スルホベタイン型官能基を導入したポリマー吸着剤における親水性化合物の捕捉特性

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ほのかかがんじ
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1 HILIC および逆相コアシェル ( ソリッドコア ) カラムを用いた高極性化合物の分析クロマニックテクノロジーズ塚本友康長江徳和 info@chromanik.co.jp

2 オクタコシル (C8) 疎水性相互作用が主な相互作用 CH 3 水系の移動相での安定性が高い立体選択性が高い極性基導入型 C8 より耐久性が高い H 3 C

C8 と C8 の標準試料の分離 3 Sunniest C8 5 7 4 6 0 5 0 5 0 5 30 35 Retention time/min Column: Sunniest C8, 5mm 50 x 4.6 mm Sunniest RP-AQUA, 5m m 50 x 4.6 mm Sunniest C8, 5mm 50 x 4.

3 C8 と C8 の標準試料の分離 3 Sunniest C Retention time/min Column: Sunniest C8, 5mm 50 x 4.6 mm Sunniest RP-AQUA, 5m m 50 x 4.6 mm Sunniest C8, 5mm 50 x 4.6 mm Mobile phase: CH 3 H/H =75/5 Flow rate:.0 ml/min Temperature: 40 ºC Pressure: 5.4 MPa Sample: = Uracil, = Caffeine, 3 = Phenol, 4 = Butylbenzene, (N=5,700) 5 = o-terphenyl, (N=5,000) 6 = Amylbenzene, (N=5,300) 7 = Triphenylene, (N=4,500)

C8 との比較 Conventional C8 %C:8% 0 5 0 5 0 5 30 retention

Sample: =δ-tocopherol H H =γ-tocopherol C8 C8

4 C8 との比較 Conventional C8 %C:8% retention time / min Sunrise C8 %C:8%, 3 4 Column size: 4.6x50 mm Mobile phase: 97/3=CH 3 H/H Flow rate:.0 ml/min Temperature: 5 ºC Detection: UV at 95nm Sample: =δ-tocopherol H H =γ-tocopherol C8 C8 3=β-Tocopherol 3 4 H 4=α-Tocopherol H retention time / min 固定相容量は同じ

Relative retention of thymine (%) SunShell RP-Aqua の 40 o C での保持 40 ºC 5 ºC 核酸塩基の分離 3 0 3 4 Retention time/min Column: SunShell RP-Aqua,.6 μm 75 x 4.

0 ml/min Temperature: 40 ºC and 5 ºC Sample: = Cytosine, = Uracil, 3 = Thymidine, 4 = Uridine, 5 = Thymine 3 4 5 5 4 00 90 80 70 60 50 40 30 0 0 0

5 Relative retention of thymine (%) SunShell RP-Aqua の 40 o C での保持 40 ºC 5 ºC 核酸塩基の分離 Retention time/min Column: SunShell RP-Aqua,.6 μm 75 x 4.6 mm Mobile phase: 0mM Phosphate buffer ph7.0 Flow rate:.0 ml/min Temperature: 40 ºC and 5 ºC Sample: = Cytosine, = Uracil, 3 = Thymidine, 4 = Uridine, 5 = Thymine でのチミンの保持時間の変化 ( ポンプ送液時間停止毎に測定 ) Measurement number every stop flow 緩衝液のみの移動相を用いた場合の保持の再現性を試験しました毛管作用により, ポンプを停止し充填剤周りの圧力を大気圧にすると, 通常の C8 カラムは細孔内からの移動相の抜けだしが起こり, 保持時間は大幅に減少しますが,SunShell RP-Aqua ほとんど細孔内からの抜け出しは起こっておらず,94% 以上の再現性を示しました

6 Relative retention (%) Relative plate number of thtmine (%) 酸性塩基性条件下の耐久性 Sunniest RP-AQUA Test conditions Mobile phase: 0.5% TFA Temperature: 60 ºC ther brand aqua type C Time (h) Sunniest RP-AQUA ther brand aqua type C Time (h) Test conditions Mobile phase: 0 mm phosphate buffer (ph 8.0) Flow rate:.0 ml/min Temperature: 40 ºC

細孔からの移動相の抜け出し内径 0.5mm のガラス管 0nm 内径 0.5mm のガラス管内で赤インクは 6cm 上昇するこの場合に作用してる圧力は 0.

