm Source: , PH リオシグアトは 低頻度でみられた腹部膨満及び腸の拡張及び伸長を除き 臨床的に良好な忍容性を示した 病理組織学的検査では 一部の動物に空腸及び回腸のパネート細胞の明瞭化が認められたが 毒性を示唆する所見は認められなかった 肝臓重量の増加に対応する軽微 ~ 軽度の肝細胞肥大が雌雄に認められた また 網赤血球数増加 脾臓の肥大 / 重量増加及び髄外造血に反映される赤血球生成の活性化が認められた 要約すると リオシグアト 200ppm の混餌投与は明らかな毒性所見を示さず忍容性は全般的に良好であった ラットを用いた反復投与毒性試験 リオシグアトの主要な反復投与毒性試験として 強制経口投与による 26 週間までの試験を実施した また ラットを用いたがん原性試験の用量選択の根拠となるデータを得るために リオシグアトの混餌投与による 2 週間投与試験及び 13 週間投与試験を実施した ラット 2 週間混餌投与試験 参照項目 : PH 混餌投与による 2 週間投与試験 ( 非 GLP) では 1 群雌雄各 5 例のラット 系統 :Wistar (Hsd Cpb:WU) にリオシグアトを 及び 800ppm の濃度で混餌投与した これらの濃度は 1 日当たりの投与量として それぞれ雄で 及び 99.0mg/kg 雌で 及び 101.2mg/kg に相当する 薬物投与群に対して トキシコキネティクス評価のためのサテライト群として 各群ともに雌雄各 6 例 (1 採血時点雌雄各 3 例 ) を設けた

15 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 15 of 83 一般状態を 1 日 2 回観察し 体重 摂餌量及び摂水量を試験期間中定期的に測定した 臨床検査を投与 2 週に実施した 投与期間終了時に生存動物を屠殺し 剖検及び臓器重量測定を実施した 摘出した臓器 組織を適切な方法で固定後 病理組織学的検査を実施した 800ppm まで死亡はみられなかった 800ppm の雌雄で体重増加抑制が認められた 一般状態観察では 800ppm で腹部膨満とこれに関連する消化管の肉眼及び病理組織所見 ( 腸拡張など ) 及び皮膚 ( 耳 ) の発赤が観察された 800ppm で血管拡張作用に起因した陰茎勃起が認められた 200ppm 以上で雌の摂水量が増加した また 800ppm で摂餌量の軽度な変動 ( 雄で増加 雌で減少 ) がみられた 血液化学的検査における特記すべき所見として 800ppm の雄でクレアチニンの軽度増加 及び雌雄で総ビリルビンの増加が認められた 病理組織学的検査では 200ppm 以上の雄 及び 800ppm の雌に肝細胞の軽微 ~ 軽度な細胞質変化 / 肥大が認められた また 体重増加抑制に起因したと考えられる肝細胞の蓄積脂肪の減少が 800ppm の雄に認められた 以上の結果より ラットに 2 週間混餌投与したときの無毒性量は 800ppm での体重増加抑制に基づき 200ppm と判断された トキシコキネティクスデータを表 に要約する 表 ラット 2 週間混餌投与試験におけるリオシグアトの定常状態での曝露量 ( 雌雄合算 ) Dose [ ppm] AUC(0-20) [µg h/l] AUC(0-20)norm [kg h/l] Cmax [µg/l] Cmax, norm [kg/l] RA1 [%] RA3 [%] RA1 = Cmax, Day14 / Cmax, Day 2 RA3 = AUC(0-20)norm, Day 14 / AUC(0-20), Day 2 Source: , PH ラット 4 週間経口投与試験 参照項目 : PH 強制経口投与による 4 週間投与試験を ラット 系統 :Wistar (Hsd Cpb:WU) を用いて実施した リオシグアト ( バッチ ) の投与量は 及び 30mg/kg/ 日とした リオシグアトを 0.5%Tylose 水溶液に懸濁し 投与容量は 10mL/kg とした ラットは 1 群雌雄各 10 例からなる対照群 ( 媒体投与 ) 及び 4 薬物投与群に無作為に配置した また トキシコキネティクス評価用に各群にサテライト群 (1 採血時点雌雄各 3 例 ) を設けるとともに 対照群及び高用量群に投与後 2 週間休薬による回復試験群 ( 雌雄各 10 例 / 群 ) を設定した 一般状態観察 及び体重 摂餌量並びに摂水量測定を試験期間中定期的に実施した トキシコキネティクス評価は投与 1 日目及び 29 日目に実施し 投与後 及び 24 時間に採血した 臨床検査 ( 血液学的検査 血液化学的検査及び尿検査 ) を投与 4 週 ( 主試験群 ) 及び回復期間終了時に実施した 投与期間及び回復期間終了時にそれぞれ生存動物を屠殺し 剖検及び臓器重量測定を実施した 摘出した臓器 組織を適切な方法で固定後 病理組織学的検査を実施

16 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 16 of 83 した 剖検時に肝臓組織を採取し ホモジネートした肝臓組織中の酵素活性を測定した さらに 免疫毒性学的検査を実施した リオシグアトは 1.5mg/kg 以上の雌で網赤血球数増加を伴う赤血球パラメータの軽微な増加がみられたが 5mg/kg まで概ね良好な忍容性を示した 一般状態観察において 30mg/kg で陰茎勃起及び一過性の体重増加抑制が認められた 血清中カルシウム濃度が統計学的に有意に増加したが ( 雄 :15mg/kg 以上 雌 :1.5mg/kg 以上 ) 用量との関連はみられなかった 30mg/kg の雌雄で血清中カリウム濃度の軽度な減少が認められた 5mg/kg 以上の雄で血漿中の尿素が増加したが 尿細管損傷の指標となる尿中 LDH は増加しておらず むしろわずかな減少を示した 回復群では 赤血球パラメータの軽微な増加 ( 網赤血球は減少 ) がわずかに認められたが 血液化学的検査及び尿検査において影響はみられなくなった 肝臓相対重量の可逆的な増加 ( 雄 :5mg/kg 以上 雌 :30mg/kg) 及び肝細胞の軽微 ~ 軽度な細胞質の変化 ( 雄 :5mg/kg 以上 雌 :15mg/kg 以上 ) は毒性ではなく適応性の変化と考えられる 30mg/kg の雄で副腎重量増加及び雌で脾臓重量増加が認められた 15mg/kg 以上の雄で胸腺重量の低下がみられたが この試験で行った免疫毒性に関する評価では 30mg/kg まで免疫系への影響は認められなかった いずれの変化も回復群では認められなかった 病理組織学的検査では 15mg/kg 以上で大腿骨成長板の肥厚 ( 雄 ) 及び腸間膜リンパ節における組織球の増加が認められた 回復群では 大腿骨成長板の肥厚 ( 雄 ) は頻度が減少し 腸間膜リンパ節における組織球の増加は認められなかった 以上の結果より ラットに 4 週間投与したときの無毒性量は 大腿骨成長板及び腸間膜リンパ節の組織学的変化を毒性所見と捉え 5mg/kg/ 日と判断された トキシコキネティクスデータでは ほぼ用量に比例した曝露の増加がすべての用量で認められた その結果を表 に示す 表 ラット 4 週間経口投与試験におけるリオシグアトの定常状態での曝露量 Sex Males Females Dose [mg/kg] AUC(0-24) [ g h/l] AUC(0-24)norm [kg h/l] Cmax [ g/l] Cmax,norm [kg/l] C(24)/Cmax [%] n.c n.c tmax [h] RA1 [%] RA3 [%] RA1 = Cmax, Day 29 / Cmax, Day 1 RA3 = AUC(0-24), Day 29 / AUC(0-24), Day 1 n.c. = not calculated Source: , PH-33408

