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1 Chlamydomonas reinhardtii trna RNAi Comparison of RNAi effect stability induced by the inverted repeat construct driven by modified trna promoters in Chlamydomonas reinhardtii

2

3 RNA interference(rnai) RNA dsrna RNA(dsRNA) RNase dsrna 22 RNA sirna RISC mrna sirna RNA RNA (RdRP) RNAi RNAi RNAi RNAi RNAi sirna dsrna RNAi Dicer RdRP RdRP 2 RNAi RNAi RNAi RNAi mrna promoter terminator Dicer RNAi RNAi centrin IR pol rbcs2 RNAi 1

4 (Koblenz B. et al. J Cell Sci. 2003) (spc) aada rbcs2 aada IR RNAi RNAi37 19P(1030) RNAi37 RNAi spc RNAi IR RNAi RNAi RNAi RNAi 0 DNA pol rbcs2 pol RNAi pol trna 6 ( 1) trna RNAi RNAi RNAi 6 trna aada 5 ORF 150bp IR DNA RNAi aada 19P(1030) (GLE) 1 RNAi RNAi RNAi DNA RNAi 2

5 DNA RNAi pol DNA pol RNAi RNAi TAP 1 Tris 2.42 g TAP salts 25 ml Phosphate solution ml Hutner trace elements 1.0 ml Glacial acetic acid 1.0 ml N-Free TAP 1 Tris 2.42 g N-free TAPSalts 25 ml Phosphate solution ml Hutner trace elements 1.0 ml Glacial acetic acid 1.0 ml TAP salts 1 NH 4 Cl MgSO 4 7H 2 O CaCl 2 2H 2 O 15 g 4.0 g 2.0 g 3

6 N-free TAP salts 1 KCl 15 g MgSO 4 7H 2 O 4.0 g CaCl 2 2H 2 O 2.0 g Phosphate solution 1 K 2 HPO g KH 2 PO g Hutner trace elements 1 EDTA, disodium salt 50 g ZnSO 4 7H2O 22 g H 3 BO g MnCl 2 4H 2 O 5.06 g CoCl 2 6H 2 O 1.61 g CuSO 4 5H 2 O 1.57 g (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 4H 2 O 1.10 g FeSO 4 7H 2 O 4.99 g 1 TAP Bacto-agar (amp,zeo,spc) 1l 10g 4

7 DNA DNA ( ) ( ) RNAi aada mrna IR (zeo) ble psp124s[lumbreras et al.,1997(a)] ble rbcs2 IR trna Chlamydomonas center trna trna trimming trna 3 RNA trna 6 trna RNAi 1 trna Type I 7 bp Type 7 bp Type 2 bp Type 14 bp Type bp Type val trna TAP (Tris-Acetate-Phosphate ) TAP 100 l/ml ampicillin (Wako) lux 24 TAP 5

8 lux 0.8% 100 l/ml ampicillin paromomycin Wako spectinomycin (Sigma) Zeocin (Invitrogen) ampicillin 19P(1030) mt- (cc-124) p-(1030) aada Chlamydomonas genetic center GLE GLE GLE GLE CC-620mt+ CC-621mt- ( 2) CC-620mt+ CC-621mt- 1000ml TAP 240ml cell/ml 200ml (4,000rpm -8 ) 500ml 120ml N-Free TAP 20 (4,000rpm- 8 ) 14ml N-Free TAP CC-620mt+ CC-621mt- 500ml 45 mating 50ml (5,000rpm -10 ) (5,000rpm-10 ) (MILLIPORE Millex 0.45µm) GLE 70 6

9 GLE HU HU GLE ( 3) HU HU TAP1.2 1ml 2ml 100 l cell/ml, ml 25 1 GLE 50ml 40ml 8000rpm P(1030) DNA 19P(1030) 1~ cell/ml 40ml (3,000rpm-8 ) TAP 1ml 15ml GLE (30 60 ) (3,000rpm-5 ) TAP 1ml 2 TAP 300µl 0.5mm 300mg PEG100µl Kpn I DNA 1µg TAP 1ml PEG TAP 2 TAP 1ml (3,000rpm-5 ) 200µl 10µg/ml 3 PCR DNA SDS-phenol 50ml 7

10 8000rpm-3 SDS-EB (2% SDS, 400mM NaCl, 40mM EDTA ph8.0, 100mM Tris-HCl ph8.0) 800µl proteinase-k(invitrogen) 4.8µl 2ml 65 1 PCI( )0.8ml rpm-5 (0.8ml) 2- (15,000rpm-20 ) DNA 70% TE (10mM Tris-HCl ph mM EDTA ph8.0) 300µl PCR DNA PCR ble aada ( 4) PCR 96 (4min) 95 (30sec) 65 (30sec) 72 (30sec) 72 (5min) 4 40 ble ble F [5 -GATGGCCAAGCTGACCAGCGCCGTTC-3 ] ble R [5 -TTAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGT-3 ] 528bp GFP trnalinkergfp/f [5 -CGGCGAGCCGTGCTGCTGCCCGA-3 ] trnalinkergfp/r [5 -CGCGGAATTCGGTGACGAACTCCAGC-3 ] 118 bp DNA 50ml TAP 30ml 50ml 3,000rpm-5 TEN (10mM Tris-HCl 10mM EDTA 150mM NaCl ph8.0) SDS-EB 800µl proteinase-k 4.8µl ml PCI 30 (10,000rpm-5 ) CIA (24 1) 30 (10,000rpm-5 ) 65 1/7 5M NaCl 65 CTAB/NaCl [10%(w/v) CTAB 0.7M NaCl] 1/10 CIA 5 8