7 細孔からの移動相の抜け出し内径 0.5mm のガラス管 0nm 内径 0.5mm のガラス管内で赤インクは 6cm 上昇するこの場合に作用してる圧力は気圧である内径が mm では 30m 上昇し 3 気圧の圧力が作用していることになるカラムを大気圧状態にして移動相を充填剤の細孔から抜け出させるために必要な圧力は気圧である充填剤の細孔の大きさを考慮すると毛管現象によりこの気圧は簡単に発生する

8 毛細管現象水とガラス管の場合水とテフロン管の場合毛管現象の式 : h=g cosq /(rrg) g : 表面張力 r: 液体の密度 ( 比重 ) r q h g r h q 液体が管に濡れる場合 q < 90 液体が管に濡れない場合 q > 90

9 疎水性と撥水性撥水性水をはじく性質液体と物質の表面との接触角が 90 度より大きくその角度が大きいほど撥水性が強い θ 物質水疎水性水と混ざりにくい性質物質を水と n- オクタノールに溶解して水と混ぜ合わせ平衡に達したときの双方での濃度の比分配係数によって表される分配係数はしばしば常用対数を用いて LogP と表される

10 撥水と疎水違う? 同じ? F F F Trifluoromethane ctadecane ctane ctacosane 接触角 (θ) 分配係数 (LogP) 水の溶解度 ( mg /L) 疎水性 (logp) が高いから撥水性 ( 接触角 ) が高いわけではない疎水性の高さ撥水性の強さ分析化学 Vol.59 No. 3, P93-05(00)

11 水溶性ビタミンの分離 SunShell RP-AQUA N(4)=30,800 N(3)=3, Column: SunShell RP-AQUA,.6 mm 50 x 4.6 mm Mobile phase: 40mM Phosphate buffer ph6.8 Flow rate:.0 ml/min Temperature: 40 ºC Detection: UV@50nm Sample: = Nicotinic acid, = Pyridoxal, 3 = Pyridoxine, 4 = Nicotinamide

HFBA in Acetonitorile/water(9/) %B 0% to 0% in 0 min Flow rate: 0.

12 アミノ酸の分離 Column: Sunniest RP-AQUA 5mm,.0x 50mm Mobile phase: A) 5mM HFBA (Heptafluorobutyric acid) B) 5mM HFBA in Acetonitorile/water(9/) %B 0% to 0% in 0 min Flow rate: 0.mL/min Temperature: 40 o C Detection: Quattro Micro API (ESI positive) SIM Retention time/min

アミノ酸の LC/MS 0 0 0 Retention time/min Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile,Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val m/z 90 75 33

spectrum of Valine Column: Sunniest RP-AQUA 5mm,.

13 アミノ酸の LC/MS Retention time/min Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile,Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val m/z % MW=7 Structure of Valine Mass spectrum of Valine Column: Sunniest RP-AQUA 5mm,.0x 50mm Mobile phase: A) 5mM HFBA (Heptafluorobutyric acid) B) 5mM HFBA in Acetonitorile/water(9/) %B 0% to 0% in 0 min Flow rate: 0.mL/min Temperature: 40 o C Detection: Quattro Micro API (ESI positive) SIM m/z

14 有機酸の分離 Column: SunShell RP-AQUA.6 μm, 50 x 4.6 mm, Mobile phase: 0.05 M KHP4, ph.5 Flow rate:.0 ml/min, Column pressure: 3 MPa for.5ml/min, Temperature: 40 ºC Detection: UV@0nm, Injection volume: μl Sample: = xalic acid (60 ppm), = Tartaric acid (500 ppm), 3 = Formic acid (000 ppm), 4 = Malic acid (000 ppm), 5 = Lactic acid (000 ppm), 6 = Acetic acid (000 ppm), 7 = Diglycolic acid (000 ppm), 8 = Maleic acid (00 ppm), 9 = Citric acid (000 ppm), 0 = Succinic acid (000 ppm), = Fumaric acid (0 ppm).

15 H H H H H H H H H HILIC の分離メカニズム H H H H H H - - H H - H H H H H H H H Mobile Phase Hydrophilic Partitioning H H - H H Analyte Analyte lica gel (HILIC) DS silica (RP) HILIC の特徴として逆相系に用いる極性溶媒が使用可能である固定相に形成された水和層との分配によって分離が起こると言われている親水性が高い化合物ほど保持される特徴がある

16 HILIC を使用するうえでの注意点保持が短い保持がない場合サンプル移動相もしくは水割合が低い溶媒で調整する移動相有機溶媒の割合を増やす塩の濃度を上げる塩の種類を変える理論段数が低い場合サンプル負荷量を減らす移動相流速を遅くする逆相クロマトグラフィと比べ試料中の溶媒 ( 水 ) の影響を大きく受ける傾向がある最適流速も逆相クロマトグラフィより低速になる傾向がある

