究極のHPLC用C18カラムの開発を目指して

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やすもりなぐも
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特集分析技術究極の PLC 用 C8 カラムの開発を目指して Aiming for the development of the ultimate C8 column for PLC 一般財団法人化学物質評価研究機構東京事業所クロマト技術部技術課長内田丈晴 Takeharu Uchida (Section chief) Chromatography Department, CERI

1 特集分析技術究極の PLC 用 C8 カラムの開発を目指して Aiming for the development of the ultimate C8 column for PLC 一般財団法人化学物質評価研究機構東京事業所クロマト技術部技術課長内田丈晴 Takeharu Uchida (Section chief) Chromatography Department, CERI Tokyo, Chemicals Evaluation and Research Institute,Japan (CERI) キーワード L-column シリカ系耐アルカリ性 C8 カラムメタルフリーカラム 0 はじめに現在高速液体クロマトグラフィー (PLC) で最もよく用いられている分離モードは試料と固定相との間に働く疎水性相互作用の原理を用いた逆相分配クロマトグラフィーであり充塡剤としてオクタデシルシリル (DS) 化シリカゲルを充塡したシリカ系逆相 C8カラムが汎用的に用いられているまたそれらの充塡剤の基材には一般的にシリカゲルを用いたものが多いその理由としてシリカゲルは機械的強度が高い分離効率が高い様々な修飾基を化学修飾することができ汎用性が高い比較的安価であるなどが挙げられるしかしながら基材シリカは耐アルカリ性が低いため使用できる移動相のp 範囲が限られるという欠点を抱えているシリカ系逆相 C8カラムは本来疎水性相互作用のみによる比較的単純な保持機構による分離であるが残存シラノール基や基材シリカ中の金属不純物による二次的相互作用が働き分離に悪影響を及ぼすことが広く知られているこれらの二次的相互作用以外にも液体クロマトグラフィー / タンデム質量分析法 (LC/MS/MS) においてクロマトグラフィー管などの金属材料と相互作用し分離に悪影響を及ぼす場合もあるここではこれらの欠点を克服すべく今まで開発に取り組んできた内容について簡単に紹介するングはトルエンなどの液相中でシリル化剤を反応させる方法がよく知られていたがこのようなエンドキャッピングでは反応効率が低くシラノール基が残存するという問題があったそこで CERIでは全く新しい画期的なエンドキャッピング法である高温気相エンドキャッピング法を開発し 990 年に高温気相エンドキャッピングを施した L-column DSを開発したこの高温気相エンドキャッピング法は高温液相中でシリル化する方法に比べて反応効率が優れているためより多くのシラノール基を不活性化することができる, ) また 007 年に高温気相エンドキャッピングの反応効率を更に向上させた高度エンドキャッピング法を開発しそれを施した L-column DSを開発した ( 図 ) 金属不純物を多く含んだ基材シリカも残存シラノール基と同様二次的相互作用が働き分離に悪影響を及ぼすことが知られており特に分析対象物質が配位性化合物の場合ピークのテーリング及び保持時間の遅延最悪の場合ピークが全く検出されないこともあるそのため金属不純物を含まない基材シリカを用いることも重要である ) またエンドキャッピングの表面被覆が高密度であるほど吸着性が少なくなるといわれている 0 エンドキャッピング分析対象物質が塩基性物質の場合残存シラノール基に吸着し易くピークのテーリング及び保持時間の遅延の原因となるそのため一般的にトリメチルシリル化による残存シラノール基を不活性化するエンドキャッピングが施される 980 年代後半までは一般的にエンドキャッピ図シリカ系逆相 C8(DS) カラムの分離機構 ( イメージ )