17 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 17 of ラット 13 週間経口投与試験 参照項目 : PH 強制経口投与による 13 週間反復投与試験を ラット 系統 :Wistar (Hsd Cpb:WU) を用いて実施した リオシグアト ( バッチ ) の投与量は 及び 30mg/kg/ 日とした リオシグアトを 0.5%Tylose 水溶液に懸濁し 投与容量は 10mL/kg とした ラットは 1 群雌雄各 10 例からなる対照群 ( 媒体投与 ) 及び 3 薬物投与群に無作為に配置した また トキシコキネティクス評価用 (1 採血時点雌雄各 3 例 ) 及び免疫毒性評価用 ( 雌雄各 8 例 / 群 ) に動物を追加した 投与量は 4 週間試験 ( 参照 ) の結果に基づいて選択した 一般状態観察及び体重 摂餌量並びに摂水量測定を試験期間中定期的に実施し また眼科学的検査を実施した トキシコキネティクス評価は投与 1 日目及び 91 日目に行い 薬物投与群では投与後 及び 24 時間に 対照群では投与後 1 7 及び 24 時間に採血した 臨床検査 ( 血液学的検査 血液化学的検査及び尿検査 ) を投与 5 週及び 13 週目に主試験群の全例について実施した 投与期間終了時に生存動物を屠殺し 剖検及び臓器重量測定を実施した 摘出した臓器 組織を適切な方法で固定後 病理組織学的検査を実施した 主試験群の動物から脾臓検体及び血液検体を採取し FACS(Fluorescence Activated Cell Scan) 解析及び免疫グロブリン測定に使用した 免疫毒性学的検査に供した動物について ヒツジ赤血球で免疫した後にプラークアッセイを実施した 一般状態観察において 耳の発赤 (10mg/kg 以上 ) 一過性の陰茎勃起 (30mg/kg) 及び体温の軽度低下 (30mg/kg の雄 ) が観察された 10mg/kg 以上の雌で立ち上がり回数が減少し 高用量群の雄では活動性の軽度低下が認められた 更に 30mg/kg の雄で軽度の体重増加抑制及び削痩が認められた 10mg/kg 以上の雄及び 30mg/kg の雌で摂水量の増加が観察された 雌では 3mg/kg 以上でみられた骨髄細胞の活性化を反映したヘマトクリット値 赤血球数及びヘモグロビン濃度の軽度増加が認められた また 30mg/kg の雌に単球数及び異型白血球数の軽度増加が認められた アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT) の約 20% 程度の増加が単発的に認められたが (30mg/kg の雄 ) 生物学的に意味がないものと考えられた 3mg/kg 以上の雄で血漿総たん白濃度の低下及び 30mg/kg の雄でトリグリセライドの低下がそれぞれ軽度に認められた また 30mg/kg の雄及び 10mg/kg 以上の雌で血清中の無機リン濃度が軽度に上昇し また 30mg/kg の雌でカルシウム濃度が軽度に上昇した 尿検査では 10mg/kg 以上の雄で尿量が増加し その結果として尿比重及び尿素 クレアチニン及びたん白の尿中濃度が低下した 肝ホモジネートの解析では 10mg/kg 以上の雌で第 Ⅰ 相薬物代謝酵素 (EROD ECOD ALD CA-T EH) 及び第 Ⅱ 相薬物代謝酵素 (GS-T GLU-T) の増加が認められ これに一致して肝臓相対重量の軽度増加及び肝細胞の細胞質濃縮が認められた 30mg/kg の雄に認められた前立腺 精嚢腺及び精巣上体の絶対重量の減少は この用量でみられた体重増加抑制に関連したものと考えられる 免疫毒性学的検査では投与による影響は認められなかった 病理組織学的検査では 3mg/kg 以上の雄 及び 10mg/kg 以上の雌に副腎球状帯の肥大が認められた これに伴い 10mg/kg 以上の雌で副腎重量が増加した 3mg/kg 以上で骨髄における造血亢進が認められた 10mg/kg 以上 特に 30mg/kg の雄で腸間膜静脈の血管間隙の拡張 ( 網状変化 ) が認められた また 10mg/kg 以上でパネート細胞の空胞化が観察された 以上の結果より ラットに 13 週間投与したときの無毒性量は 体重増加抑制を毒性所見と捉え雄で 10mg/kg/ 日 及び雌で 30mg/kg/ 日と判断された 定常状態でのトキシコキネティクスデータを表 に要約する

18 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 18 of 83 表 ラット 13 週間経口投与試験におけるリオシグアトの定常状態での曝露量 Sex Males Females Dose [mg/kg] AUC(0-24) [ g h/l] AUC(0-24)norm [kg h/l] Cmax [ g/l] Cmax,norm [kg/l] C(24)/Cmax [%] tmax [h] RA1 [%] RA3 [%] MR [%] n.c RA1 = Cmax, Day 91 / Cmax, Day 1 RA3 = AUC(0-24), Day 91 / AUC(0-24), Day 1 MR = metabolic ratio of BAY AUC(0-24)norm / riociguat AUC(0-24)norm Source: , PH ラット 13 週間混餌 ( 用量調整 ) 投与試験 参照項目 : PH ラットを用いたがん原性試験の用量選択の根拠となるデータを得るために 投与量を調整した 13 週間混餌投与試験を ラット 系統 :Wistar (Hsd Cpb:WU) を用いて実施した ラットは 1 群雌雄各 10 例からなる対照群 ( 純飼料 ) 及び 3 薬物投与群に無作為に配置した また トキシコキネティクス評価用 (1 採血時点雌雄各 3 例 ) に動物を追加し 投与 3/4 日目及び 88/89 日目にそれぞれ 4 時間間隔で 6 時点から採血した 主試験群とトキシコキネティクス評価用動物にはリオシグアト ( バッチ ) を13 週間混餌投与した mg/kg 単位での一定した被験物質摂取量を確保し リオシグアトの投与量が 及び100mg/kgとなるように週単位で混餌濃度を調整した 投与期間を通じての平均投与量は 雄で 及び 101.6mg/kg 雌で 及び105.3mg/kg であった 一般状態観察及び体重 摂餌量並びに摂水量測定を試験期間中定期的に実施し また眼科学的検査を実施した 臨床検査 ( 血液学的検査 血液化学的検査及び尿検査 ) を投与 13 週に主試験群の全例について実施した 投与期間終了時に生存動物を屠殺し 剖検及び臓器重量測定を実施した 摘出した臓器 組織を適切な方法で固定後 病理組織学的検査を実施した 剖検時に 肝ホモジネート中の酵素活性を測定するために肝臓検体を採取した 一般状態観察において 100mg/kg で腹部膨満及び下痢 ( 雌雄 ) 陰茎勃起 るいそう 立毛 鶏状歩行 ( 以上 雄 ) 及び粗毛 ( 雌 ) が認められた 20mg/kg 以上の雄で体重増加抑制が認められた この用量以上で摂餌量の増加が雌雄に認められた また 100mg/kg の雄及び 20mg/kg 以上の雌で摂水量の増加が認められた 赤血球パラメータ (20mg/kg 以上 ) 及び網赤血球数 (4mg/kg 以上 ) が雌雄で軽度に増加した 20mg/kg 以上の雌で尿量が増加し その結果として尿比重 及び尿素及びクレアチニンの尿中濃度が低下した 血液化学的検査では 20mg/kg 以上でトリグリセリド 100mg/kg で総たん白及びカルシウム濃度がそれぞれ軽度に低下した

