独立栄養的炭酸固定代謝から紐解く古(いにしえ)

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よしたかみねむら
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1 炭素の循環と微生物の機能

3 既存の固定系の種類と特徴糖代謝を基盤 : カルビンベンソンサイクル無機化合物代謝を基盤 : アセチル -CoA 経路有機酸代謝を基盤 : Reductive TCA cycle Dicarboxylate/4-Hydroxybutyrate cycle 3-Hydroxypropionate/4-Hydroxybutyrate cycle 3-Hydroxypropionate cycle

4 耐酸素性 : 高

5 耐酸素性 : 低

6 Reductive TCA cycle 耐酸素性 : 低 POR OGOR

7 Dicarboxylate/4-Hydroxybutyrate cycle Similar to 3-HP/4-HB cycle POR 耐酸素性 : 低 Similar to rtca cycle 2CO 2 + CoA Acetyl-CoA 3ATP + 8[H] PNAS 105, 7851 (2008)

8 3-Hydroxypropionate/4-Hydroxybutyrate cycle 耐酸素性 : 高 Similar to DC/4-HB cycle Similar to 3-HP cycle 2CO 2 + CoA Acetyl-CoA 4ATP + 8[H] Science 318, 1782 (2007)

9 3-Hydroxypropionate cycle 耐酸素性 : 高 Bifunctional PNAS 106, (2009)

10 3-Hydroxypropionate サイクル Bifunctional Trifunctional アセチル CoA からプロピオニル CoA まで Trifunctional アセチル CoA マロニル CoA マロン酸セミアルデヒド 3- ヒドロキシプロピオン酸 3- ヒドロキシプロピオニル CoA アクリロイル CoA プロピオニル CoA PNAS 106, (2009)

11 J. Exp. Bot. 63, 2342 (2012)

12 The shortest possible carbon fixation cycle 耐酸素性 : 低 OGOR 2CO 2 Glyoxylate (ATP + 4[H]) PNAS 107, 8889 (2010)

13 C4-Glyoxylate cycle (I) 耐酸素性 : 高 2CO 2 Glyoxylate (3ATP + 4[H]) PNAS 107, 8889 (2010)

14 2CO 2 Glyoxylate (3ATP + 4[H]) C4-Glyoxylate cycle (II) 耐酸素性 : 高 PNAS 107, 8889 (2010)

15 好熱性水素細菌 Hydrogenobacter thermophilus 70 で生育するバクテリア ( グラム陰性菌 ) Chemolithoautotroph エネルギー源 :H 2, チオ硫酸最終電子受容体 :O 2 (40% まで ), NO 3-, Fe 3+, S 炭素源 :CO 2 ( 絶対独立栄養性 ) 特異な代謝系菌体構成成分メチオナキノンアミノリン脂質還元的 TCA サイクル窒素代謝進化系統的特徴古い起源 (16S rrna 遺伝子による系統解析 ) ゲノム情報

18 古細菌から見て, 一番最初に分岐する細菌は Aquificales グループである

19 No Pyruvate kinase! 絶対独立栄養性の分子基盤 No Phosphofructokinase!

20 Reductive TCA cycle 耐酸素性 : 低 POR OGOR

21 POR (OGOR) 反応

22 POR の炭酸固定反応 (1/2) Minus Acetyl-CoA Fd1 Complete Minus Acetyl-CoA Minus CO 2 Complete Fd2 Minus CoA FEBS J. 277, (2010)

23 POR の炭酸固定反応 (2/2) 炭酸固定方向脱炭酸方向 Fd Fd (U/mg protein) FEBS J. 277, (2010)

24 EPR スペクトル解析 As purified + Dithionite + Pyruvate + Pyruvate + CoA + Fd1 + OGOR + 2-OG + CoA + Fd1 + OGOR + 2-OG + CoA + Acetyl-CoA FEBS J. 277, 501 (2010)

