ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 2 用語及び略語一覧 ATP adenosine triphosphate アデノシン三リン酸 AUC area under the concentration-time curve 血中濃度曲線下面積 AUC(INF) area u

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1 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 1 CTD 第 2 部 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 薬物動態試験の概要文 ブリストル マイヤーズ株式会社

2 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 2 用語及び略語一覧 ATP adenosine triphosphate アデノシン三リン酸 AUC area under the concentration-time curve 血中濃度曲線下面積 AUC(INF) area under the concentration-time curve from time zero extrapolated to infinite time 投与後 0 時間から無限時間まで外挿した血中濃度曲線下面積 BSEP bile salt export pump 胆汁酸塩輸送ポンプ BCRP breast cancer resistance protein 乳癌耐性蛋白 BDC bile duct-cannulated 胆管カニューレ挿入 BMS Bristol-Myers Squibb ブリストル マイヤーズスクイブ社 BSP bromosulphothalien ブロモスルホフタレイン CLTp total plasma clearance 総血漿クリアランス Cmax maximum concentration 最高血中濃度 CYP cytochrome(s) P450 チトクローム P450 DCN document control number 文書管理番号 GLP Good Laboratory Practice 医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準 GSH glutathione グルタチオン HCV hepatits C virus C 型肝炎ウイルス IC 50 concentration required for 50% inhibition 50% 阻害濃度 Km michaelis constant ミカエリス定数 LC-MS/MS liquid chromatography with tandem mass spectrometry 液体クロマトグラフィー タンデム質量分析 MRP multiple drug-resistance protein 多剤耐性蛋白 MRT mean residence time 平均滞留時間 NADPH β-nicotinamide adenine dinucleotide β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオ phosphate チドリン酸 NTCP sodium-taurocholate cotransporting polypeptide タウロコール酸ナトリウム共輸送体 OAT organic anion transporter 有機アニオントランスポーター OATP organic anion transporting polypeptide 有機アニオン輸送ポリペプチド OCT organic cation transporter 有機カチオントランスポーター Pc permeability coefficient 透過係数 P-gp P-glycoprotein P 糖蛋白 PK pharmacokinetics 薬物動態 QC quality control 品質管理 QWBA quantitative whole-body autoradiography 定量的全身オートラジオグラフィー roatp rat organic anion transporting polypeptide ラット有機アニオン輸送ポリペプチド T-HALF Elimination half-life 消失半減期 Tmax time to reach maximum concentration 最高血中濃度到達時間 UGT uridine diphosphate glucuronosyl transferase Vss steady-state volume of distribution 定常状態分布容積 ウリジン二リン酸グルクロン酸転移酵素

3 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 3 目次 1 まとめ 分析法 吸収 吸収及びバイオアベイラビリティ In vitro における吸収 In vivo における吸収 単回投与後の吸収 マウス ラット イヌ サル 分布 代謝 In vitro での代謝 In vivo での代謝 マウス ラット ウサギ イヌ サル ヒト 排泄 マウス ラット ウサギ イヌ サル ヒト 薬物動態学的薬物相互作用 考察及び結論 参考文献... 37

4 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 4 表一覧 表 7-1 In vitro における薬物代謝酵素及びトランスポーターの阻害剤としてのダク ラタスビルの評価の要約... 30

5 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 5 図一覧 図 5-1 ダクラタスビルの化学構造式... 20

6 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 6 1 まとめダクラタスビル塩酸塩 (BMS ) は C 型肝炎ウイルス (HCV) の非構造蛋白 5A(NS5A) 複製複合体に対して高い選択性を有する 新規作用機序の低分子阻害薬 ( 直接作用型抗ウイルス薬 ) である ダクラタスビルのフリー体又は塩酸塩を試験で使用したが 用量及び濃度はフリー体に換算して表記した ダクラタスビルの非臨床薬物動態 (PK) は 一連の in vitro 試験並びにマウス ラット ウサギ イヌ及びサルを用いた in vivo 試験に基づいて評価した げっ歯類としてラットを選択し 非げっ歯類としてはイヌ及びサルを選択した 当初 単回投与トキシコキネティクス試験で イヌの血漿中ダクラタスビル曝露量がサルのそれよりも大きかったことから 非げっ歯類としてイヌを選択した その後 臨床試験でヒトにダクラタスビル 25 mg を単回経口投与した結果 代謝物 BMS ( ダクラタスビルの脱カルボキシメチル体 ) はヒト血漿中で定量下限未満であったが 代謝物 BMS ( ダクラタスビルのピロリジン環水酸化 転位化合物 ) が定量可能であり ダクラタスビルの血中濃度曲線下面積 (AUC) 値に対する BMS の AUC 値の割合は約 5% であった BMS は サル及びイヌの両方で評価された BMS は サルよりもイヌにおいてかなり高い濃度で存在した さらに イヌ及びサルにダクラタスビルを経口投与した結果 ダクラタスビルの AUC 値に対する BMS の AUC 値の割合は サル (1.3% 以下 ) よりもイヌ (10%~32%) で高値であった 以上より ダクラタスビルとその代謝物 (BMS ) の十分な曝露量がサルで得られ また イヌにおける BMS の曝露量は他の種に比べてかなり大きかったことから ダクラタスビルの毒性評価では 長期投与試験にサルを選択した ダクラタスビルの代謝物プロファイル及びトキシコキネティクスの詳細な検討は それぞれ薬物動態試験の概要文及び毒性試験の概要文に記載した 初期の探索試験において マウス ラット イヌ及びサル由来の各種生体試料は蛋白沈殿法により調製し 液体クロマトグラフィー タンデム質量分析 (LC-MS/MS) 法により分析した 医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準 (GLP) に準拠したトキシコキネティクス試験でマウス ラット ウサギ イヌ及びサルから得られた血漿試料は 妥当性を検証した LC-MS/MS 法を用いてダクラタスビルを単独で又は他の被験物質と併せて分析し その血漿中濃度を求めた なお 使用した分析法は これら被験物質に対して高感度で 精度良く 正確であった 各種動物に経口投与後のダクラタスビルの吸収は速やかで 最高血中濃度 (Cmax) の到達時間 (Tmax) は 0.5~2.9 時間の範囲であった (CTD ) ダクラタスビルの絶対バイオアベイラビリティ値はマウスで 100% 超 ラットで 50% イヌで 100% 超 サルでは 38% であり マウス ラット及びイヌでの良好な吸収性 (50% 以上 ) は ヒトでの良好な絶対バイオアベイラビリティ (67% AI 試験 ) と一致することが示された In vitro 及び in vivo 試験データから ダクラタスビルは P 糖蛋白 (P-gp) の基質であるが (CTD ) 乳癌耐性蛋白(BCRP) の基質ではないことが示された (CTD ) したがって P-gp は ダクラタスビルの経口吸収を抑制する可能性がある イヌにおいて ダクラタスビルの吸収は ph に依存していた ( CTD ) ダクラタスビルの ph 依存の吸収は ファモチジン (AI 試験 ) 又はオメプラゾール (AI 試験 ) を併用投与したときのヒトで確認され バイオアベイラビリティは胃内 ph の上昇に伴って減少した