19 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 19 of mg/kg の雄で脳 副腎及び精巣 雌雄で脾臓のそれぞれ相対重量増加 及び雄で胸腺相対重量減少が認められた 20mg/kg 以上の雌で肝臓相対重量増加が認められた 加えて 心臓相対重量の増加 ( 雄 :100mg/kg 雌 :20mg/kg 以上 ) 及び前立腺 (20mg/kg 以上 ) 及び精嚢腺 (100mg/kg) の相対重量の減少が認められた 強制経口投与後と同様に 20mg/kg 以上 ( 主に雌 ) で第 Ⅰ 相及び第 Ⅱ 相薬物代謝酵素の誘導が認められた 剖検では 腸の伸長 ( 雄 :4mg/kg 以上 雌 :20mg/kg 以上 ) 及び盲腸の拡張 ( 雄 :100mg/kg) が 一般状態観察でみられた腹部膨満に付随して認められた 病理組織学的検査では 100mg/kg の雌雄に心臓の冠動脈の中膜肥厚及び腸間膜静脈の網状変化に加え慢性進行性腎症の発現頻度低下が認められた 20mg/kg 以上で造血亢進 ( 骨髄 100mg/kg で脾臓 ) が認められ 4mg/kg 以上の雌雄に副腎球状帯の肥大が認められた 更に パネート細胞の肥大 (4mg/kg 以上の雌雄 ) 肝細胞の細胞質濃縮 ( 雄 :20mg/kg 以上 雌 : 100mg/kg) 門脈周囲の蓄積脂肪の減少 (20mg/kg 以上の雌雄 ) 門脈周囲炎 (100mg/kg の雌 ) 及び腎臓における尿細管の色素沈着増加 ( 雄 :100mg/kg 雌 :20mg/kg 以上 ) が観察された 100mg/kg の雄に副甲状腺の細胞活性化 / 肥大 及び雌雄に胆管の活性化 / 過形成が認められた 20mg/kg 以上の雄及び 100mg/kg の雌に大腿骨及び胸骨のリモデリング促進が認められた 以上の結果より ラットに 13 週間混餌投与したときの無毒性量は 4mg/kg における網赤血球数の軽度増加及び副腎球状帯肥大は毒性所見ではないと考え 4mg/kg/ 日と判断された 定常状態でのトキシコキネティクスデータを表 に要約する 表 ラット 13 週間混餌 ( 用量調整 ) 投与試験におけるリオシグアトの定常状態での曝露量 Male Female Dose [mg/kg] AUC(0-24) [µg h/l] AUC(0-24)norm [kg h/l] Cmax [µg/l] Cmax, norm [kg/l] Cmin/Cmax [%] tmax [h] RA1 [%] RA3 [%] MR [%] RA1 = Cmax, Day88 / Cmax, Day 3 RA3 = AUC(0-24), Day 88 / AUC(0-24), Day 3 MR = metabolic ratio of BAY AUC(0-24)norm / riociguat AUC(0-24)norm Source: , PH-34877

20 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 20 of ラット 26 週間経口投与試験 参照項目 : PH 強制経口投与による 26 週間投与試験を ラット 系統 :Wistar (Hsd Cpb:WU) を用いて実施した ラットは 1 群雌雄各 20 例からなる対照群 ( 媒体投与 ) 及び 3 薬物投与群に無作為に配置した また トキシコキネティクス評価用 (1 採血時点雌雄各 3 例 ) に動物を追加した リオシグアト ( バッチ ) の投与量は 及び 40mg/kg/ 日とした リオシグアトは 0.5%Tylose 水溶液に懸濁し 投与容量は 10mL/kg とした 投与量はラットを用いた 4 週間投与試験 ( 参照 ) 及び 13 週間投与試験 ( 参照 ) の結果に基づいて選択した 一般状態観察及び体重 摂餌量並びに摂水量測定を試験期間中定期的に実施した また眼科学的検査を投与開始前 ( 全群 ) 及び投与期間終了時 ( 対照群及び高用量群 ) について実施した 臨床検査 ( 血液学的検査 血液化学的検査及び尿検査 ) を投与 12/13 週及び 25/26 週目に各群雌雄各 10 例について実施した 投与期間終了時に生存動物を屠殺し 剖検及び臓器重量測定を実施した 摘出した臓器 組織を適切な方法で固定後 病理組織学的検査を実施した 剖検時に 肝ホモジネート中の酵素活性を測定するために肝臓検体を採取した トキシコキネティクスの評価は投与 1 28 及び 182 日目に実施した 血液検体は 薬物投与群では投与後 及び 24 時間に 対照群では投与後 1 7 及び 24 時間に採取した リオシグアトは全般的に良好な忍容性を示した 対照群及び高用量群の各雌 1 例が死亡したが 死因はそれぞれ悪性リンパ腫 ( 対照群 ) 及び採血過誤 ( 高用量群 ) によるものであり 投与による死亡は認められなかった 臨床的に 皮膚の発赤 (2.5mg/kg 以上の雌雄 ) 陰茎勃起 (10mg/kg 以上 ) 腹囲増加 (40mg/kg の雌 ) 一過性の体重増加抑制 (40mg/kg の雄 ) 及び摂水量増加 (10mg/kg 以上の雌雄 ) が観察された 40mg/kg では投与 1 週に一過性の摂餌量減少がみられたが それ以降は対照群と差はみられなかった 40mg/kg の雌に白血球数 リンパ球数及び異型リンパ球数の増加がみられたが 免疫系の器官に形態学的に関連する変化を伴っていなかったことから 毒性とは考えられなかった 血液化学的検査では 用量に関連しないカリウムの軽度減少がすべての用量の雄に認められた また たん白及びトリグリセリド減少 (40mg/kg の雄及び / 又は雌 ) 尿素増加 (10mg/kg 以上の雌雄 ) に加え 肝薬物代謝酵素の変動は毒性変化ではなく 肝臓の機能変化を反映したものと考えられた 10mg/kg 以上の雌で血漿中 T3 が減少したが 投与量との相関はなく 関連する組織学的変化を伴っていなかったことから 毒性とは考えられなかった 尿検査において 摂水量増加の結果として 40mg/kg で尿量増加及び尿比重低下が認められた より短期間の試験と同様に 副腎の重量増加及び球状帯肥大が 10mg/kg 以上の雌雄に認められた 10mg/kg 以上の雌で肝臓重量が増加した 40mg/kg の雌で脾臓及び腎臓の絶対重量の増加 雄で前立腺 精嚢腺及び精巣上体の絶対重量の減少が認められた 剖検では 腸の伸長 (10mg/kg 以上の雌雄 ) 及び盲腸の拡張 (40mg/kg の雌 ) また肝臓の肥大 ( 雄 :2.5mg/kg 以上 雌 :40mg/kg) が認められた 腸の変化については剖検所見に関連する組織学的な変化を欠いていたが 肝臓では肝細胞の肥大及び細胞質変化 (40mg/kg の雌 ) 並びに門脈周囲の蓄積脂肪の減少 ( 雄 :40mg/kg 雌 :10mg/kg 以上 ) が認められた 腎臓において 40mg/kg の雄及び 2.5mg/kg 以上の雌に尿細管の色素沈着の増加が認められた 10mg/kg 以上の雄及び 40mg/kg の雌に大腿骨のリモデリングの促進及び過骨症が認められた 40mg/kg でパネート細胞の明瞭化 ( 雌 ) 及び腸間膜静脈の網状変化 ( 雌雄 ) が認められた 以上の結果より ラットに 26 週間投与したときの無毒性量は 骨の組織学的変化を毒性と捉え 雄で 2.5mg/kg/ 日 雌で 10mg/kg/ 日と判断された