17 HILIC カラムに使用される官能器逆相カラムと違い親水的な分配が主な分離機構だが二次相互作用も比較的強く働く二次的な相互作用を抑えることはほとんどされていない電荷を有する官能基が多い親水性相互作用静電的相互作用イオン交換相互作用 - S 両性イオン基陰イオン交換基 N + 陽イオン交換基 - S 水素結合ジオール基 H アミド基 N + H N CH 3 CH 3 H

18 二次相互作用の働き疎水基 ( 主効果 ) 吸着性基 ( 二次効果相互作用 ) 主効果 ( 疎水基 ) 既存の分離剤二次効果相互作用制御型分離剤主効果 ( 疎水基 ) 第二主効果を持つ二足型分離剤主効果 ( 疎水基 ) 二次効果 ( 吸着等 ) 制御された二次効果第二の主効果

19 HILIC カラムを設計するうえで. 基材自身の親水性が高い基材のみでも HILIC で使用可能なシリカを選択コアシェルを使用することで高分離が可能. 導入されている官能基の構造官能基が高い水和性を有し, 高い密度で導入可能である静電的な相互作用が極力低い官能基の結合部位の疎水性が低いことアミド基を選択 R HN

20 親水性の比較分析条件 :Mobile phase: Acetonitrile/ammonium acetate buffer (0 mm, ph = 4.76) = 90:0 [v/v] Linear velocity;.0 mm/s, UV detection wave length; 54 nm, Column oven temperature; 30 U A V Column k (U) k (A) k (V) ZIC-HILIC (5 mm) ZIC-HILIC (3.5 mm) Nucleodur HILIC (3 mm) Amide-80 (5 mm) XBridge Amide (3.5 mm) PolySULFETHYL (3 mm) PolyHYDRXYETHYL (3 mm) CYCLBND I (5 mm) LiChrospher Diol (5 mm) Chromolith HAL HILIC (.7 mm) CSMSIL HILIC (5 mm) Sugar-D (5 mm) NH -MS (5 mm) SunShell HILIC-Amide (.6 mm) 合成した SunShell HILIC-Amide は他の官能基を導入した HILIC カラムの中でも大きな親水性を有していたウリジン (U) アデノシン (A) ビダラビン (V) ウリジンの保持から充填剤の親水性を評価保持が大きいほど充填剤の親水性が高い同じ HILIC カラムであっても親水性の違いが大きい逆相カラムのように使い分ける必要がある

イオン交換性の比較 U S U TMPAC Column k ( ) 0 mm k (S ) a(spts/u) k ( ) 0 mm k (TMPAC) a(tmpac/u) ZIC-HILIC (5 mm). 0.69 0.33. 3.3.57 ZIC-HILIC (3.5 mm).0 0.56 0.7.0 3.45.64 Nucleodur HILIC (3 mm).0.3 0.5.0 3.4.43 Amide-80 (5 mm) 3.

70 0.45 0.63 LiChrospher Diol (5 mm).50 0.95 0.63.50.73.6 Chromolith 0.3 0.06 0.9 0.3 5.5 6.94 HAL HILIC (.7 mm) 0.64 0.0 0.3 0.64 9.03 4. CSMSIL HILIC (5 mm).60.8 0.80.60 0.78 0.49 Sugar-D (5 mm).

21 イオン交換性の比較 U S U TMPAC Column k ( ) 0 mm k (S ) a(spts/u) k ( ) 0 mm k (TMPAC) a(tmpac/u) ZIC-HILIC (5 mm) ZIC-HILIC (3.5 mm) Nucleodur HILIC (3 mm) Amide-80 (5 mm) XBridge Amide (3.5 mm) PolySULFETHYL (3 mm) PolyHYDRXYETHYL (3 mm) CYCLBND I (5 mm) LiChrospher Diol (5 mm) Chromolith HAL HILIC (.7 mm) CSMSIL HILIC (5 mm) Sugar-D (5 mm) NH -MS (5 mm) SunShell HILIC-Amide (.6 mm) Sodium p-toluenesulfonate (SPTS) Trimethylphenylammonium chloride (TMPAC) a の値により充填剤のイオン交換性が評価できる値が小さいほどイオン交換性が低い合成した SunShell HILIC- Amide は a の値が低くアニオンカチオン交換ともに小さいことが判明した