2 特集分析技術理論段数(ナフタレ50 TE CEMICAL TIMES 0 メタルフリーカラム液体クロマトグラフィー / タンデム質量分析法 (LC/MS/MS) による生体試料の微量分析が広く行われているしかし一部の化合物特にペプチドや低分子のリン酸化合物の分析では配管やバルブなどの金属材料と相互作用しそれらのピークが大きくテーリングする一般的にカラムは充塡剤とステンレス製のクロマトグラフィー管フリットと呼ばれるフィルターなどから構成されているがこれらとも相互作用しピークがテーリングする原因となっているそこで試料との相互作用が起こりにくいガラスライニングステンレス管とポリマー系のフリットを組み合わせたメタルフリーカラムを 04 年に開発した 4) このカラムは金属配位性化合物のLC/MS/MS 分析においてピーク形状や感度の改善キャリーオーバーの低減定量範 5) 6) 囲の拡大不確かさの低減など有効性が確認された ( 図 ) またメタボロミクスやリピドミクスなどの分野でも使用されつつある様々なアプローチで改善を目指しているただし残存シラノール基についてはエンドキャッピングの反応率をいかに上げるかという比較的シンプルな方法論での対処が可能であったが化学的耐久性については充塡剤のほとんどを占める基材自体の侵食を防ぐ必要があるためこの課題は非常に複雑で解決困難なテーマであるといえるしかし CERIでは独自に開発した化学的耐久性の非常に高いPCSシリカ (Perfect Chemical Stable Sillica) と耐久型高度エンドキャッピングによりこれらの難題の克服に成功した L-column を07 年 9 月より供給を開始した L-column とp まで使用可能な他社製カラムとの耐アルカリ性を評価するためこれらのカラムに対してトリエチルアミン (p.) 及びリン酸緩衝液 (p.5) による通液劣化試験を行ったその結果を図に示すトリエチルアミンの通液において Brand D 及びBrand Eは00 時間前後で理論段数の著しい低下が認められた一方 50 時間以上安定していた及びもリン酸緩衝液の通液では50 時間以内に著しい低下が認められたこれはカラムがアルカリ性移動相の種類にも大きく影響を受けるということを示している L-column はいずれのアルカリ性移動相の通液条件においても安定していることから非常に耐アルカリ性が高いことがわかるつまりステンレスカラムメタルフリーカラムン)の維持率(%00 L-column 50 Brand D Brand E ) 通液時間 (h) 分析条件充塡剤 L-column DS, μm カラムサイズメタルフリーカラム.0 mm I.D. or ステンレスカラム. mm I.D., 50 mm L. 溶離液 A:0.% ギ酸 ; B: アセトニトリル A/B:95/5-50/50 (0-0 min) 流速 0. ml/min カラム温度 40 試料リン酸化ペプチド (:NVPL-pY-K :LADL-pS-K) 試料濃度 500 fmol/μl 注入量 μl 検出 ESI-MS/MS(+) 図カラム材質の違いによるリン酸化ペプチドの分析結果 ( 左 ) ステンレスカラム ( 右 ) メタルフリーカラム 04 L-column 充塡剤 C8 5 μm カラムサイズ.0 or. 50 mm 通液劣化試験条件移動相 54 mmトリエチルアミン (p.)/ メタノール (90/0) 流速 0. ml/min カラム温度:50 ナフタレン測定条件移動相水 / アセトニトリル (40/60) 流速 0. ml/min カラム温度:40 理論段数00 (ナフタレ50 ) 通液時間 (h) ン)の維持率(%L-column PLC 分析においてカラムは常に移動相に晒され続けるこのことはシリカ系逆相 C8カラムなどの充塡剤表面が常に加水分解のリスクに晒されているということを意味するシリカ系逆相 C8カラムはシリカゲル表面をアルキル基で高密度に修飾しているため中性移動相での耐久性は十分に維持されるしかしアルカリ性移動相となると基材シリカは簡単に侵食されはじめやがてカラム先端に隙間が生じカラム性能は著しく低下するシリカ系カラムにおけるアルカリ性の耐久性の向上について残存シラノール基の問題と同様に各カラムメーカーも充塡剤 C8 5 μm カラムサイズ.0 or. 50 mm 通液劣化試験条件移動相 0 mmリン酸緩衝液 (p.5)/ メタノール (90/0) 流速 0. ml/min カラム温度:40 ナフタレン測定条件移動相水 / アセトニトリル (40/60) 流速 0. ml/min カラム温度:40 図アルカリ性移動相の通液劣化試験上 )54 mmトリエチルアミン (p.)/ メタノール (90/0) 下 )0 mmリン酸緩衝液 (p.5)/ メタノール (90/0) 4