21 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 21 of 83 トキシコキネティクスデータを表 に要約する 表 ラット 26 週間経口投与試験におけるリオシグアトの定常状態での曝露量 Sex Males Females Dose [mg/kg] AUC(0-24) [ g h/l] n.c AUC(0-24)norm [kg h/l] n.c Cmax [ g/l] Cmax,norm [kg/l] C(24)/Cmax [%] n.c tmax [h] RA1 [%] RA3 [%] n.c MR [%] n.c RA1 = Cmax, Day 182 / Cmax, Day 1 RA3 = AUC(0-24), Day 182 / AUC(0-24), Day 1 MR = metabolic ratio of BAY AUC(0-24)norm / riociguat AUC(0-24)norm Source: , PH 非げっ歯類を用いた反復投与毒性試験 非げっ歯類を用いた反復投与毒性試験では リオシグアトをイヌに最長 52 週間投与した イヌ 4 週間経口投与試験 参照項目 : PH 非げっ歯類に 4 週間投与した時のリオシグアトの毒性試験において 約 33 週齢 ( 試験開始時 ) のビーグル犬 ( 系統 :Bor:BEAG) を雌雄各 3 例 / 群を 対照群 ( 媒体投与 ) 及び 3 薬物投与群に無作為に配置した リオシグアト ( バッチ ) は 及び 3mg/kg を 1 日 2 回 (bid)4 週間強制経口投与した ( mg/kg/ 日 ) リオシグアトは 0.5%Tylose 水溶液に懸濁し 投与容量は 5mL/kg とした 更に回復試験用に雌雄各 2 例を対照群及び高用量群にそれぞれ追加し 同様に4 週間投与した後に2 週間の観察期間を設けた 一般状態観察及び摂餌量測定を毎日実施した 体重を試験期間中定期的に測定した 臨床検査 ( 血液学的検査 血液化学的検査及び尿検査 ) を投与開始前 投与 2 週及び 4 週目に各群全例について また 6 週目 ( 回復期間終了時 ) に回復動物の全例について実施した 心血管機能の評価のために 心電図及び観血式血圧測定を投与開始前 投与 4 週目 ( 投与前及び投与後 2 時間 ) 及び回復期間終了時に実施した 眼科学的検査 神経学的検査 ( 反射検査 ) 及び体温測定を投与開始前 投与期間終了時及び回復期間終了時に全例について実施した 投与期間及び回復期間終了時にそれぞれ生存動物を屠殺し 剖検及び臓器重量測定を実施した 摘出した臓器 組織を適切な方法で固定後 病理組織学的検査を実施した また 剖検時に肝ホモジネート中の酵素活性を測定するために肝臓検体を採取した トキシコキネティクス評価を投与 1 日目及び 4 週目に行い 薬物投与群では 1 回目投与の投与前 投与後 及び 24 時間並びに 2 回目投与後 及び 5 時間に採血した 対照群ではそれぞれ投与後 1.5 時間に採血した

22 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 22 of 83 リオシグアトは 1mg/kg bid(2mg/kg/ 日 ) まで良好な忍容性を示した 高用量の 3mg/kg bid (6mg/kg/ 日 ) で 全身状態の悪化 筋振戦 流涎 嘔吐の発現頻度増加 肛門しぶり 不安定歩行 摂餌量低下及び体重減少が認められた 所見の重篤性から 高用量群では投与を 1 週又は 2 週で中断し 投与量を投与 3 週目に 2mg/kg bid に 更に投与 4 週目に 2mg/kg/ 日に減量した 0.6mg/kg/ 日以上で大幅な拡張期血圧及び収縮期血圧の低下がみられ これに伴って著しい反射性頻脈が認められた これらの所見は過度の血行動態作用に起因したものと考えられる 消化管症状 ( 嘔吐及び肛門しぶり ) は消化管の平滑筋弛緩に起因したものと考えられる 高用量群の動物で血中の尿素 たん白及び GLDH 増加 電解質変化 及び尿量減少を示す例がみられたが 全身状態の著しい悪化による非特異的な変化と考えられた また 尿検査において 高用量群の動物にたん白 ビリルビン ウロビリノーゲン 三リン酸塩及び ph の高値を示す例が散見された 病理組織学的検査では 腎臓における軽度で可逆的な好塩基性尿細管の増加及び肝細胞のグリコーゲン貯蔵増加に関連した明細胞化が高用量群に認められた 回復期間終了時 これらの変化には回復又は回復傾向が認められた 以上の結果より イヌに 4 週間投与したときの無毒性量は 3mg/kg bid(6mg/kg/ 日 ) で全身状態の悪化及び体重減少が認められたことから 雌雄共に 1mg/kg bid(2mg/kg/ 日 ) と判断された トキシコキネティクスデータを表 に要約する 表 イヌ 4 週間経口投与試験におけるリオシグアトの定常状態での曝露量 Sex Males Females Dose [mg/kg/d] 0.6 (2*0.3) 2 (2*1) 6 2 (2*3) a (1*2) 0.6 (2*0.3) 2 (2*1) 6 2 (2*3) a (1*2) AUC(0-24) [ g h/l] AUC(0-24)norm [kg h/l] Cmax [ g/l] Cmax,norm [kg/l] C(24)/Cmax [%] tmax [h] RA1 [%] RA3 [%] RA1 = Cmax, Day 25 / Cmax, Day 1 RA3 = AUC(0-24), Day 25 / AUC(0-24 ), Day 1 a Dose was reduced to 2 mg/kg once daily, hence only day 1 data are available Source: , PH イヌ 13 週間経口投与試験 参照項目 : PH 強制経口投与による 13 週間投与毒性試験を 24~27 週齢 ( 試験開始時 ) のビーグル犬 ( 系統 : Bor:BEAG) 雌雄各 16 例 (1 群雌雄各 4 例 ) を用いて実施した 動物を対照群 ( 媒体投与 ) 及び 3 薬物投与群に無作為に配置した リオシグアト ( バッチ ) は 0.5%Tylose 水溶液に懸濁

23 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 23 of 83 し 及び 3mg/kg/ 日の用量を 投与容量 5mL/kg で 13 週間投与した 投与量は bid での 6mg/kg/ 日投与後の忍容性が不良であったことから 4 週間投与試験 ( 参照 ) より用量を低くした 一般状態観察及び摂餌量測定を毎日実施した 体重を試験期間中定期的に測定した トキシコキネティクス評価を投与 1 日目及び 12 週目に実施し 薬物投与群から投与後 及び 24 時間に採血した 臨床検査 ( 血液学的検査 血液化学的検査及び尿検査 ) を投与開始前 投与 4 9 及び 13 週目に各群全例について実施した 心血管機能の評価のために 心電図及び観血式血圧測定を投与開始前 投与 1 6 及び 13 週目 ( 投与前及び投与後 2 時間 ) に実施した 眼科学的検査 神経学的検査 ( 反射検査 ) 及び体温測定を投与開始前 投与 6 及び 13 週目に全例について実施した 投与期間終了時に生存動物を屠殺し 剖検及び臓器重量測定を実施した 摘出した臓器 組織を適切な方法で固定後 病理組織学的検査を実施した リオシグアトは 1mg/kg 以上で嘔吐及び流涎の増加 3mg/kg で便の異常 ( 泥状 / 液状 / 赤色便 ) が認められた以外は 臨床的に良好な忍容性を示した 薬理学的作用機序の結果として 0.3mg/kg 以上で収縮期 / 拡張期血圧の低下 並びに 1mg/kg 以上で心拍数増加が認められた 臨床検査では投与に関連する影響は認められなかった 病理組織学的検査では 0.3mg/kg 以上で軽微な心内膜炎及び心筋の動脈周囲の軽微な浮腫が認められた 1mg/kg 以上で心筋内の動脈壁の軽微な肥厚が認められた 3mg/kg で副腎重量増加を伴う球状帯の肥大が認められた 以上の結果より イヌに 13 週間投与したときの無毒性量は 低用量から心臓の組織学的変化がみられたため特定できなかった トキシコキネティクスデータを表 に要約する 表 イヌ 13 週間経口投与試験におけるリオシグアトの定常状態での曝露量 ( 第 12 週 ) Sex Males Females Dose [mg/kg/d] AUC(0-24) [ g h/l] AUC(0-24)norm [kg h/l] Cmax [ g/l] Cmax,norm [kg/l] C(24)/Cmax [%] n.c tmax [h] RA1 [%] RA3 [%] MR [%] RA1 = Cmax, Week 12 / Cmax, Day 1 RA3 = AUC(0-24), Week 12 / AUC(0-24), Day 1 MR = metabolic ratio of BAY AUC(0-24)norm / riociguat AUC(0-24)norm Source: , PH-34778