25 POR 推定反応機構 FEBS J. 277, 501 (2010)

26 OGOR 炭酸固定反応 (1/2)

27 OGOR 炭酸固定反応 (2/2) Minus KOR Complete KOR での測定例 Extremophiles 14, (2010)

OGOR expression B A kor 2-subunit-type OGOR (KOR) D A B for G E 5-subunit-type OGOR (FOR) a Aerobic Anaerobic Aerobic Anaerobic 24 36 48 72 24 36 48 72 24 36 48 72 24 36 48

28 OGOR expression B A kor 2-subunit-type OGOR (KOR) D A B for G E 5-subunit-type OGOR (FOR) a Aerobic Anaerobic Aerobic Anaerobic (hr) Western blotting b a b d g Porg FOR is expressed only under aerobic condition. KOR is expressed under both aerobic and anaerobic conditions. BBRC, 312, (2003)

30 CO 2 -dependent expression of the two OGOR genes Tiling array signal CO 2 (15%) CO 2 (0.25%) B kor A D A B G E for Expression of the kor genes is regulated by CO 2.

31 フマル酸還元酵素フマル酸還元酵素のサブユニット数が多いことさらにはモチーフが多いことは生物がとにかくフマル酸を代謝しようと喘いでいた歴史を刻んでいるのでは!?

32 窒素代謝 Carbon assimilation Nitrogen assimilation Acetyl-CoA CO 2 Fd red Fd ox Pyruvate POR Gluconeogenesis CO 2 Citryl-CoA Oxaloacetate Malate Fumarate Citrate Succinate Isocitrate Oxalosuccinate - GS NH 3 NO 3 Gln Glu?? CO 2 2-Oxoglutarate Glu Fd ox Fd red Fd ox Fd red CO 2 Succinyl-CoA OGOR GOGAT NIR NO 2 - NAS Amino acids 硝酸呼吸が可能 GS-GOGAT 系が機能硝酸取り込みは?

33 Nitrogen assimilation ~Enzymes & Reductants~ NO 3 - NAS (Nitrate reductase) 2e - NIR (Nitrite reductase) 6e - NO 2 - NH kb nasb nasa (nitrate/nitrite transporter) nirb H. thermophilus genome

34 Purification & characterization of NAS Ferredoxin is utilized as a reductant. NAD(P)H is not utilized as a reductant. N-terminal amino acid sequencing revealed NAS is a translation product of nasb.

35 Physiological role of NAS NAS disruptant NAS is essential for NO 3 - assimilation under aerobic condition. NAS is not involved in nitrate respiration.

36 好熱性水素細菌 Hydrogenobacter thermophilus 70 で生育するバクテリア ( グラム陰性菌 ) Chemolithoautotroph エネルギー源 :H 2, チオ硫酸最終電子受容体 :O 2 (40% まで ), NO 3-, Fe 3+, S 炭素源 :CO 2 ( 絶対独立栄養性 ) 特異な代謝系菌体構成成分還元的 TCA サイクル窒素代謝メチオナキノンアミノリン脂質進化系統的特徴古い起源 (16S rrna 遺伝子による系統解析 ) ゲノム情報

37 Hydrogenobacter thermophilus TK-6 電子供与体エネルギー代謝還元力 :e - 伊豆の峰温泉から単離好熱性 ( 生育至適温度 :70 ) 好気的に生育可能 (40%O 2 ) 絶対独立栄養性電子供与体 : 水素チオ硫酸電子受容体 : 酸素硝酸炭素源 : 二酸化炭素呼吸炭酸固定 ( 還元的 TCA cycle) [ 活性 ] 酸素防御システムなど

38 H. thermophilus TK-6 のヒドロゲナーゼ Expression level Localization Mutant Characteristics Hox 高発現膜近傍の Cytoplasm 15% 以上の酸素濃度で生育不能 Hup1 高発現膜結合嫌気条件で生育遅い Hup2 低発現 Cytoplasm - Hyn 低発現膜結合微好気条件で生育遅い H2 2H + Periplasm 推定局在性 Hup1 Hyn Hydrogenase Cytoplasm 還元力 :2e - Hox Hup2