7 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 7 マウスに静脈内投与後のダクラタスビルは速やかに消失し 半減期 (T-HALF) は 1.1 時間であった (CTD ) 一方 ラット イヌ及びサルでは ダクラタスビルは緩やかに消失し T-HALF はそれぞれ 3.3~ 及び 3.7 時間であった 総血漿クリアランス (CLTp) はマウス ラット及びサルよりもイヌで大きく (CTD ) マウス ラット イヌ及びサルでそれぞれ ~ 及び 12.4 ml/min/kg( 各動物種で報告されている肝血流 1) の 10% 16~27% 66% 及び 28% 相当 ) であった マウス ラット ウサギ イヌ サル及びヒト血清蛋白に対するダクラタスビルの結合率は 濃度 10 μm でそれぞれ 98.2% 98.3% 99.5% 96.5% 95.1% 及び 95.6% であった (CTD ) ダクラタスビル ( 濃度 0.1~10 μm) の in vitro ヒト血漿蛋白結合率は濃度に依存せず 濃度 1 μm (0.739 μg/ml) では 98.0% であった (CTD ) ダクラタスビルの ex vivo 血漿蛋白結合率は 健康被験者で 99.4% HCV ジェノタイプ 1 感染患者で 98.9%~99.3% Child-Pugh 分類 A B 及び C の肝障害患者ではそれぞれ 99.4% 99.1% 及び 99.0% であった (AI 及び AI 試験 ) したがって 蛋白結合の違いによるダクラタスビルの体内動態の種差はないと考えられた ダクラタスビルの血漿中濃度に対する血液中濃度の比はヒトで 0.77~0.82 動物では 0.56~1.08 と同程度の値であり 当該濃度比からダクラタスビルは血液中で優先的に血漿中に分布することが示唆された (CTD ) ダクラタスビルの定常状態分布容積 (Vss) は ラット イヌ及びサルでそれぞれ 及び 2.2 L/kg で 報告されている全身水分量 1) よりも大きかったことから (CTD ) ダクラタスビルは血管外に分布することが示唆された Long-Evans ラット ( 有色 ) に [ 14 C] ダクラタスビルを単回経口投与後の放射能の組織内分布は 雌雄 SD ラット ( アルビノ ) に [ 14 C] ダクラタスビルを単回経口投与後の放射能の組織内分布 並びに雄性 SD ラットに [ 14 C] ダクラタスビルを反復経口投与後の放射能の組織内分布と類似していた (CTD 及び CTD ) [ 14 C] ダクラタスビル由来の放射能は速やかに吸収され 体内に広範に分布した 有色ラットにおいて 血漿中放射能濃度に対する組織中放射能濃度の比が最も大きかった組織は 副腎 (6~13) 肝臓 (8~15) 及び消化管 (2~135) で 放射能濃度が低い又は定量下限未満の組織は 神経組織 分泌器官 脂肪 生殖組織 骨 / 筋肉 呼吸器及び水晶体であった 有色ラットにおいて [ 14 C] ダクラタスビル由来の放射能の消失は 皮膚 ブドウ膜 脾臓 胸腺 腎皮質及び副腎で緩やかであった これら組織中の投与後 840 時間 (35 日 ) の放射能濃度は ブドウ膜で μg-equivalents/g 残りの組織では 0.08~0.147 μg-equivalents/g[ 定量下限 (0.069 μg-equivalents/g) に近い値 ] を呈した [ 14 C] ダクラタスビルを用いた組織分布試験の結果は 非標識ダクラタスビルを用いた in vivo 試験の結果と一致し ダクラタスビルが肝臓 ( マウス ラット イヌ及びサル ) で濃縮されること また ダクラタスビルの脳 ( マウス及びラット ) への移行が抑制されることが示された さらに 野生型マウス及び P-gp ノックアウトマウスを用いた試験から 血漿中ダクラタスビルに対する脳中ダクラタスビルの AUC 比が野生型マウスよりも P-gp ノックアウトマウスで大きく 静脈内投与後及び経口投与後でそれぞれ 3.5 倍及び 5.4 倍であったことから P-gp はダクラタスビルの脳への移行を抑制することが示唆された ラット肝細胞を用いた取り込み試験結果から 受動輸送と能動輸送の両方がダクラタスビルの