24 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 24 of イヌ 26 週間経口投与試験 参照項目 : PH 強制経口投与による 26 週間反復投与毒性試験を 21 週齢 ( 試験開始時 ) のビーグル犬 ( 系統 : Bor:BEAG) 雌雄各 16 例 (1 群雌雄各 4 例 ) を用いて実施した 動物は対照群 ( 媒体投与 ) 及び 3 薬物投与群に無作為に配置した リオシグアト ( バッチ ) は 0.5%Tylose 水溶液に懸濁し 及び 3mg/kg/ 日の用量を 投与容量 5mL/kg で 26 週間投与した 投与量はイヌを用いた 4 週間投与試験 ( 参照 ) 及び 13 週間投与試験 ( 参照 ) の結果に基づいて選択した 一般状態観察及び摂餌量測定を毎日実施した 体重を試験期間中定期的に測定した トキシコキネティクス評価を投与 1 日目及び 25 週目に実施し それぞれ投与後 及び 24 時間に採血した 臨床検査 ( 血液学的検査 血液化学的検査及び尿検査 ) を投与開始前 投与 6 13 及び 26 週目に各群全例について実施した 心血管機能の評価のために 心電図及び観血式血圧測定を投与開始前 投与 13 及び 26 週目 ( 投与前及び投与後 2 時間 ) に実施した 眼科学的検査 神経学的検査 ( 反射検査 ) 及び体温測定を投与開始前 投与 5 13 及び 26 週目に全例について実施した 投与期間終了時に生存動物を屠殺し 剖検及び臓器重量測定を実施した 摘出した臓器 組織を適切な方法で固定した後 病理組織学的検査を実施した リオシグアトは 0.3mg/kg まで全般的に良好な忍容性を示した 試験開始前から体重が低かった高用量群の雌 1 例が投与 2 週目から体重が減少し 全身状態悪化のため投与 6 週に死亡が確認された 剖検及び病理組織学的検査からは全身状態悪化を説明できる所見は認められなかったことから 投与との関連は不明であった 3mg/kg で嘔吐及び流涎の頻度増加 1mg/kg 以上で泥状 / 液状便の頻度増加がみられた 薬理学的作用機序の結果として 1mg/kg 以上で全身血圧の低下 及び心拍数増加が認められた 1mg/kg 以上を投与した動物にわずかな QTc 延長が認められた 安全性薬理試験 ( 参照 ) において心血管系の安全性リスクを示す徴候がなかったことを考慮すると この結果は QT 間隔に対する直接的影響というよりも Bazett や Fridericia の公式による不十分な心拍数補正によるものと考えられる 病理組織学的検査では 副腎の重量増加 (1mg/kg 以上 ) を伴う球状帯の肥大が 0.3mg/kg 以上で認められた 以上の結果より イヌに 26 週間投与したときの無毒性量は 一般状態所見に基づき雌雄共に 0.3mg/kg/ 日と判断された 0.3mg/kg 以上でみられた副腎球状帯肥大はリオシグアトの血行動態作用によるものと考え 毒性所見とは考えなかった トキシコキネティクスデータを表 に要約する

25 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 25 of 83 表 イヌ 26 週間経口投与試験におけるリオシグアトの定常状態での曝露量 ( 第 25 週 ) Sex Males Females Dose [mg/kg/d] AUC(0-24) [ g h/l] AUC(0-24)norm [kg h/l] Cmax [ g/l] Cmax,norm [kg/l] C(24)/Cmax [%] n.c tmax [h] RA1 [%] RA3 [%] MR [%] RA1 = Cmax, Week 25 / Cmax, Day 1 RA3 = AUC(0-24), Week 25 / AUC(0-24), Day 1 MR = metabolic ratio of BAY AUC(0-24)norm / riociguat AUC(0-24)norm Source: , PH イヌ 52 週間経口投与試験 参照項目 : A45725 強制経口投与による 52 週間反復投与毒性試験を 10 ヵ月齢 ( 試験開始時 ) のビーグル犬 ( 系統 :Bor:BEAG) 雌雄各 16 例 (1 群雌雄各 4 例 ) を用いて実施した 動物は対照群 ( 媒体投与 ) 及び 3 薬物投与群に無作為に配置した リオシグアト ( バッチ ) は 0.5%Tylose 水溶液に懸濁し 及び 3mg/kg/ 日の用量を 投与容量 5mL/kg で 52 週間投与した 投与量はイヌ26 週間投与試験 ( 参照 ) の結果に基づいて選択した 一般状態観察及び摂餌量測定を毎日実施した 体重を試験期間中定期的に測定した トキシコキネティクス評価を投与 及び 31 日目 26 週及び 50 週目に実施し それぞれ投与後 及び 24 時間に採血した 臨床検査 ( 血液学的検査 血液化学的検査及び尿検査 ) 眼科学的検査及び反射検査を 投与開始前及び試験期間中に 5~6 回 各群全例について実施した 心血管機能の評価のために 心電図及び観血式血圧測定を投与開始前及び投与期間中 5 回 それぞれ投与前及び投与 2 時間後に実施した 投与期間終了時に生存動物を屠殺し 剖検及び臓器重量測定を実施した 摘出した臓器 組織を適切な方法で固定後 病理組織学的検査を実施した 3mg/kg を投与した動物で 投与 1 日から 9 日にかけて著しい摂餌量減少 体重減少及び筋振戦が認められた そのため 3mg/kg の投与を試験 10 日目から中止した 試験 24 日目から 1mg/kg で再開し 試験 31 日目以降投与期間終了時まで 2mg/kg を投与した 1mg/kg 以上で流涎 嘔吐 下痢及びるいそうの発現頻度の増加が認められた 更に 高用量 (2mg/kg) 群に無関心 運動抑制 振戦などの一般状態の変化に加え 一過性の脱水及び摂餌量減少が認められた 眼科学的検査において 高用量群の雌雄各 1 例に結膜炎がみられたが いずれも片側の所見であり 薬物投与に関係しない偶発的なものと考えられた

26 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 26 of 83 高用量群の雄 1 例が全身状態の悪化 下痢 ( 投与期間を通じて継続 ) 摂餌量減少及び体重減少を示し 279 日に死亡した 病理組織学的検査により 種々の臓器のうっ血 肺水腫 僧房弁の浮腫に加え 軽度な急性心筋変性が認められた 慢性的な心筋の変化が認められなかったことを考慮すると この変化は全身状態悪化や死亡の原因というよりも死戦期の苦悶により生じたものと考えられた 2mg/kg 群において血中 T3 の有意な低下が投与 13 週目にみられ それ以降 投与期間を通じて低値傾向が認められたが 血中 TSH 並びに甲状腺組織に関連付けられる変化を伴っていなかったことから 毒性性学的意義に乏しいものと考えられた 心臓に対する安全性を評価するために心毒性の指標となるトロポニン T を測定したところ 変化は認められなかった 短期試験と同様に リオシグアトの薬理学的作用機序に基づく血圧低下及び代償性の心拍数増加並びに副腎重量増加が 0.3mg/kg 以上で認められた その他 リオシグアトの血管拡張作用により二次的に生じたと考えられる心筋の動脈の軽微な中膜肥厚が薬物投与群の動物に散見された 以上の結果より イヌに 52 週間投与したときの無毒性量は 一般状態所見に基づき雌雄共に 0.3mg/kg/ 日と判断された トキシコキネティクスデータを表 に要約する 表 イヌ 52 週間経口投与試験におけるリオシグアトの定常状態での曝露量 ( 第 50 週 ) Sex Males Females Dose [mg/kg/d] AUC(0-24) [ g h/l] AUC(0-24)norm [kg h/l] Cmax [ g/l] Cmax,norm [kg/l] C(24)/Cmax [%] tmax [h] RA1 [%] a a RA3 [%] a a MR [%] RA1 = Cmax, Week 50 / Cmax,Day 1 RA3 = AUC(0-24), Week 50 / AUC(0-24), Day 1 a Compared to Day 31 MR = metabolic ratio of BAY AUC(0-24)norm / riociguat AUC(0-24)norm Source: , A45725