11 (5,000rpm-5 ) CTAB precipitation [1%(w/v)CTAB 50mM Tris-HCl ph8.0 10mM EDTA ph8.0] 65 CTAB DNA 500µl High-salt TE (100mM Tris-HCl ph mM EDTA ph8.0 1M NaC) CTAB RNA 10mg/ml RNaseA(QIAGEN)2µl /10 TE 4 DNA DNA DIG DNA aada ble rbcs2 DIG DNA PCR DIG Probe Synthesis Kit Roche PCR 96 (4min) 95 (30sec) 50~65 (30sec) 72 (30sec) 72 (5min) 4 40 aada p679 aada probe /F [5 -CAGTGATATTGATTTGCTGGTT-3 ] aada probe /R [5 -TGGACAAATTCTTCCAACTGAT-3 ] aada 618bp 50 PCR ble ble F [5 -GATGGCCAAGCTGACCAGCGCCGTTC-3 ] ble R [5 -TTAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGT-3 ] 2nd exon 3rd exon 528bp 65 PCR rbcs2 DNA rbcs2 DNA probe/f [5 -GCAAGCTTGTACTACGACAACCGCTAC-3 ] rbcs2 DNA probe/f [5 -ATGAATTCCACGGAGCGCTTGTTGG-3 ] 4 exon 224bp 65 PCR RNAi aada aada 9

12 DNA DNA 15µg TE 10µl DNA 10 (TAKARA ) 2µl EtBr 0.8 DNA molecular weight marker, digoxigenin-labeled(roche)5µl 4 100v BPB 0.4M NaOH 1M NaCl 200ml 15 DNA 3MM Whatman Chr 3MM [ + (Amersham )] 3MM 500g 16 2 SSC (300mM NaCl 30mM C 6 H 5 O 7 Na 3 2H 2 O) DNA 2 SSC ml 20 SSC 62.5ml H g Na g SDS 17.5g 10 50ml 500ml 3ml DIG DNA 2µl PCR ml DNA SSC 0.1 SDS SSC 10 SDS DIG 0.1M 150mM NaCl ph7.5 Tween-20 10

13 10 blocking stock solution 2g 10 Tween20 20ml 10 PBS-20ml 160ml 200ml 20ml 30 20ml Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments(roche ) 2µl 30 DIG 40ml,Tween µl 15 2 (0.1M Tris-HCl 0.1M NaCl ph9.5)10ml CDP-Star, ready-to-use(roche ) 5 (FujiFilm Las-1000) RNAi 2 amp 33 amp TAP 7~8mL 300 l ( lux) TAP7ml single colony isolation 50ml TAP30ml 500µl TAP 1/400 20µl amp 100µg/ml single colony isolation 10 8 Single colony isolation TAP 200µl /10 1/50 1/250 amp100 ble10 spc100 spc µl 11

14 7 10 RNAi ] RNAi 1 RNAi aada 19P(1030) SDS-phenol DNA PCR ble GFP Type 57, Type 47 Type 40, Type 42, Type 41, Type aada IR ( 5) IR DNA Apa I Bgl ble (1770bp) Apa I ble DNA Apa I Bgl aada RNAi aada 19P(1030) aada Eco T14 I aada aada IR RNAi Type 4 Type 3 Type 4 Type 4 Type 3 Type amp 100µg/ml zeo 10µg/ml spc 100,(200),300µg/ml 1/10 spc Type spc 6 RNAi ( 6) 12

15 33 spc spc Type 96 TAP20 l amp zeo spc 1/10 1/100 1/ zeo spc 7 zeo spc ble IR RNAi RNAi pol RNAi RNAi single colony isolation 8 6 zeo spc 8 ble GFP PCR PCR Type 8 Type zeo spc Type strain3 zeo spc RNAi pol RNAi RNAi DNA RNAi 13

16 DNA RNAi Ebbs ML, Bartee L, and Bender J. H3 lysine 9 methylation is maintained on a transcribed inverted repeat by combined action of SUVH6 and SUVH4 methyltransferases. Mol Cell Biol. 2005, 25, Kawasaki H, and Taira K, Short hairpin type of dsrnas that are controlled by trnaval promoter signifcantly induce RNAi-mediated gene silencing in the cytoplasm of human cells, Nucleic Acids Res. 2003;31: Koblenz B, Schoppmeier J, Grunow A and Karl-Ferdinand Lechtreck Centrin deficiency in Chlamydomonas causes defectsin basal body replication, segregation and maturation, Cell Science 2003,116, Kuwabara T, Warashina M, Koseki S, Sano M, Ohkawa J, Nakayama K, and Taira K, Significant higher activity of a cytoplasmic hammerheard ribozyme than a corresponding nuclear counterpart: engineered trnas with an extended 3 end can be exported efficiently and specifically to the cytoplasm in mammalian cell. Nucleic Acids Res.2001, 29,, Lu S, Shi R, Tsao1 C.C, Yi X, Li L and Vincent L. Chiang RNA silencing in plants by the expression of sirna duplexes, Nucleic Acids Res ;32:e