8 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 8 肝取り込みに関与することが示された (CTD ) しかしながら ヒト肝細胞では ダクラタスビルの肝取り込みは主に受動拡散に起因することが示された (CTD ) 当該試験結果は ダクラタスビルが有機アニオン輸送ポリペプチド (OATP)1B1 OATP2B1 又は OATP1B3 の基質ではないことを示した in vitro 試験の結果 (CTD ) と一致した 妊娠 SD ラットに [ 14 C] ダクラタスビルを経口投与したとき 母動物組織及び胎盤への放射能の移行は速やかであった (CTD ) [ 14 C] ダクラタスビル由来の放射能は 投与後 4 時間の胎児肝臓中のみに検出され 母動物血漿中濃度に対する胎児肝臓中濃度の比は 0.19 であった 他の胎児組織では 放射能は検出されない又は定量下限未満であった これらの結果は ダクラタスビルとその代謝物は胎盤を通過するが 胎児組織への移行は抑制されたことを示唆する 授乳中のラットに [ 14 C] ダクラタスビルを経口投与したとき 乳汁中放射能は投与後 4 時間で最高濃度に達し 母動物血漿中放射能に対する乳汁中放射能の Cmax 比及び AUC 比は それぞれ 1.27 及び 1.55 であった (CTD ) これらの結果から ダクラタスビルの投与を受けている女性から授乳中の乳児は ダクラタスビルとその代謝物に曝露される可能性のあることが示唆された マウス ラット イヌ サル及びヒト由来の肝ミクロソームにおいて ダクラタスビルの代謝速度は同程度であった (CTD ) しかしながら 肝細胞におけるダクラタスビルの代謝速度はマウス イヌ及びサルよりもラット及びヒトで遅かった (CTD ) ダクラタスビルの 11 種類の代謝物は 各種の肝ミクロソーム 肝 S9 画分及び肝細胞中で生成された ヒトに特有の代謝物は検出されなかった また グルタチオン (GSH) 抱合体は検出されなかった [ 3 H] ダクラタスビル又は [ 14 C] ダクラタスビルとラット イヌ サル及びヒト肝ミクロソームとをインキュベートした結果 肝ミクロソーム蛋白と放射性物質との不可逆的結合がわずかながら認められた (CTD 及び CTD ) ダクラタスビルの in vivo 代謝は多数の酸化物の生成を特徴とし 排泄物中に検出された代謝物の数は ヒトで 8 種類 マウス ラット ウサギ イヌ及びサルでは 8~16 種類であった (CTD 及び ) 未変化体が血漿中の主化合物で マウス ラット ウサギ BDC イヌ及びサルの血漿中放射能のそれぞれ 75%~90% 85%~88% 90%~93% 88%~94% 及び 74%~86% を占めた 無処置のマウス ラット ウサギ及びサルにおいて 投与量のそれぞれ 19% 28% 26% 及び 27% が代謝物として排泄物中から回収された 胆管カニューレを挿入した (BDC) ラット イヌ及びサルでは 投与量のそれぞれ 36% 17% 及び 33% が代謝物として回収された 無処置動物の排泄物中に検出された主要な代謝物は サルで BMS ( 活性代謝物 投与量の 17.5%) マウスで BMS ( 活性代謝物 投与量の 6.3%) マウス ラット及びウサギでは BMS ( それぞれ投与量の 7.4% 9.8% 及び 1%) であった BDC 動物における主代謝物は ラット及びサルで BMS ( それぞれ投与量の 10.5% 及び 12.6%) イヌでは BMS ( 投与量の 6.0%) であった 胆汁中 糞便中又は尿中に検出された他の代謝物は 投与量の 5% 未満に相当した ヒトに [ 14 C] ダクラタスビルを単回経口投与した結果 投与後 240 時間で投与量の 94.24% が回収され そのうち 58.9% 及び 30.1% がそれぞれ未変化体及び代謝物として回収された 代謝物は主として酸化により生成した (CTD ) In vivo での代謝物プロファイルはすべての種で類似

9 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 9 し ヒトに特有の代謝物はなかった (CTD ) ダクラタスビルがヒト血漿中の主たる放射性物質で 血漿中放射能の 97%~100% を占めた BMS はヒト血漿中に検出された唯一の代謝物で 血漿中放射能のわずか 2% を占めた ヒトにダクラタスビル 25 mg を単回経口投与したとき (AI 試験 ) ダクラタスビルに対する BMS の AUC の割合は約 5% で また 60 mg を 1 日 1 回 7 日間反復経口投与したとき (AI 試験 ) ダクラタスビルに対する BMS の AUC の割合は 5% 未満であったことから (CTD ) BMS は血中の微量代謝物であることが示された 尿中及び糞便中の主代謝物は BMS ( 尿中及び糞便中でそれぞれ投与量の 0.2% 及び 15.2%) 及び BMS ( 尿中及び糞便中でそれぞれ投与量の 0.1% 及び 4%) であった ダクラタスビルの消失には 代謝クリアランス 糞便中排泄 胆汁クリアランス及び腸内分泌などの複数の経路が関与する (CTD CTD CTD CTD CTD CTD ) 動物で投与量の 0.4%~0.8% ヒトでは投与量の 6.4% が未変化体として尿中で回収されたことから (CTD ) 腎排泄は主要な消失経路ではないことが示された In vitro 試験データから ダクラタスビルは多剤耐性蛋白 (MRP)2 の基質ではないことが示された (CTD ) チトクローム P450(CYP)3A4 は ダクラタスビルの代謝を担う主酵素であり BMS ( ヒトの主代謝物 ) の生成に関与する ヒトにダクラタスビルを投与したとき 相当な量のダクラタスビルが酸化反応により代謝されるため CYP 活性の変化はダクラタスビルの消失に影響を及ぼす可能性がある ダクラタスビルは P-gp の基質であるため P-gp を介した薬物相互作用が生じる可能性がある 健康被験者に CYP3A4 及び P-gp の阻害剤であるケトコナゾールを併用投与したとき (AI 試験 ) ダクラタスビルの曝露量は増加し また CYP3A4 及び P-gp 誘導剤のリファンピシン又はエファビレンツを併用投与したときには (AI 及びAI 試験 ) ダクラタスビルの曝露量は減少した これらのデータは ダクラタスビルの曝露量が CYP3A4 及び P-gp の阻害剤又は誘導剤により影響を受けることを示すものである In vitro 試験から ダクラタスビルは CYP3A の可逆的及び時間依存的な弱い阻害剤であることが示された (CTD ) 肝細胞を用いた誘導試験データ及びベーシック又はメカニスティックスタティックモデル解析 3) の結果に基づくと ダクラタスビルは CYP1A2 及び CYP2B6 の誘導剤ではないが CYP3A4 を誘導する可能性がある (CTD CTD 及び CTD ) しかしながら AI 試験において ダクラタスビルとミダゾラム ( 親和性の高い CYP3A の基質 ) との間で薬物相互作用はみられなかった さらに ダクラタスビルはヒトの遺伝子組換えウリジン二リン酸グルクロン酸転移酵素 (UGT)1A1 を阻害した [ 50% 阻害濃度 (IC 50 )= 12.7 μm CTD ] しかしながら AI 及び AI 試験において 高ビリルビン血症 [ 総ビリルビン又は間接ビリルビン (UGT1A1 基質 ) の上昇 ] とダクラタスビルの投与との間に相関性がなく ダクラタスビルによる UGT1A1 の in vitro 阻害は in vivo では認められなかった ダクラタスビルは Caco-2 細胞におけるジゴキシン輸送及び OATP1B1 OATP1B3 OATP2B1 有機アニオントランスポーター (OAT)1 OAT3 有機カチオントランスポーター(OCT)1 OCT2 P-gp BCRP MRP2 及び胆汁酸塩輸送ポンプ (BSEP) などの各種の取り込み並びに排出