3 L-column は非常に幅広いp 領域 (p ~p ) でメソッ特集分析技術TE CEMICAL TIMES ド設計が可能なカラムといえるまた L-column は極限まで残存シラノール基を不活性化しており塩基性物質配位性化合物及び酸性物質の全てに対してシャープなピークを示す図 4に塩基性物質である抗うつ剤の分析結果を示す L-column は左右対称なシャープなピークが得られた一方 L-column と同等の耐アルカリ性を示したは吸着性に関しては L-column より劣る結果であった L-column は多岐の物質にわたりオールラウンドに最高レベルの低吸着性を発揮するカラムといえる 9.5である p の移動相では構造中のピペリジノ基のほとんどが解離しカルボキシル基は解離が抑えられた状態となり p の移動相では逆に構造中のピペリジノ基は解離が抑えられた状態でカルボキシル基がほとんど解離しているまた p 7の移動相では構造中のピペリジノ基及びカルボキシル基の両方がほとんど解離しているため保持時間が最も小さくなるこのような両性物質に対しても L-columnを用いれば広範囲な移動相条件から移動相のpに制約されることなく目的に応じた分析条件を選択することができる T.f. () =.69 a) p T.f. () =.76 T.f. () =.60 T.f. () =.9 T.f. ( ) =. 0 L-column L-column b) p 分析条件充塡剤 C8 5 μm カラムサイズ mm 移動相アセトニトリル /5 mmリン酸緩衝液 (p7)(5/65) 流速 ml/min カラム温度:40 試料. パロキセチン. シタロプラム. フルオキセチン注入量 μl 05 図 4 低吸着性 ( 塩基性物質 ) L-column で広がるアプリケーション L-columnは非常に幅広いp 領域 (p ~) でメソッド設計が可能なことからイオン性化合物の分析に対してその性能を十分に発揮することができるそれはイオン性化合物の解離状態が移動相のpによって変化し保持が大きく変化するからであるそのため移動相のp 変化が分離改善に大きく寄与する図 5に L-columnを用いてイオン性化合物を分析したものを示す移動相のpを 7 に変更することでイオン性化合物の保持時間を変化させることができる酸性物質であるイブプロフェンの pkaは4.5であることから p の移動相では解離が抑えられた状態となるので保持時間は最も長くなる一方 p 7 及びp の移動相ではほとんど解離しているので保持時間は短くなる塩基性物質では酸性物質と逆の傾向となる塩基性物質であるフルボキサミンの pkaは9.であることから p 及びp 7の移動相ではほとんど解離しているので保持時間が短くなるが p の移動相では解離が抑えられた状態になることから保持時間が最も長くなるこの挙動は他の塩基性物質及び酸性物質でも同様の傾向が見られた一方両性物質であるフェキソフェナジンの pkaは4. 及び C c) p C C. イブプロフェン N N 7. フルボキサミン C C 5. フェキソフェナジン分析条件カラム L-column C8 5 μm,. 50 mm 移動相 A: アセトニトリル ; B:5 mm リン酸緩衝液 (p,7,) A/B: 0/80-70/0 (0-0 min) 流速 0. ml/min カラム温度:40 試料. ケトプロフェン ( 酸性 ). イブプロフェン ( 酸性 ). インドメタシン ( 酸性 ) 4. イソブチルパラベン ( 弱酸性 ) 5. フェキソフェナジン ( 両性 ) 6. トリプロリジン ( アルカリ性 ) 7. フルボキサミン ( アルカリ性 ) 注入量 μl 図 5 L-column を用いた移動相のpによるイオン性化合物の分離パターン変化現在医薬品の開発において原薬中の不純物に関するガイドラインが発行されており新規医薬品の申請時に不純物や医薬品の保存中に生成する分解生成物等についての分析法構造決定及び安全性評価をしたものを添付する必要がある図 6に塩基性医薬品であるホモクロルシクリジンの分解生成物を分析した例を示すそれぞれのクロマトグラムを比較すると p の移動相が一番多くピークを検出することができたまた移動相のpによりピーク数が異なることから pを N C C 5