39 方法経時的に OD 測定気体を 20 ml サンプリングガスクロマトグラフィーによって H 2, O 2 の消費を追跡 ( カラム : Molecular Sieve 5A) 100 ml vial を使用気相条件 70ºC 気相 H 2, CO 2, O 2, N 2 培地 (10 ml) + 菌体 (OD 540 =0.1) 菌体 O 2 CO 2 H 2 N 2 WT Δhox 単位 : % (v/ v)

40 % % WT 5 %O 2 におけるガス消費酸素消費水素消費 OD 540 nm OD O OD 540 nm OD H Time (hour) Time (hour) (5%) 消費酸素 / 消費水素 0.41

41 OD540nm % OD540nm % WT 10 %O 2 におけるガス消費酸素消費水素消費 OD540 O2 % OD540 H2 % Time (hour) Time (hour) (5%) 消費酸素 / 消費水素 0.41 (10%) 消費酸素 / 消費水素 0.27

42 OD540nm % OD540nm % WT 15 %O 2 におけるガス消費酸素消費水素消費 OD O2 % 5 OD540 H2 % Time (hour) Time (hour) (5%) 消費酸素 / 消費水素 0.41 (10%) 消費酸素 / 消費水素 0.27 (15%) 消費酸素 / 消費水素 0.20 酸化ストレスへのエネルギー ( 水素 ) 代謝による対応

43 ガス消費まとめ (1/2) 水素エネルギー代謝還元力 :e - 酸素酸化ストレスへのエネルギー ( 水素 ) 代謝による対応 (5%) 消費酸素 / 消費水素 0.41 (10%) 消費酸素 / 消費水素 0.27 (15%) 消費酸素 / 消費水素 0.20 炭酸固定 ( 還元的 TCA cycle) [ 活性 ] 酸素防御システムなど

44 ガス消費まとめ (2/2) OD/ 酸素消費量 OD/ 水素消費量 5% % % 初期酸素濃度が高いほどガス消費量あたりの菌体量が小さい還元的 TCA cycle を機能させるため酸素濃度を下げる働き?

45 % % Δhox 10 %O 2 におけるガス消費酸素消費水素消費 OD 540nm OD540 O2% OD 540nm OD540 H2% Time (hour) Time (hour) (10%) 消費酸素 / 消費水素 0.15 Δhox は WT より高い酸素ストレスに曝されている? (5%) 消費酸素 / 消費水素 0.37 (10%) 消費酸素 / 消費水素 0.27 (15%) 消費酸素 / 消費水素 0.20

46 Δhox は最終 OD 値が高い 1 最終 OD Δhox : 1.86 WT : 1.47 約 20% 差 OD 540nm Time (hour) Δhox WT OD/ 酸素消費量 OD/ 水素消費量 WT Δhox 酸素消費量あたりの OD 値は激増 ( 効率的なエネルギー代謝 ) 水素消費量あたりの OD 値の低さは酸素ストレスと関連?

47 Hox は膜結合型ヒドロゲナーゼに比べてエネルギー生産効率が20% 低い H 2 1 分子から作られるプロトングラジエントの理論値 <Hox> < 膜結合型ヒドロゲナーゼ> 2H + 分少ない計 8H + 計 10H + H 2 2H + 2H + 4H + 2H + 2H + Cytc 4H + 2H + Q bc 1 Cox ATPase Hox H 2 1/2O 2 +2H+ H 2 O 2H + 1/2O 2 +2H + H 2 O

48 Hydrogenobacter thermophilus TK-6 電子供与体エネルギー代謝還元力 :e - 伊豆の峰温泉から単離好熱性 ( 生育至適温度 :70 ) 好気的に生育可能 (40%O 2 ) 絶対独立栄養性電子供与体 : 水素チオ硫酸電子受容体 : 酸素硝酸炭素源 : 二酸化炭素呼吸炭酸固定 ( 還元的 TCA cycle) [ 活性 ] 酸素防御システムなど