10 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 10 トランスポーターを阻害し 広範囲の IC 50 値を呈した (CTD CTD CTD CTD CTD CTD CTD 及び CTD ) タウロコール酸ナトリウム共輸送体 (NTCP) の阻害は 認められなかった (CTD ) 総ダクラタスビル ( 結合型ダクラタスビル+ 遊離型ダクラタスビル ) の曝露量又は遊離型ダクラタスビルの曝露量と IC 50 値との比較から ダクラタスビルは P-gp BCRP OATP1B1 OATP1B3 及び BSEP の基質との薬物相互作用を生じる可能性があるものの NTCP OATP2B1 OAT1 OAT3 OCT1 及び OCT2 の基質との薬物相互作用は生じないと考えられた なお AI 試験で HCV 感染患者にダクラタスビル 60 mg を反復投与したときのダクラタスビルの Cmax 値 2.34 μm(1.73 μg/ml) を参考値とし 薬物相互作用の発現の可能性を評価した ヒトでの薬物相互作用試験 (AI 試験 ) において 高親和性 P-gp 基質であるジゴキシンの曝露量に及ぼすダクラタスビルの影響は 軽度から中程度 [AUC(TAU): 1.27 倍増加 Cmax: 1.65 倍増加 ] であった また 別の薬物相互作用試験 (AI 試験 ) において OATP1B1 OATP1B3 及び BCRP の基質であるロスバスタチンの曝露量に及ぼすダクラタスビルの影響は軽度 [AUC(INF): 1.58 倍増加 Cmax: 2.04 倍増加 ] であった さらに 薬物相互作用試験 (AI 試験 ) において ダクラタスビルは 高親和性 OATP 基質であるアスナプレビルの曝露量に対して臨床的意義のある影響を及ぼさなかった これらのデータに基づくと P-gp BCRP 又は OATP の他の基質の PK に及ぼすダクラタスビルの影響は 臨床上わずかであると予測された

11 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 11 2 分析法初期の探索試験において マウス ラット イヌ及びサル由来の各種生体試料を蛋白沈殿法により調製し ダクラタスビルを単独で 又は他の被験物質 (BMS 及び BMS ) を併せて液体クロマトグラフィー タンデム質量分析 (LC-MS/MS) 法により分析した (CTD ) なお 探索試験とその分析法に関する詳細な情報は 各トキシコキネティクス試験報告書に記載した 後期の試験においては マウス (CTD 及び CTD ) ラット (CTD CTD 及び CTD ) ウサギ (CTD 及び CTD ) イヌ(CTD CTD 及び CTD ) 及びサル (CTD 及び CTD ) の血漿中のダクラタスビルを単独で又は他の被験物質を併せて分析するため 妥当性を検証した LC-MS/MS 法を使用した ( 薬物動態試験概要表 Table ) サル血漿中のリバビリン及びペグインターフェロンアルファ-2b は それぞれ LC-MS/MS 法 (CTD ) 及び電気化学発光法 (CTD ) により分析した 同一の動物種に対して複数の分析法が存在するのは 分析対象に複数の被験物質を追加したためであり また ブリストル マイヤーズスクイブ社 (BMS) から外部試験施設社 米国 ) に分析法を引き渡したためである リバビリン及びペグインターフェロンアルファ-2b の分析は それぞれ社 ( 米国 ) 及び社 ( 米国 ) にて実施された 安定同位体標識の内標準を添加した後 GLP 適用毒性試験から得られた動物血漿試料を固相抽出法により前処理し 逆相 LC-MS/MS 法により分析した 質量分析装置による被験物質の検出は ターボイオンスプレー による陽イオン化法により行った すべての動物種の血漿試料において ダクラタスビルを単独で分析するときの標準曲線は 2 又は 5~2000 ng/ml の濃度範囲であった 複数の被験物質とともにダクラスタルビルを分析するときの標準曲線は 2~2000 ng/ml の濃度範囲であった すべての測定において 使用した回帰モデルは 1/x 2 で重み付けした直線であった リバビリンに関しては 標準曲線は 5~1000 ng/ml の濃度範囲で 使用した回帰モデルは 1/x 2 で重み付けした直線であった ペグインターフェロンアルファ-2b に関しては 標準曲線は 500 ~32000 pg/ml の濃度範囲で 使用した回帰モデルは 1/y 2 で重み付けした直線であった 血漿試料が採取時から分析時までの間安定であることを保証するため 血漿試料の長期安定性を検討した 各種の動物及びマトリックスにおける分析法の詳細を薬物動態試験概要表の Table に示す マウス ラット イヌ及びサル血漿中の被験物質の分析法について 分析実施施設間のクロスバリデーション試験を実施した BMS で品質管理 (QC) 試料を調製し 分析した後 社に送付して分析した また 各動物種の実試料も両施設で分析し 比較検討した その結果 両施設で得られた分析結果に有意な差はみられなかった LC-MS/MS 法による血漿試料の分析結果は 予め設定した判定基準 [ 検量線作成用標準試料の少なくとも 4 分の 3 及び QC 試料の少なくとも 3 分の 2 の測定値が理論値の ±15% 以内 ( 最低濃度の標準試料では ±20% 以内 ) である ] を満たした また 血漿中ペグインターフェロンアルファー 2b の分析結果は 予め設定した判定基準 [ 検量線作成用標準試料の少なくとも 4 分の 3 の測定値