27 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 27 of 遺伝毒性試験 リオシグアトについて標準的な一連の遺伝毒性試験を行った In vitro 試験として Ames 試験及びほ乳類細胞 (V79 細胞 ) を用いる染色体異常試験 in vivo 試験として小核試験及び染色体異常試験を実施した 被験物質にはリオシグアトの主要な不純物を含むバッチを使用した In vitro サルモネラ / ミクロソーム試験 (Ames 試験 ) 参照項目 : PH リオシグアト ( バッチ ) について サルモネラ / ミクロソーム試験 (Ames 試験 ) を実施し 点突然変異誘発性を評価した ヒスチジン要求株である 5 種類のネズミチフス菌 LT2 株 (TA1535 TA100 TA1537 TA98 及び TA102) を用い 5000μg/ プレートまでの濃度により 代謝活性化系 ( ラット肝ミクロソーム S9-mix) の非存在下及び存在下でプレート法及びプレインキュベーション法により試験を実施した 1581μg/ プレート以上の濃度で弱い抗菌性が また 5000μg/ プレートでわずかに析出が認められた しかしながら いずれも軽微であり 最高濃度まで評価は可能であった 陰性対照と比較して リオシグアトによる生物学的に意味のある突然変異コロニー数の増加は 代謝活性化の有無にかかわらず認められなかった 一方 陽性対照物質では突然変異コロニー数の増加がみられ 試験系の感受性に問題のないことが確認された 以上の結果から リオシグアトはサルモネラ / ミクロソーム試験のプレート法並びにプレインキュベーション法ともに S9-mix の有無によらず変異原性を示さないと考えられる チャイニーズハムスター V79 細胞を用いる染色体異常試験 (in vitro) 参照項目 : PH チャイニーズハムスター V79 細胞を用いる in vitro 染色体異常試験を実施し リオシグアトの染色体異常誘発性を評価した 代謝活性化系 ( ラット肝ミクロソーム S9-mix) の非存在下及び存在下でチャイニーズハムスター V79 細胞を 450μg/mL までの濃度のリオシグアト ( バッチ ) により 4 時間処理した 曝露開始後 18 時間又は 30 時間に細胞を回収した また 代謝活性化系の非存在下で細胞を 60μg/mL までの濃度で 18 時間処理した後に回収した 最高濃度は細胞毒性に基づいて選択した リオシグアトで処理した細胞はいずれの濃度においても 陰性対照と比較して 代謝活性化系の非存在下及び存在下共に 染色体異常を有する分裂中期細胞の生物学的及び統計学的に有意な増加を示さなかった 陽性対照物質は染色体異常を誘発し 試験系の感受性及び S9-mix の活性に問題のないことが確認された 以上の結果から リオシグアトはほ乳類細胞に対して in vitro で染色体異常を誘発しないと考えられる

28 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 28 of In vivo マウス小核試験 参照項目 : PH PH 雄マウス ( 系統 :Hsd/WIN: NMRI) を用いて 骨髄赤芽球の染色体に対するリオシグアトの染色体異常誘発性を評価するために in vivo 小核試験 (PH-33313) を実施した 0.5%Cremophor で調製したリオシグアト ( バッチ ) をマウスに 24 時間間隔で 2 回腹腔内投与した マウスは 2 回目投与の 24 時間後に屠殺した 既知の染色体異常誘発物質であり細胞増殖抑制剤であるシクロホスファミドを陽性対照として使用した 大腿骨骨髄を採取して顕微鏡下で観察した 多染性赤血球 2000 個当たりの小核の発現頻度及び多染性赤血球 2000 個当たりの正染性赤血球の比率を動物ごとに測定した 及び 800mg/kg の用量でリオシグアトの評価を行った パイロット試験 (PH Section 4.3 参照 ) における 1000mg/kg での臨床症状及び死亡率 並びに本試験の 800mg/kg での多染性赤血球数と正染性赤血球数の比から被験物質の全身曝露が確認された 200mg/kg 以上の多染性赤血球における小核の出現率に用量依存性のない軽度な増加がみられたが 背景データの範囲内にあった この結果の再現性を確認するために 2 回目の試験を 及び 400mg/kg の用量で実施したところ 小核の出現頻度の増加は認められなかった 陽性対照シクロホスファミドは明らかに陽性結果を示した したがって リオシグアトは in vivo で染色体異常誘発性はないと考えられる 更に 小核試験のデザインを模した独立したトキシコキネティクス試験 (PH-33557) により全身曝露を確認した その結果を表 に要約する 表 雄マウスを用いた小核試験におけるリオシグアトの曝露量 Dose [mg/kg] AUC (0-24) [ g h/l] AUC (0-24) norm [kg h/l] C max [ g/l] C max, norm [kg/l] Source: , PH マウス骨髄細胞染色体異常試験 参照項目 : PH In vivo 小核試験 ( 参照 ) の評価結果を裏付けるために 雄マウス ( 系統 : Hsd/WIN: NMRI) を用いた in vivo 染色体異常試験を実施した リオシグアトの投与量は 及び 800mg/kg とした 小核試験と同様に リオシグアト ( バッチ ) を 0.5% Cremophor にて調製し 24 時間間隔で計 2 回腹腔内投与した シクロホスファミドを陽性対照として使用した 骨髄標本は最終投与後 24 時間で作製し 800mg/kg では最終投与後 48 時間にも作製した 200mg/kg 以上でみられた臨床症状及び有糸分裂指数の低下から 被験物質の全身曝露が確認された 染色体の評価において 指標とした染色体異常 ( ギャップを含む又は含まない染色体異常を有する分裂中期細胞 及び交換を有する分裂中期細胞 ) の発現率に関してリオシ

29 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 29 of 83 グアト投与群と陰性対照群との間に差は認められなかった シクロホスファミドは明らかな染色体異常陽性を示した 以上の結果より リオシグアトはマウスを用いた in vivo 骨髄染色体異常試験において染色体異常誘発性を示さなかった がん原性試験 ( トキシコキネティクス評価を含む ) マウス及びラットを用いて混餌投与によるリオシグアトの 2 年間がん原性試験を実施した 用量はマウス及びラットを用いた 13 週間用量設定試験に基づいて選択した 用量選択については 特別プロトコル査定 (special protocol assessment) において米国 FDA と合意された マウスがん原性試験 参照項目 : PH 約 7 週齢 ( 試験開始時 ) のマウス 系統 :Crl:CD-1(ICR)BR を用いた 2 年間がん原性試験を実施した 1 群雌雄各 50 例のマウスを対照群及び 3 薬物投与群に無作為に配置した 更に 1 群雌雄各 20 例を追加し トキシコキネティクス評価用及び血液学的検査用のサテライト群とした トキシコキネティクス評価は投与 3/4 日目及び約 1 年後にそれぞれ動態プロファイルを得るため また試験終了時に推定 t max での血漿曝露量を得るために実施した リオシグアト ( バッチ及び ) の混餌投与量は 及び 200ppm とした この濃度での 1 日当たりの投与量は 雄で 及び 24.9mg/kg 雌で 及び 32.5mg/kg に相当した 高用量は マウス 13 週間用量設定試験 ( 及び 参照 ) における最大耐量に基づいて選択した 13 週間用量設定試験では 急峻な用量反応性を示し 400ppm では死亡がみられたのに対し 200ppm では全般に忍容性は良好で 消化管に軽微な影響が認められたのみであった 一般状態観察を 1 日 2 回実施し 体重 摂餌量及び摂水量を試験期間中定期的に測定した 血液学的検査を投与約 及び 24 ヵ月間目に実施した 試験期間中の途中死亡又は切迫屠殺した動物並びに試験終了時まで生存した動物について剖検及び臓器重量測定を実施した 摘出した臓器 組織を固定後 主試験群の全例の臓器 組織について病理組織学的検査を実施した 腫瘍性病変の統計解析は 生存率で補正した漸近的な傾向検定により実施した 1),2),3),4) 多重検定による偽陽性過誤を制御するために よくみられる腫瘍 ( 背景データで 1% 以上の発現率 ) には有意水準を p<0.005 とし 稀な腫瘍 (1% 未満 ) には有意水準を p<0.025 とした 4),5),6),7) 更に 片側 Fisher 直接確率検定 ( 対照群と薬物投与群との間の対比較 ) を よくみられる腫瘍には有意水準 p<0.01 稀な腫瘍には有意水準 p<0.05 で実施した 4),5) 非腫瘍性病変に対しては生存率補正をしない傾向検定 8) 及び薬物投与群と対照群の間の対比較により解析した 主試験群において 雄で総計 200 例中 108 例 雌で 200 例中 124 例の途中死亡例又は切迫屠殺例がみられた 主試験群雄の死亡率増加が 200ppm で認められたが サテライト群の雌雄及び主試験群の雌では死亡率の増加は認められなかった ( 表 ) 以降に詳述するように 高用量の雄の死亡率増加は投与に関連して増加した大腸の炎症性変化に起因したものと考えられる 投与に関連のない途中死亡例の主な死因は この系統のマウスに一般的な背景疾患である全身性アミロイド症及びリンパ細網系の全身性腫瘍であった