4 特集分析技術TE CEMICAL TIMES 高くすることで今までは分離することができなかった不純物のピークを分離する可能性が示唆され p でも分析可能な L-columnが医薬品の不純物分析に有効であることが示されたまた移動相のpが高くなるほど負荷量によるピーク形状の変化が小さくなり p の移動相では高負荷量の試料を注入してもシャープなピークとして検出することができたこのことから塩基性物質を大量に負荷させる分取精製において L-columnが有効であることが示されたら購入したものを用いたその結果を図 8に示す上側のクロマトグラムが移動相にアンモニア水を使用して分析したもの下側のクロマトグラムが移動相にギ酸アンモニウム及びギ酸を使用した公定法で分析したものであるこれらを比較するとアンモニア水を使用することで公定法と比較して三成分とも感度を向上し AとDTX- 間の分離も改善することができたこのことからアルカリ性移動相を用いたオカダ酸群の分析に L-columnが有効であることが確認された a) 検討法 ( アルカリ性移動相 ) : A :DTX- :DTX- c) p b) p a) p 分析条件カラム L-column C8 5 μm,. 50 mm 移動相 A: アセトニトリル ; B:5 mm リン酸緩衝液 (p,7,) A/B: 5/95-75/5-75/5 ( min) 流速 0. ml/min カラム温度:40 試料 0 g/l ホモクロルシクリジンの分解生成物注入量 5 μl b) 公定法図 6 ホモクロルシクリジンの分解生成物の分析 R No. 化学物質 R R R R4 オカダ酸 (A) - -C - - ディノフィシストキシン -(DTX-) C ディノフィシストキシン -(DTX-) - -C -C - オカダ酸 : 関東化学株式会社製 ( 製品番号 CAS.No ) ディノフィシストキシン -: 関東化学株式会社製 ( 製品番号 CAS. No ) ディノフィシストキシン -: 関東化学株式会社製 ( 製品番号 CAS. No ) 図 7 オカダ酸群の化学構造 R R R 分析条件カラム溶離液 L-column C8 μm,. 50 mm a) A:5 mm アンモニア水 (p0.5); B: アセトニトリル /5 mm アンモニア水 (p0.5)(95/5) b) A: mm ギ酸アンモニウム及び 50 mm ギ酸 ; B: アセトニトリル / mm ギ酸アンモニウム及び 50 mm ギ酸 (95/5) A/B:60/40-60/40-00/0-00/0 ( min) 流速 0. ml/min カラム温度:40 試料濃度 80 μg/l(a) 840 μg/l(dtx-) 850 μg/l(dtx-) 注入量 :5 μl 検出 ESI-MS/MS(-) 図 8 L-column を用いたオカダ酸群の分析 a) 検討法 b) 公定法次に L-columnを用いて下痢性貝毒であるオカダ酸群を分析した例を紹介するオカダ酸 (A) や異性体であるディノフィシストキシン (DTX) は構造中にカルボキシル基を有する毒素である ( 図 7) 公定法では移動相にギ酸アンモニウムやギ酸を加えて酸性にすることでカルボキシル基の解離が抑制された状態で分析をしているしかしマトリックス効果により感度が不安定であるという問題がある最近では LC/MS/MS 分析にアルカリ性移動相を用いている例も報告されている 7) これは移動相をアルカリ性にすることでカルボキシル基が解離状態となるためイオン化効率が改善されて感度を向上することができるからである我々も移動相にアンモニア水を用いたアルカリ性移動相でオカダ酸群を分析した分析に用いたオカダ酸群は関東化学株式会社か 6

5 特集分析技TE CEMICAL TIMES 術06 おわりに本稿ではこれまで CERI で開発したシリカ系逆相 C8 カラムについて紹介してきたいずれのカラムも様々な試行錯誤の中で開発できたものであるしかしその中でも耐アルカリ性カラムの開発は基材シリカ自体が持つ化学的特徴に関わることであるため最もハードルの高いものであったそのような中近年の耐アルカリ性カラムの登場は先に紹介したように今後の PLC 分析 LC/MS/MS 分析等において広がりを持たせることができる重要なツールの一つとして期待できるしかしながらシリカ系逆相 C8カラムが登場して以来耐アルカリ性が低いということが周知の事実として広く認知されていたためアルカリ性移動相を使用したアプリケーションデータは酸性及び中性移動相と比べて遥かに少ないのが実情であり今後の課題である参考文献 ) Y. Sudo, J. Chromatogr. A 77(), 9-47 (996). ) Y. Sudo, J. Chromatogr. A 757(-), -8 (997). ) Y. Sudo, T. Wada, J. Chromatogr. A 8(), 9-46 (998). 4). Sakamaki, T. Uchida, L. W. Lim, T. Takeuchi, J. Chromatogr. A 8, 5 (05). 5). Sakamaki, T. Uchida, L. W. Lim, T. Takeuchi, Anal. Sci. (), 9 97 (05). 6) S. Shibayama,. Sakamaki, T. Yamazaki, A. Takatsu, J. Chromatogr. A 406, 0 4 (05). 7) A. Gerssen, P. P. J. Mulder, M. A. McElhinney, J. de Boer, J. Chromatogr. A 6(9), 4-40 (009). 7

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Microsoft PowerPoint - 薬学会2009新技術2シラノール基.ppt シラノール基は塩基性化合物のテーリングの原因いや違う! クロマニックテクノロジーズ長江徳和日本薬学会 9 年会緒言緒言逆相型固定相中の残存シラノール基は, 吸着やピークテーリング等の原因であるとされている残存シラノール基に基づく主な相互作用は, 吸着, イオン交換, 水素結合であるこれらの二次効果相互作用を積極的に利用することで, 極性化合物に対して特異的な保持を示す新規な逆相固定相の創出が可能であると思われる