12 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 12 が理論値の ±20% 以内 ( 最低濃度の標準試料では ±25% 以内 ) であり 全 QC 試料の少なくとも 3 分の 2 かつ各濃度の QC 試料の少なくとも 2 分の 1 の測定値が理論値の ±20% 以内である ] を満た した

13 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 13 3 吸収 3.1 吸収及びバイオアベイラビリティ In vitroにおける吸収人工膜透過性評価において 濃度 100 μm でのダクラタスビルの透過係数 (Pc) は ph 5.5 及び 7.4 でそれぞれ 442 ± 168 及び 486 ± 183 nm/sec( 薬物動態試験概要表 Table A CTD ) で 高い膜透過性を示し ヒトで良好な吸収性を示す化合物の Pc 値 2) と類似している P-gp を含めたいくつかの排泄及び取り込みトランスポーターを発現する Caco-2 細胞単層膜を用いて ダクラタスビルの双方向透過性を検討した その結果 ダクラタスビル濃度 0.3 μm 及び ph 7.4 で 頂側膜側から側底膜側の方向の Pc 値は 15 nm/sec 未満と小さく 側底膜側から頂側膜側の方向の Pc 値は 364 ± 101 nm/sec と大きかった 流出比 ( 側底膜側から頂側膜側の Pc/ 頂側膜側から側底膜側の Pc) は 24 を上回り ケトコナゾール及びシクロスポリン (P-gp の阻害剤 ) の存在下で それぞれ 1.6 及び 0.8 に低下した ( 薬物動態試験概要表 Table B CTD ) これらのデータから ダクラタスビルは P-gp を含む排出トランスポーターの基質であることが示唆された そこで ダクラタスビルが P-gp の基質であることを確認するため P-gp ノックアウト (mdr 1a/1b) マウスへのダクラタスビル (3 mg/kg) の経口及び静脈内投与試験を実施した P-gp ノックアウトマウスにダクラタスビルを 3 mg/kg の用量で経口及び静脈内投与したときの AUC(0-8 h) 値は 野生型マウスの AUC(0-8 h) 値のそれぞれ 1.7 倍及び 2.3 倍であった ( 薬物動態試験概要表 Table A CTD ) これらの結果から ダクラタスビルは P-gp の基質であること また P-gp はダクラタスビルの経口吸収を抑制し ダクラタスビルの排泄を仲介する役割を担う可能性のあることが示された ヒト BCRP 発現 MDCK 細胞及び野生型 MDCK 細胞を用いた [ 3 H] ダクラタスビルの双方向透過性試験において 両細胞での透過比は類似していたことから ダクラタスビルは BCRP の基質ではないことが示された ( 薬物動態試験概要表 Table G CTD ) ヒト MRP2 発現 Sf9 細胞から調製した膜小胞を用いた [ 3 H] ダクラタスビルの取り込み試験において [ 3 H] ダクラタスビルの取り込みはアデノシン一リン酸 (AMP エネルギー輸送なし) 及びアデノシン三リン酸 (ATP エネルギー輸送あり) の存在下で同程度であり MK-571(MRP2 の阻害剤 ) による影響を受けなかったことから ダクラタスビルは MRP2 の基質ではないことが示された ( 薬物動態試験概要表 Table H CTD ) In vivoにおける吸収マウス ラット イヌ及びサルに経口投与後のダクラタスビルの吸収は速やかで Tmax はそれぞれ ± ± 1.6 及び 2.0 ± 0.0 時間であった ( 薬物動態試験概要表 Table A B C 及び D CTD ) ダクラタスビルの絶対バイオアベイラビリティの値は マウスに 3 mg/kg の用量で経口投与したとき 100% 超 イヌに 3 mg/kg の用量で経口投与したときには 100% 超と大きく ( 薬物動態試験概要表 Table A 及び C CTD ) これら動物種でのダクラタスビルの吸収性は良好であることが示された 一方 ラット及びサル