22 充填剤表面の比較 Tb Tp Column k (Tb) k (Tp) α(tb/tp) ZIC-HILIC (5 mm) ZIC-HILIC (3.5 mm) Nucleodur HILIC (3 mm) Amide-80 (5 mm) Amide-80 (3 mm) XBridge Amide (3.5 mm) PolySULFETHYL (3 mm) PolyHYDRXYETHYL (3 mm) CYCLBND I (5 mm) LiChrospher Diol (5 mm) Chromolith HAL HILIC (.7 mm) CSMSIL HILIC (5 mm) Sugar-D (5 mm) NH -MS (5 mm) theophylline (Tp) α(tb/tp) > α(tb/tp) = α(tb/tp) < theobromine (Tb) 酸性中性塩基性 α の値によって充填剤表面の性質が評価される SunShell HILIC-Amide (.6 mm) 合成した SunShell HILIC-Amide は α = 0.9 であり弱い塩基性を示した

7) =8: Flow rate:.0 ml/min, Temperature: 40 o C Detection: UV@50 nm, Sample:. tymine,. uracil, 3.

23 SunShell Amide 3 核酸塩基の分離 4 5 Column: SunShell Amide.6 mm : 00 x 4.6 mm, Acentice Express H5.6 mm : 00 x 4.6 mm Acentice Express HILIC.6 mm : 00 x 4.6 mm, Mobile phase: acetonitrile : 0 mm ammonium acetate(ph4.7) =8: Flow rate:.0 ml/min, Temperature: 40 o C Detection: UV@50 nm, Sample:. tymine,. uracil, 3. uridine, 4. cytosine, 5. cytidine 他社 HILIC カラム ( ポリオール ) 他社 HILIC カラム ( シリカ )

24 合成甘味料の分離 Column: SunShell Amide.6 mm : 00 x 4.6 mm, Mobile phase: acetonitrile : 5 mm phosphate buffer (ph.5) =8: Flow rate:.0 ml/min, Temperature: 室温 Detection: UV@5 nm, 3. Aspartame. Saccharin, 3. Acesulfame K,

25 配糖体の分離 3 Column: SunShell Amide.6 mm : 00 x 4.6 mm, Mobile phase: acetonitrile : 5 mm phosphate Ammonium (ph4.9) =8: Flow rate:.0 ml/min, Temperature: 室温 Detection: UV@5 nm, Sample:. Helicin,. Salicin, 3. Arbutin 4. Rutin 4. Helicin,. Salicin, 3. Arbutin 4. Rutin

26 メラミンの分離 Column: SunShell Amide.6 mm : 00 x 4.6 mm, Mobile phase: acetonitrile : 5 mm phosphate Buffer (ph6.9) =75:5 Flow rate:.0 ml/min, Temperature: 40 Detection: UV@0 nm,. Cyanuric acid,. Melamine,

27 HILIC と逆相クロマトグラフィの比較 SunShell Amide Column: SunShell Amide.6 mm : 00 x 4.6 mm SunShell RPAqua.6 mm : 00 x 4.6 mm Mobile phase: acetonitrile : Amide : 0 mm ammonium acetate(ph4.7) =8: RPaqua : 0 mm phosphate buffer(ph7.0) Flow rate:.0 ml/min Temperature: 40 o C Detection: UV@50 nm Sample:. tymine,. uracil, 3. uridine, 4. cytosine, 5. cytidine 5 SunShell RPAQUA

28 まとめ C8 カラムは水系移動相のみでも保持時間が安定しており極性化合物の分離に有用であった作成した SunShell HILIC-Amide は他の HILIC カラムと比較した場合高い親水性を示しイオン交換性も低かった SunShell HILIC-Amide は他社コアシェル型 HILIC カラムより長い保持を示した C8 カラムと Amide カラムを核酸塩基を用いて比較した場合その溶出順は概ね逆となった

Microsoft PowerPoint - LCテクノ　ポスター　塚本

Microsoft PowerPoint - LCテクノ　ポスター　塚本 HPLC,UHPLCそれぞれの視点から見たコアシェル型充填カラムと全多孔性充填カラムとの比較塚本友康, 長江徳和 ( クロマニックテクノロジーズ ) 表面多孔性シリカ ( コアシェル ) 細孔のない核 ( コア ) と多孔質層から形成されているシリカ粒子であり全多孔性シリカ粒子に比べ表面積は小さい粒子全体に対する多孔質層の割合が 77% と高いため, 試料負荷量が低くなる欠点を克服粒子細孔径が

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