30 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 30 of 83 表 マウスがん原性試験における途中死亡例 ( 切迫屠殺例を含む ) Males Females Dose [ ppm] Main groups (n= 50) Satellite groups (n= 20) Overall mortality (n = 70) Source: , PH 一般状態観察では すべての薬物投与群の雌雄に腹囲増加が認められた 更に 高用量の雄で立毛及びしゃがみ姿勢 雌雄に蒼白の発現頻度の増加が認められた 剖検では 高用量の動物に盲腸の拡張及び腸壁の肥厚の発現頻度が増加した 肺では 200ppm の雌雄で結節の発現頻度が低下した すべての薬物投与群の雌で腎臓表面の変化の発現頻度が減少した 更に 100ppm 以上の雌で子宮の硬度変化を示す例が減少した 雄では 200ppm で精嚢腺の肥大及び変色の発現頻度が低かった 高用量の雄で肝臓結節の発現頻度が低下したが 中用量以上の雌では増加した 200ppm の雌に肝臓の変色斑 胆嚢拡張及び体腔内体液貯留が比較的高頻度に認められた 病理組織学的検査では 100ppm 以上で盲腸の慢性炎症 びらん / 潰瘍 粘膜過形成及び憩室形成が 対照群に比し高頻度及び強い程度で認められ 粘膜過形成は軽度ながら結腸及び直腸にも認められた 大腸の炎症に対する二次的及び反応性の変化として 大腸におけるリンパ組織過形成 ( 雄 :200ppm 雌 :100ppm 以上 ) 腸間膜リンパ節の高い細胞充実性又は過形成 ( 雄 : 200ppm) 並びに肝臓のクッパー細胞活性化 ( マクロファージの泡沫化 / 肥大 )( 雄 :200ppm 雌 :100ppm 以上 ) が認められた 炎症に関連した出血に対する二次的な所見と考えられる腸間膜リンパ節内の軽度な充血及び赤血球貪食 ( 雌 :200ppm) 並びに脾臓の髄外造血の増加 ( 雌雄 :200ppm) が認められた 腫瘍性病変に関して 病理組織学的に盲腸及び結腸に腫瘍発生数の増加が認められた 100ppm の雌 2 例及び 200ppm の雄 1 例が腺癌と診断された 200ppm の雄 1 例が腺腫と診断された 上述した大腸の炎症及び粘膜過形成の頻度増加 またマウスでは背景的に腸の腫瘍発生頻度は低いことを考慮すると 傾向検定及び対比較で統計学的有意性を欠くものの これらの腫瘍は投与に関連したものと考えられた 他のすべてのタイプの腫瘍は発現頻度に用量との関連がみられないか 高用量で発現頻度が低かった また これらのタイプの腫瘍発現頻度には 上述した生存率補正した傾向検定 1,)2) で統計学的に有意な差はみられなかった トキシコキネティクスデータを表 に要約する

31 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 31 of 83 表 マウスがん原性試験におけるリオシグアトの定常状態での曝露量 ( 投与 53 週 ) Males Females Dose [ ppm] Dose [mg/kg] AUC(0-24) [ g h/l] AUC(0-24) norm [kg h/l] Cmax [ g/l] Cmax, norm [kg/l] Cmin/Cmax [%] tmax [h] RA1 [%] RA3 [%] MR [%] RA1 = Cmax, Week 53 / Cmax,Day 3 RA3 = AUC(0-24), Week 53 / AUC(0-24), Day 3 MR = metabolic ratio of BAY AUC(0-24)norm / riociguat AUC(0-24)norm Source: , PH ラットがん原性試験 参照項目 : PH 約 7 週齢 ( 試験開始時 ) のラット 系統 :Wistar (Hsd Cpb:WU) を用いた 2 年間がん原性試験を実施した 1 群雌雄各 50 例のラットを対照群及び 3 薬物投与群に無作為に配置した 更に 1 群雌雄各 15 例を追加し トキシコキネティクス評価用及び臨床検査用のサテライト群とした トキシコキネティクス評価は投与 2 日目及び約 1 年後にそれぞれ動態プロファイルを得るために また試験終了時に推定 t max での血漿曝露量を得るために実施した リオシグアト ( バッチ及び ) は投与量が 及び 20mg/kg になるように混餌投与した 飼料中濃度を定期的に調整し 実際の 1 日当たりの投与量は 雄で 及び 20.3mg/kg 雌で 及び 20.0mg/kg であった 高用量はラット 13 週間用量設定試験 ( 参照 ) の結果に基づいて選択した この試験では 20mg/kg を投与した雄で 8% の体重増加抑制 (ICH S1c ガイダンスにおける最大耐量の基準に合致 ) が認められた 雌では 20mg/kg 以上の用量で顕著な骨リモデリング及び胆管活性化が認められた 以上より 20mg/kg が最大耐量と判断され この用量を本がん原性試験における高用量として選択した 一般状態観察を 1 日 2 回実施し 体重 摂餌量及び摂水量測定を試験期間中定期的に実施した 臨床検査を投与約 及び 24 ヵ月目に実施した 試験期間中の途中死亡又は切迫屠殺した動物並びに試験終了時まで生存した動物について剖検及び臓器重量測定を実施した 摘出した臓器 組織を固定後 主試験群の全例の臓器 組織について病理組織学的検査を実施した 中用量以上の雄では死亡率が高く これらの群では自己融解を呈する動物が多数認められた このため 病理組織学的検査で予定動物数 50 例を確保するために サテライト群の動物を病理組織学的検査用に追加した 統計学的解析はマウス試験と同じ手法及び有意水準で実施した 主試験群において 10mg/kg 以上の雄で途中死亡例が増加した 主試験群の雌の途中死亡例数は対照群に比し薬物投与群で低値を示した サテライト群の死亡例数はほぼ均一に分布していた ( 表 ) 剖検及び病理組織学的検査では薬物投与に特異的な死因を示唆する所見は