14 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 14 におけるダクラタスビルの絶対バイオアベイラビリティの値は小さく ラットに 5 mg/kg の用量で経口投与したとき 50% サルに 2.83 mg/kg の用量で経口投与したときには 38 ± 17% であった ( 薬物動態試験概要表 Table B 及び D CTD ) なお ヒトにおけるダクラタスビルの絶対バイオアベイラビリティの値は 67% で 良好な吸収性を示した (AI 試験 ) ラットにダクラタスビルを静脈内及び門脈内投与したときの投与後 0 時間から無限時間まで外挿した血中濃度曲線下面積 [AUC(INF)] 値は それぞれ 3.7 ± 0.15 μg h/ml 及び 2.8 ± 0.49 μg h/ml と同程度であったことから ダクラタスビル経口投与時のバイオアベイラビリティは 肝初回通過効果による影響を受けないことが示唆された ( 薬物動態試験概要表 Table B CTD ) イヌを用いたクロスオーバー法による試験において ファモチジン投与で胃内 ph を上昇させたとき ダクラタスビルの絶対バイオアベイラビリティ値は 89%( ペンタガストリン投与時 ) から 48%( ファモチジン投与時 ) に低下したことから ダクラタスビルの経口吸収は ph に依存することが示された ( 薬物動態試験概要表 Table C CTD ) 3.2 単回投与後の吸収 マウス野生型マウス及び P-gp ノックアウトマウスにダクラタスビルを 3 mg/kg の用量で静脈内投与し ダクラタスビルの血中動態を検討した ( 薬物動態試験概要表 Table A CTD ) その結果 野生型マウスにおいて ダクラタスビルは半減期 1.1 時間で消失し CLTp 値は 9.3 ml/min/kg で マウスの肝血流 1) の約 10% に相当した 一方 P-gp ノックアウトマウスにおいては ダクラタスビルは半減期 1.6 時間で消失し 野生型マウスのそれと同程度であったが CLTp 値は 4.0 ml/min/kg で マウスの肝血流 1) の 4.4% に相当し 野生型マウスのそれより低かったことから マウスでは P-gp はダクラタスビルの消失の役割を担うことが示された ラット 1 群 3 匹の雄性ラットにダクラタスビルを 2 及び 5 mg/kg の用量で静脈内投与し ダクラタスビルの血中動態を検討した ( 薬物動態試験概要表 Table B CTD ) その結果 ダクラタスビルはそれぞれ半減期 3.3 及び 4.7 時間で消失し 平均滞留時間 (MRT) はそれぞれ 2.2 及び 4.0 時間 CLTp 値はそれぞれ 9.1 及び 14.8 ml/min/kg で ラットの肝血流 1) のそれぞれ約 16% 及び約 27% に相当した イヌ 5 匹の雄性イヌにダクラタスビルを 1 mg/kg の用量で静脈内投与し ダクラタスビルの血中動態を検討した ( 薬物動態試験概要表 Table C CTD ) その結果 ダクラタスビルは半減期 3.9 ± 1.4 時間で消失し MRT 値は 4.8 ± 1.0 時間 CLTp 値は 20.3 ± 21.3 ml/min/kg で イヌの肝血流 1) の約 66% に相当した

15 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page サル 3 匹の雄性カニクイザルにダクラタスビルを 1.13 mg/kg の用量で静脈内投与し ダクラタスビルの血中動態を検討した ( 薬物動態試験概要表 Table D CTD ) その結果 ダクラタスビルは半減期 3.7 ± 0.31 時間で消失し MRT 値は 3.0 ± 0.48 時間 CLTp 値は 12.4 ± 4.2 ml/min/kg で サルの肝血流 1) の約 28% に相当した

16 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 16 4 分布ラット イヌ及びサルにダクラタスビルをそれぞれ 5 1 及び 1.13 mg/kg の用量で静脈内投与したときの Vss 値は それぞれ 3.6 ± ± 4.6 及び 2.2 ± 0.88 L/kg であった ( 薬物動態試験概要表 Table B C 及び D CTD ) これらの Vss 値は各動物種の全身水分量 1) ( ラット イヌ及びサルでそれぞれ 及び L/kg) よりも大きかったことから ダクラタスビルが血管外に分布することが示唆された ダクラタスビル [ 濃度 10 μm(7.389 μg/ml)] を血液中でインキュベートした結果 血漿中濃度に対する血液中濃度の比は ヒトで 0.77~0.82 試験した動物種では 0.56~1.08 であったことから ( 薬物動態試験概要表 Table A CTD ) 血液中のダクラタスビルは血漿中に優先的に分布することが示唆された マウス ラット ウサギ イヌ サル及びヒト血清蛋白に対するダクラタスビルの結合率は 濃度 10 μm でそれぞれ 98.2% 98.3% 99.5% 96.5% 95.1% 及び 95.6% であった ( 薬物動態試験概要表 Table CTD ) ダクラタスビルのヒト血漿蛋白結合率は 濃度 及び 10 μm でそれぞれ 97.9% 98.0% 及び 97.7% であった ( 薬物動態試験概要表 Table CTD ) Ex vivo での血漿蛋白結合率は 健康被験者で 99.4% HCV ジェノタイプ 1 感染患者で 98.9%~99.3% Child-Pugh 分類 A B 及び C の肝障害患者ではそれぞれ 99.4% 99.1% 及び 99.0% であった (AI 及び AI 試験 ) [ 3 H] ダクラタスビル又は [ 14 C] ダクラタスビルとラット イヌ サル及びヒト肝ミクロソームをインキュベートした結果 放射性物質と肝ミクロソーム蛋白との不可逆的結合 (40.5~ 71.7 pmol/mg/h) が認められた ( 薬物動態試験概要表 Table D CTD 及び CTD ) GSH の存在下で 不可逆的結合率はわずかに低下した (22~41 pmol/mg/h) ヒト肝細胞へのダクラタスビル (0.01~25 μm) の取り込みは速やかで ロテノン (ATP の枯渇薬 ) 又はブロモスルホフタレイン (BSP トランスポーター阻害剤) により阻害されなかった また 取り込み速度は試験濃度範囲で線形であった ( 薬物動態試験概要表 Table D CTD ) これらの結果から ダクラタスビルの肝への取り込みは エネルギー又はトランスポーターに依存していないことが示唆された さらに BSP の存在下又は非存在下でヒト OATP1B1 OATP2B1 又は OATP1B3 を発現する HEK-293 細胞を用いた in vitro 試験データ 並びに OATP1B3 を発現する Xenopus laevis 卵母細胞を用いた in vitro 試験データから ダクラタスビルは OATP1B1 OATP2B1 及び OATP1B3 の基質ではないことが示唆された ( 薬物動態試験概要表 Table E 及び F CTD 及び CTD ) これらの結果から 受動拡散がダクラタスビルのヒト肝への取り込みの主な機序であることが示唆された ラット肝へのダクラタスビルの取り込みは速やかで 飽和性があり (Km > 50 μm) ロテノン及びカルボニルシアニド-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン (FCCP)(ATP の枯渇薬 ) の添加により最大で約 50% 阻害されたことから エネルギー依存性の能動的過程がラット肝への取り込みに関与することが示唆された ( 薬物動態試験概要表 Table C CTD ) さらに ラット有機アニオン輸送ポリペプチド (roatp)1 roatp2 又は roatp4 を発現する Xenopus laevis 卵母細胞モデルを用いた in vitro 試験データから ダクラタスビルのラット肝への取り込みは 受動拡散に加え 部分的には roatp1