17 Heriderto Ceruti, J.Armando Casas-Mollano On the origin and functions of RNA-mediated silencing: Current Genetics,2006,50,81-99 Shinjiro Ogita, Hirotaka Uefuji and Hiroshi Sano Molecular breeding of decaffeinated coffee plants Regulation of Plant Growth Development 2003,38, Shinjiro Ogita,Hirotaka Uefuji,Yube Yamaguchi,Nozomu Koizumi,Hiroshi Sano Producing decaffeinated coffee plants Nature,2003,423,19., trna pol RNAi 2007( ) 15

18 1.asがそのままのもの 2.as 7bpを 消 失 させたもの 3.as を2bp 少 なくし 5bpにしたもの 4.as 14bpと 長 くしたもの 5. 同 様 にas 14bpにし 6 7 bpをミスペアにしたもの 6. as human trnaval RbcS2 ble RbcS2 trna センス aada term pro pro 図 1 trna polⅢプロモーターのアクセプターステム(as)の 改 変 バリエーションと RNAi 誘 起 コンストラクト 16

19 図 2 液 体 培 地 でのGLE 調 整 (A) 前 培 養 72h(B) 本 培 養 72h(C,D) 配 偶 子 の 誘 導 24h(E,F) 接 合 時 の 細 胞 壁 溶 解 酵 素 の 回 収 1h(G) 細 胞 壁 溶 解 の 例 ( 左 : 未 処 理 ; 右 : 処 理 細 胞 ) 図 3 固 体 培 地 でのGLE 調 整 (A) 本 培 養 96h (B) 配 偶 子 の 誘 導 1h(C) 接 合 時 の 細 胞 壁 溶 解 酵 素 の 回 収 1h (D) 細 胞 壁 溶 解 の 例 ( 左 : 未 処 理 ; 右 : 処 理 細 胞 ) 17

20 500b 100b λ/HindⅢマーカー 2100b ラダーマーカー 3ble/F + ble/r 4ble/F 5ble/R 6tRNAlinkerGFP/F + trnalinkergfp/r1 7tRNAlinkerGFP/F 8tRNAlinkerGFP/R1 9tRNAlinkerGFP/F + trnalinkergfp/r2 10tRNAlinkerGFP/F 11tRNAlinkerGFP/R2 図 4 PCRによるコンストラクト 導 入 の 確 認 M a b c d a b c d 19P(1030) 形 質 転 換 体 図 5 (M) 分 子 量 マーカー Diglabel Marker Ⅶ (a)apa I bgl Ⅱbleプローブ (b) Apa I bgl ⅡaadAプローブ (c) Apa I bleプローブ (d) EcoT14 I aadaプローブ 18

21 表 1 コンストラクトが 完 全 長 1コピー 導 入 された 株 数 RNAi 誘 起 コンストラクトが 完 全 長 1コピー 導 入 された 株 数 ( 左 ) 形 質 転 換 体 はPCRチェックによってリンカーとbleが 確 認 できた 株 ( 右 ) 小 松 晃 明 ( 高 知 工 科 大 学 大 学 院 卒 )に 分 与 された 株 ( 左 グループ) 新 たに 取 得 した 株 ( 右 グループ) Type 形 質 転 換 体 完 全 長 1コピー 形 質 転 換 体 完 全 長 1コピー 計 P ( ) Type Ⅰ Type Ⅱ Type Ⅲ amp 100 zeocin 10 spec 100 spec 300 (μg/ml) amp 100 Type Ⅳ Type Ⅴ Type Ⅵ zeocin 10 spec 100 spec 300 (μg/ml) 7 日 図 6 TypeⅠからTypeⅥの 得 られた 株 全 てを1/10 1/50 1/250に 希 釈 してスポッティングを 行 い7 日 後 に 撮 影 した 写 真 19

22 Type Ⅰ Am p 100 株 1 2 3 Type Ⅰ 4 株 4 3 2 1 1/10 1/100 1/1000 zeo 10 1/10 1/100 1/1000 Spc 100 1/10 1/100 7日後 日後 1/1000 図7 Type I strain1から4までを1/10 1/100 1/1000に希釈しスポッティングし 7日後に撮影した写真 左 それをzeoの生育度の高い順に並び替えた ものが右の写真 Type Ⅲ zeo 10 am p 100 clone 1 strain /10 1/50 1/50 1/250 1/250 1/10 1/50 1/50 spc 80 1/250 1/250 1/10 図8 Type Ⅲ strain3 のスポッティング 写真 1/50 1/50 spc 200 1/250 1/250 1/10 1/50 1/50 1/250 1/250 20

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