49 H. thermophilus 中の電子の流れ炭素源 CO 2 電子供与体水素チオ硫酸電子獲得系還元的 TCA 回路 Fd NADH ATP 還元力呼吸酸化ストレス防御機構解毒化活性酸素種電子受容体酸素硝酸

50 活性酸素種除去システム

51 活性酸素種除去システム Superoxide dismutase: 2O H + H 2 O 2 +O 2 Superoxide reductase : Rubredoxin red + O H + = Rubredoxin ox + H 2 O 2 Catalase: 2H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Peroxidase: ROOR' + 2e - + 2H + ROH + R'OH

52 Reactive oxygen species detoxification systems Comparison Superoxide dismutase [2O H + H 2 O 2 + O 2 ] Superoxide dismutase A soda Superoxide dismutase C sodc In Aquifex aeolicus O 2 -sensitive Peroxidase [R-OOH + 2e - R-OH + H 2 O] Cytochrome c peroxidase ccpr Thiol peroxidase tpx Bacterioferritin comigratory protein bcp Alkyl hydroperoxide reductase ahpc Rubrerythrin-like protein hth1222 Rubrerythrin (Rbr) Hth1222 4helix surrounding 2Fe Ferritin-like 4helix surrounding 2Fe 4Cys-1Fe Peroxidase Rubredoxin-like Unknown

53 Distribution of Rbr-like proteins Phylogenetic tree Single-domain Aerobes Actinobacteria Aquificae Proteobacteria Hth Thermoprotei Hth1222 is a key for the defense system? 0.1 Two-domain Anaerobes

54 Physiology of hth1222 gene defect mutant Growth profiles WT Mutant OD 540 nm Anaerobic 0.4 Microaerobic 0% O % O 2 10% O Time [h] Time [h] Time [h] Aerobic Unable to grow aerobically Essential under aerobic conditions Sato et al., 2012, PLoS ONE

55 Absorbance Absorbance Characterization of purified protein Spectra analyses FNR was reported to reduce Rbr Oxidized spectrum 2. Dithionite (Reduced) Oxidized 2. +NADPH 3. +FNR (Reduced) 4. +H 2 O 2 (Reoxidized) Wavelength [nm] Wavelength [nm] Ferredoxin:NADPH oxidoreductase (FNR) can reduce Hth1222 Reduced spectrum was reoxidized by H 2 O 2 Hth1222 may function as a peroxidase Sato et al., 2012, PLoS ONE

56 他の酸化ストレス防御機構は? In H. thermophilus Superoxide dismutase ( 超酸化物不均化酵素 ) Superoxide dismutase A soda Superoxide dismutase C sodc 酸素感受性の近縁種 In Aquifex aeolicus Peroxidase ( 過酸化物還元酵素 ) Cytochrome c peroxidase ccpr Thiol peroxidase tpx Bacterioferritin comigratory protein bcp Alkyl hydroperoxide reductase ahpc Rubrerythrin-like protein hth1222

57 Bacterioferritin comigratory protein (BCP) 過酸化物還元酵素として機能 2つのCysが活性中心 Cys-SH HS-Cys Cys-S-S-Cys ( 還元型 ) ( 酸化型 ) Thioredoxin (Trx)/Trx reductase が電子供給 H. thermophilus TK-6 の BCP 他の微生物の BCP 分子内に 4 つの Cys 分子内に 1~3 つの Cys 本菌の BCP の反応機構は?

58 Specific activity (U/mg) H. thermophilus TK-6 の BCP 本菌 BCP は Cys12, Cys26, Cys48, Cys53 を持つこれまでの研究より本菌 BCP は単量体で機能し, 活性中心が Cys48 のみであること活性に関与しない Cys12 と Cys26 が S-S 結合を作ることが明らかにされている WT C12A C26A C48A C53A kda WT 還元酸化 Cys48 のみ活性に必須活性中心でない Cys12 と Cys26 が分子内 S-S 結合を形成 Y. Sato (2013) Energy Metabolisms of Hydrogenobacter thermophilus