32 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 32 of 83 認められなかった また 雌のリオシグアト曝露量は雄より高値であった これらより 雄における高死亡率の意味については不明である 表 ラットがん原性試験における途中死亡例 ( 切迫屠殺例を含む ) Males Females Dose [mg/kg] Main groups (n=50) Satellite groups (n=15) Overall mortality (n = 65) Source: , PH 一般状態観察では 10mg/kg 以上の雄にるいそう及び呼吸亢進が高頻度に認められた 更に 5mg/kg 以上の雄に摂水量の軽度増加が観察された この所見は雄にみられた尿排泄量の増加と一致していた 雄の体重に影響はみられなかったが 雌では 10mg/kg 以上で軽度の体重増加抑制が認められた この変化は 用量依存性を欠くものの雌に認められた摂餌量の軽度な減少に関連したものと考えられた 血液学的検査では すべての薬物投与群の雌で赤血球数 ヘモグロビン濃度及びヘマトクリット値の増加が認められた 用量相関性を欠くこと 及び所見が一方の性に限定されていたことを考慮すると 毒性学的意義はないものと推察される すべての薬物投与群の雄及び 10mg/kg 以上の雌に認められた血中クレアチニン濃度の一過性の軽度な低下は毒性変化とは考えられなかった 剖検では 20mg/kg の雄及び 10mg/kg 以上の雌に心臓肥大の頻度増加が認められた 20mg/kg の雄に副腎肥大が高頻度に観察された 10mg/kg 以上の雌雄で腸管の硬度変化及び拡張 ( 雄のみ ) の発現頻度が増加した すべての薬物投与群の雄に腎臓肥大が認められた 更に 10 及び 20mg/kg の雄では 死亡動物によくみられるような状態の悪化や放血していないことに関連した所見の頻度増加がみられた 10mg/kg 以上の雄及び 20mg/kg の雌に肝臓相対重量の増加が認められた 雄では すべての用量で腎臓及び精巣の相対重量増加が認められた また 20mg/kg の雌で卵巣重量の増加がみられた 病理組織学的には 剖検でみられた心臓肥大に関連して 心臓拡張 うっ血又は心房血栓が認められたが これらの変化は死亡動物によくみられる非特異的所見であることが知られている 傾向検定において 雄に心筋症 (P= ) 及び心血管障害 (P= ) の正の傾向が認められた 一方 雌では 5mg/kg 以上の心筋症の発現頻度は対照群に比し低値を示した 雌雄を総合すると ( 途中死亡例と生存例を含む ) この傾向は確認されなかった したがって これらの所見の毒性学的意義は不明であった 5mg/kg 以上の雄及び 20mg/kg の雌で腸間膜静脈の網状変化の頻度が有意に高かった この変化は 主試験群の雌雄共に有意な正の傾向を示した (P < ) 更に 20mg/kg の雄では腸間膜リンパ節における赤血球貪食の頻度が有意に高く 傾向検定で統計学的に有意であった ( 雄で P= 雌で P= ) 肝臓において 20mg/kg の雄で胆管嚢胞が有意に増加した (P= )

33 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 33 of 83 他の非腫瘍性変化はすべての各用量に一様に分布していたか 対照群との差がみられないか この系統の動物で知られている頻度 又はこの系統の動物を用いてこれまでに実施した試験において確認されたような発現頻度で生じていた 腫瘍性変化の病理組織学的評価では 腫瘍を有する動物数 又は複数の腫瘍を有する動物数の増加は認められず また 良性及び悪性の腫瘍はすべての群に同様に分布していた 精巣において 良性のライディッヒ細胞腫の頻度増加が薬物投与群に認められた (0/2/4/3) 用量との関係を欠くこと 前駆病変 ( ライディッヒ細胞の過形成 ) の増加がないこと 統計学的有意差を欠くこと 及び発現頻度が背景データ内にあることを考慮すると この増加は偶発的なものと考えられる 副腎皮質過形成が雄で統計学的に有意な負の傾向を示し 低用量以上の雄及び高用量の雌におけるこの所見の発現頻度は対照群に比し有意に低かった 雄において 甲状腺のびまん性 C 細胞過形成及び副甲状腺のびまん性過形成の有意な正の傾向が認められた 両器官共に これに関連する腫瘍病変は観察されなかった これらの変化の程度は全般的に軽微から軽度であること 片性に限定していること 及びこれらの変化は加齢ラットにおける自然発生所見として知られていることを勘案すると これらは偶発的なもので毒性学的意義はないと考えられる 他の腫瘍性又は前腫瘍性病変はすべて 統計学的に有意な正の傾向を示さないか また対照群と比較して統計学的に有意な又は生物学的に意義のある増加を示さなかった 以上の結果より ラットを用い 20mg/kg/ 日までの用量を投与した 2 年間がん原性試験において 最高用量までリオシグアトのがん原性を示す所見は認められなかった 投与に関連した非腫瘍性変化はリオシグアトの薬理学的作用機序に関連したものと考えられる トキシコキネティクスデータを表 に要約する 表 ラットがん原性試験におけるリオシグアトの定常状態での曝露量 ( 投与 373/374 日目 ) Males Females Dose [mg/kg] AUC(0-24) [ g h/l] AUC(0-24)norm [kg h/l] Cmax [ g/l] Cmax, norm [kg/l] Cmin/Cmax [%] tmax [h] RA1 [%] RA3 [%] MR [%] RA1 = Cmax, Day 373 / Cmax, Day 2 RA3 = AUC(0-24), Day 373 / AUC(0-24), Day 2 MR = metabolic ratio of BAY AUC(0-24)norm / riociguat AUC(0-24)norm Source: , PH-36817

34 2.6.6 毒性試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 34 of 生殖発生毒性試験 ( 用量設定試験及びトキシコキネティクス評価を含む ) ラット受胎能及び初期胚発生に関する試験 参照項目 : PH ラット 系統 :Wistar (Hsd Cpb:WU) を用い 受胎能及び初期胚発生に関する試験を実施した 1 群雌雄各 24 例のラットを対照群及び 3 薬物投与群に無作為に配置した 投与量は 及び 30mg/kg/ 日とし 0.5%Tylopur 水溶液に懸濁したリオシグアト ( バッチ ) を投与容量 10mL/kg で強制経口投与した 用量はラット 4 週間反復経口投与毒性試験 ( 参照 ) に基づいて選択した 雄ラットには 交配前 4 週間及びその後の交配期間中 ( 剖検時まで ) にわたり投与した 雌ラットには 交配前 2 週間及びその後の交配期間中と妊娠 ( 交尾後 ) 7 日まで投与した 妊娠 14 及び 16 日目に帝王切開を実施した 全身忍容性に関する検査 並びに受胎能及び初期胚発生に関する検査を実施した 投与に関連した死亡例は認められなかった 30mg/kg の雄 1 例が死亡したが 投与過誤によるものであった 一般状態観察では 3mg/kg 以上の雌雄に耳介の発赤が認められ 10mg/kg 以上の雌雄に一過性の立毛が認められた また 10mg/kg 以上の雄及び 30mg/kg の雌に流涎が認められた 10mg/kg 以上の雄に一過性の体重増加抑制が認められ 結果として 30mg/kg の雄で最終体重が軽度に減少した 30mg/kg の雌においても投与開始後一過性の体重減少が認められた 30mg/kg の雌雄で摂餌量が投与 1 週に減少したが その後増加に転じた 10mg/kg 以上の雌雄に尿量増加を伴う摂水量の増加が認められた 30mg/kg で精巣の絶対重量が軽度に減少したが 相対重量には影響はみられなかった 30mg/kg の雄で授精までの期間が延長した この影響はリオシグアトの血管拡張 降圧作用に伴う全身状態悪化による二次的なもので 雄受胎能に対する直接的な影響ではないと考えられる 雌の生殖パラメータ ( 卵巣重量 受精率 受胎率 妊娠率 性周期の頻度及び規則性 受精までの期間 黄体数 着床数 着床前死亡数 着床後死亡数及び生存胚数 ) に 30mg/kg までリオシグアトの影響はみられなかった 本試験では ラット 4 週間反復投与試験 ( 参照 ) とほぼ同じ範囲の用量を投与したことから この試験ではトキシコキネティクス評価を実施しなかった 曝露量データについては表 を参照のこと 本試験条件下で 全身忍容性に関する無毒性量は 体重への影響に基づき雄で 3mg/kg/ 日 雌で 10mg/kg と判断された 雄受胎能に関する無毒性量は 授精までの期間が延長したことから 10mg/kg/ 日であった 雌受胎能及び初期胚発生には最高用量の 30mg/kg/ 日まで影響はなかった ラット胚 胎児発生に関する試験 参照項目 : PH ラット 系統 :Wistar (Hsd Cpb:WU) を用いて胚 胎児発生毒性試験を実施した リオシグアト ( バッチ ) を 0.5%Tylose 水溶液に懸濁し 及び 25mg/kg の用量を妊娠 6 ~17 日に 1 日 1 回強制経口投与した 投与容量は 10mL/kg とした 用量はラットを用いたパイロット試験に基づいて選択した パイロット試験 (PH Annex 9, p 参照 ) において 25mg/kg で母体毒性 ( 体重増加抑制 ) 及び胎児毒性 ( 胎児体重軽度減少 着床後死亡軽度増加 ) が認められたことより 最高用量を 25mg/kg とした 1 群当たり妊娠ラット各 22 例を対照