17 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 17 及び roatp2 を介して行われることが示唆された ( 薬物動態試験概要表 Table C CTD ) Long-Evans ラット ( 有色 ) 及び SD ラット ( アルビノ ) に [ 14 C] ダクラタスビルを 10.5 mg/kg (115 μci/kg) の用量で単回経口投与し 定量的全身オートラジオグラフィー (QWBA) 法を用いて放射能の組織分布を検討した ( 薬物動態試験概要表 Table A CTD ) その結果 Long-Evans ラットにおいて 放射能は速やかに吸収され 大部分の組織で投与後 0.5 ~4 時間で最高濃度に達し 組織中に広範に分布した 放射能濃度は副腎 胆汁 肝臓 盲腸 小腸及び胃で最も高かった 血管 / リンパ管 分泌器官 脂肪 真皮 生殖器 骨格 / 筋肉 呼吸器及び視覚器官の放射能濃度は低かった 神経組織及び水晶体の放射能は定量下限未満であった 放射能の血漿中濃度に対する組織中濃度の比は 大部分の組織の採取時点で 1 を上回った 副腎 甲状腺 皮膚 ブドウ膜 脾臓 胸腺及び腎臓を除き [ 14 C] ダクラタスビル由来の放射能は投与後 12~96 時間までに組織から完全に消失した 副腎 甲状腺 脾臓 胸腺及び腎臓中の放射能は 時間の経過とともに減少し 投与後 840 時間 (35 日 ) で 0.08~0.147 μg-equivalents/g( 定量下限 μg-equivalents/g に近い値 ) であった SD ラットにおいても 放射能は速やかに吸収された後体内に広範に分布し 放射能の組織内分布は Long-Evans ラットと類似していた SD ラットの組織中放射能濃度は 投与後 1 時間で Long-Evans ラットの約半分であったが 投与後 8 及び 24 時間では Long-Evans ラットと同程度であった Long-Evans ラットにおいて 非有色皮膚中の放射能は速やかに消失し 投与後 12 時間までに定量下限 (0.069 μg-equivalents/g) に達したが 有色皮膚及び眼ブドウ膜中の放射能の消失は緩やかで 放射能は投与後 840 時間 (35 日 ) で検出可能であり その濃度はそれぞれ 及び μg-equivalents/g であった 一方 SD ラットにおいては 眼組織中の放射能の消失は速やかで 投与後 24 時間までに定量下限未満になった これらのデータから 組織に含まれるメラニンに対する [ 14 C] ダクラタスビル由来放射能の特異的かつ可逆的な結合が示唆された 雌雄 SD ラットに [ 14 C] ダクラタスビルを 30 mg/kg(100 μci/kg) の用量で単回経口投与し また 雄性 SD ラットに [ 14 C] ダクラタスビルを 30 mg/kg(40 μci/kg) の用量で 1 日 1 回 14 日間反復経口投与し QWBA 法を用いて放射能の組織分布を詳細に検討した ( 薬物動態試験概要表 Table A 及び Table B CTD ) その結果 雌雄 SD ラットを用いた単回投与試験において 放射能の組織内分布及び消失は雌雄で類似していた 雌雄ラットにおいて 放射能の血漿中濃度に対する組織中濃度の比は 大部分の採取時点の組織で 1 を上回っていた 骨 水晶体 眼 小脳 大脳 脳髄及び嗅葉中の放射能は 雌雄とも定量下限未満であった 他の組織中の放射能濃度は試験期間中徐々に減少したが 雄性ラットの副腎 眼窩外涙腺 ハーダー腺 眼窩内涙腺 腎臓 腎皮質 下垂体 脾臓 胸腺及び甲状腺 並びに雌性ラットの腎臓 腎皮質 包皮腺 脾臓 胸腺及び甲状腺では 投与後 168 時間で放射能が残存していた 雄性 SD ラットを用いた反復投与組織分布試験において [ 14 C] ダクラタスビルを 30 mg/kg の用量で 1 日 1 回 14 日間反復投与した結果 大部分の組織中の放射能は投与後 8 時間で最高濃度に