59 質量変化を測定することで S-S 結合の位置を特定 1 H2O2(ROS の一種 ) 添加により S-S 結合を形成還元型 Cys-SH H2O2 Cys-SH 2H Cys- Cys- S S 酸化型 2 トリプシンによる酵素処理で BCP を複数の断片に分離 BCP MLKEGDKAPEFCLEGIDEDGKEGRFCLR DFLGKPLILYFYPKDDTPGCTQEACDFRD SMSR 3 MALDI-TOF-MS によって酸化還元に伴う質量変化を測定還元型断片 Cys-SH Cys-SH 2H (2 Da) 断片 Cys- Cys- S S 酸化型断片の質量が還元型より -2 Da

62 Specific activity (U/mg) H. thermophilus TK-6 の BCP 本菌 BCP は Cys12, Cys26, Cys48, Cys53 を持つこれまでの研究より本菌 BCP は単量体で機能し, 活性中心が Cys48 のみであること活性に関与しない Cys12 と Cys26 が S-S 結合を作ることが明らかにされている WT C12A C26A C48A C53A kda WT 還元酸化 Cys48 のみ活性に必須活性中心でない Cys12 と Cys26 が分子内 S-S 結合を形成 Y. Sato (2013) Energy Metabolisms of Hydrogenobacter thermophilus

64 Peroxiredoxin (BCP) の反応機構 BCP N 1st step C C P SH C R SH H 2 O 2 H 2 O N C C P SOH C R SH 2nd step1 分子内 S-S 結合 N C C P SOH + C R SH H 2 O N C C P S C R S 2nd step2 分子間 S-S 結合 N C C P SOH C R SH C + HSC R C P S HSC P N H 2 O N C C R SH SC R HSC P C N

65 BCP の反応機構野性株は Cys48, Cys53 間で分子内 S-S 結合を形成 Cys-48-SH H2O2 Cys-48-S Cys-53-SH Cys-53-S C53A は Cys48 同士の分子間 S-S 結合を形成 Cys48-SH H2O2 Cys48-S S-Cys48 Ala53 Ala53 Ala53

66 Specific activity (U/mg) H. thermophilus TK-6 の BCP 本菌 BCP は Cys12, Cys26, Cys48, Cys53 を持つこれまでの研究より本菌 BCP は単量体で機能し, 活性中心が Cys48 のみであること活性に関与しない Cys12 と Cys26 が S-S 結合を作ることが明らかにされている WT C12A C26A C48A C53A kda WT 還元酸化 Cys48 のみ活性に必須活性中心でない Cys12 と Cys26 が分子内 S-S 結合を形成 Y. Sato (2013) Energy Metabolisms of Hydrogenobacter thermophilus

67 rtca サイクルのモジュール連続性 Acetyl-CoA TPP 炭酸固定 Pyruvate CO 2 Gluconeogenesis CO 2 炭酸固定ビオチン開裂 Citryl-CoA Oxaloacetate 2 電子還元 Malate 脱水 CoA 付加 Fe-S Fumarate 2 電子還元 Citrate 水添加モジュール Succinate CoA 付加脱水 Isocitrate 2 電子還元 Succinyl-CoA Fe-S Oxalosuccinate 炭酸固定ビオチン CO 2 2-Oxoglutarate TPP 炭酸固定 CO 2

68 Acetyl-CoA Pyruvate Oxaloacetate Malate Fumarate Succinate 炭酸固定炭酸固定 2 電子還元脱水 2 電子還元つまりこんな考え Succinyl-CoA 2-Oxoglutarate Isocitrate cis-aconitate 炭酸固定炭酸固定 Oxalosuccinate 2 電子還元脱水水添加 (1) 左側の代謝系が機能 (2) コハク酸はそのままではそれ以上反応が進行しないので CoA が動員され Succinyl- CoA が生成 (3) cis- アコニット酸まで反応進行 (4) 酵素が二機能性を有していたためクエン酸が生成 (5) クエン酸はそのままでは反応が進行しないので CoA が動員され Citryl-CoA ができる (6) Citryl-CoA lyase が機能し始め回路が完結する Citrate Citryl-CoA Acetyl-CoA + Oxaloacetate

69 アコニターゼが関わる分子クエン酸 :91% H 2 O アコニターゼがクエン酸を ( 効率よく ) 生成するためフマル酸還元酵素と類縁な酵素が cis- アコニット酸に対して機能することなく反応が進んだクエン酸がエネルギー的に安定なこともこの事柄を支持している H 2 O cis- アコニット酸 :3% イソクエン酸 :6%

70 フマラーゼが関わる分子 H 2 O リンゴ酸 :75% フマル酸 :25% フマル酸の分子対称性がフマル酸還元酵素を産んだ

71 フマル酸還元酵素フマル酸還元酵素のサブユニット数が多いことさらにはモチーフが多いことは生物がとにかくフマル酸を代謝しようと喘いでいた歴史を刻んでいるのでは!?

72 Parallel, but moderately identical only in CO 2 fixation reaction Enzymes Cofactors Enzymes Cofactors Identity (%) Pyruvate: ferredoxin oxidoreductase Pyruvate carboxylase Malate dehydrogenase TPP Ferredoxin Biotin ATP NADH 2-Oxoglutarate: ferredoxin oxidoreductase 2-Oxoglutarate carboxylase Oxalosuccinate reductase TPP Ferredoxin Biotin ATP NADH 10 Fumarase Fe-S Aconitase Fe-S α: 7 β: 5 Fumarate reductase Succinyl-CoA synthetase NADH ATP Citryl-CoA synthetase Citryl-CoA lyase POR-FOR: POR(B)-KOR(B): 19 Large subunit: 44 Small subunit: 55 ATP CcsA-SucC: 26 CcsB-SucD: 33

73 サイクル形成前? Acetyl-CoA Pyruvate 進化系統的に古い微生物には見当たらない Glyoxylate Succinyl-CoA 2-Oxoglutarate Oxaloacetate Isocitrate Malate Sulfolobus, Pyrobaculum で見出される Fumarate Succinate

74 グリオキシル酸 (CHO-COOH) C1 代謝から見ると : 3HP サイクルの中間代謝物質メチロトローフセリン経路の中間代謝物質 C2 代謝から見ると : グリオキシル酸経路の中間代謝物質グリオキシル酸カルボリガーゼの基質 (C2 代謝と C3 代謝を結ぶ ) しかしアセチル -CoA とは異なり二酸化炭素からの生合成系は存在しないもともと存在していた?

75 サイクル形成前? Acetyl-CoA Succinyl-CoA Pyruvate 2-Oxoglutarate Glyoxylate Oxaloacetate Isocitrate Malate Sulfolobus, Pyrobaculum で見出される Fumarate Succinate

76 選択されなかった代謝系 Acetyl-CoA 炭酸固定 Pyruvate 炭酸固定 2 電子還元 Lactate CoA 添加 Oxaloacetate Malate 2 電子還元脱水 Lactoyl-CoA Acryloyl-CoA 脱水 2 電子還元 Fumarate 2 電子還元 Propanoyl-CoA 炭酸固定 Succinate CoA 添加 Succinyl-CoA Metylmalonyl-CoA 異性化

77 e- バイオ

78 e- バイオ (Electron-oriented Biotechnology for Energy and Ecology) 生物のエネルギー代謝の中枢ともいえる電子の流れに着目する電子の流れの解析を中心として, 生物中の電子の流れの制御, 電子の生物 ( 群 ) への供給, 生物 ( 群 ) からの引き抜き, などにより, 炭素循環をベースとした有用物質生産に資する全く新たな反応場の創生を目指す

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Microsoft PowerPoint - 雑誌会 pptx 石井研雑誌会 No. 1148 2014. 1. 17 新井博之 Neisseria gonorrhoeae における cbb 3 oxidase の CcoP サブユニットと cytochrome c 2 を介した微好気呼吸と脱窒のリンク背景 1 Neisseria gonorrhoeae (gocococcus, 淋菌 ) -proteobacteria の病原性菌末端酸化酵素は cbb 3