18 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 18 達した 放射能の蓄積はいずれの組織でも認められず 放射能の組織分布及び消失は単回投与時と同程度であった 単回投与試験でみられたように 骨 水晶体 眼 小脳 大脳 脳髄及び嗅葉中の放射能は 定量下限未満であるか又は検出されなかった 組織中放射能は試験期間中徐々に減少し 最終投与後 168 時間 (7 日 ) まで多くの組織で放射能が検出可能であり 投与後 2016 時間 (84 日 ) までに眼窩外涙腺 眼窩内涙腺 胸腺及び甲状腺を除く大部分の組織で放射能は消失した さらに マウス ラット イヌ及びサル組織中のダクラタスビルの分布について 非標識ダクラタスビル及び LC-MS/MS 法を用いて検討した ( 薬物動態試験概要表 Table B Table C Table D 及び Table E CTD 及び CTD ) その結果 血清中又は血漿中ダクラタスビルに対する肝臓中ダクラタスビルの AUC 比は マウスで 2.35( 静脈内投与時 ) 及び 1.9( 経口投与時 ) ラットで 5.9( 静脈内投与時 ) 及び 6.8( 経口投与時 ) イヌで 10.6( 経口投与時 ) サルでは 17( 経口投与時 ) であった 血漿中ダクラタスビルに対する 心臓や脾臓などの他の組織中ダクラタスビルの AUC 比は おおむね 1 を上回った P-gp ノックアウトマウスにおいて 血漿中ダクラタスビルに対する脳中ダクラタスビルの AUC 比は 野生型マウスのそれの 3.5 倍 ( 静脈内投与時 ) 及び 5.4 倍 ( 経口投与時 ) であった ( 薬物動態試験概要表 Table B CTD ) これらの結果から P-gp はマウス脳へのダクラタスビルの移行を抑制することが示唆された 雌性 SD ラット ( 妊娠 18 日 ) に [ 14 C] ダクラタスビルを 30 mg/kg(100 μci/kg) の用量で単回経口投与し 放射能の組織分布を検討した ( 薬物動態試験概要表 Table A CTD ) その結果は 妊娠していない雌性ラットを用いた組織分布試験の結果と一致した 胎盤を含む母動物組織への放射能の移行は速やかで 組織中放射能は投与後 0.5 時間で検出され おおむね 2 時間で最高濃度に達した 胎児において 放射能は投与後 4 時間に肝臓でのみ検出され 血液を含む他の組織中の放射能は 全採取時点で定量下限未満であるか又は検出されなかった 母動物の血漿中放射能に対する組織中放射能の濃度比は 副腎 骨髄 眼窩外涙腺 ハーダー腺 腎臓 腎皮質 腎髄質 肝臓 心筋 膵臓 下垂体 唾液腺 脾臓 胃粘膜及び甲状腺で すべての採取時点で 1 を上回った 羊水 眼 水晶体 小脳 大脳 脳髄 嗅葉及び脊髄中の放射能は定量下限未満であった 投与後 24 時間で 羊膜嚢などの母動物組織のおよそ半分に放射能が残存し 投与後 48 時間では 16 種類の組織で放射能が残存していた これらのデータから [ 14 C] ダクラタスビル由来の放射能は胎盤を通過するものの 胎児組織への移行は抑制されることが示唆された 授乳中 ( 分娩後 4 日 ) の SD ラットに [ 14 C] ダクラタスビルを 30 mg/kg(100 μci/kg) の用量で単回経口投与し 乳汁中への放射能の移行を検討した ( 薬物動態試験概要表 Table B CTD ) その結果 乳汁中及び母動物血漿中の放射能は それぞれ投与後 4 及び 1 時間に最高濃度に達した なお 乳汁中及び母動物血漿中の放射能の T-HALF 及び AUC(INF) 値は 最終消失相がみられなかったため算出できなかった Cmax 及び AUC(0-72 h) 値を基に算出した乳汁中放射能 / 母動物血漿中放射能の曝露量比は それぞれ1.27 及び 1.55 であった これらのデータから ラットにおいてダクラタスビルとその代謝物は乳汁中に移行することが示され また ダクラタスビルの投与を受けている女性から授乳中の乳児は ダクラタスビルとその代謝物に曝露される

19 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 19 可能性のあることが示唆された

20 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 20 5 代謝 In vitro 及び in vivo において ダクラタスビルは多様な酸化物へと代謝された ダクラタスビルの主要な代謝反応として ピロリジン環の酸化的開環とその後の分子内環化 脱カルボキシメチル化及び水酸化が挙げられる ダクラタスビルの化学構造式を図 5-1 に示し 各種動物及びヒトにおける代謝物の構造式を薬物動態試験概要表の Table に示す ヒトに特有の代謝物は検出されなかった BMS 及び BMS の薬理活性を検討した結果 これら代謝物の薬理活性はダクラタスビルの 1/1000~1/10 であった 図 5-1 ダクラタスビルの化学構造式 O O NH N O N N H * * H N N O N HN O O * 14 C 標識位置を示す 5.1 In vitroでの代謝 β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸 (NADPH) の存在下で 肝ミクロソームにおけるダクラタスビルの代謝速度を検討した結果 ダクラタスビルの代謝速度はマウス ラット イヌ サル及びヒトで同程度であることが示された (3.6~6.8 pmol/min/mg protein) 肝細胞におけるダクラタスビルの代謝速度は マウス イヌ及びサル (31.7~52.6 pmol/min/10 6 cells) よりもラット及びヒト (5.6~7.0 pmol/min/10 6 cells) で遅かった ( 薬物動態試験概要表 Table A CTD ) 濃度 10 μm の [ 14 C] ダクラタスビルを NADPH 及び GSH 存在下で肝ミクロソーム ( マウス ラット ウサギ イヌ サル及びヒト ) と NADPH 存在下で肝 S9 画分 ( マウス ラット イヌ サル及びヒト ) と 又は肝細胞 ( マウス ラット イヌ サル及びヒト ) とそれぞれインキュベートし [ 14 C] ダクラタスビルの代謝を検討した ( 薬物動態試験概要表 Table B CTD ) その結果 肝ミクロソームにおける代謝は動物とヒトで同程度であり インキュベート後の試料中放射能の 73%~84% が未変化体であった マウス ラット イヌ及びヒト由来の肝細胞において インキュベート後の試料中放射能の 78%~89% が未変化体であったのに対し サル由来の肝細胞においては著しい代謝が起こり インキュベート後の試料中放射能の 57.5% が未変化体であった 肝ミクロソーム 肝 S9 画分及び肝細胞とのインキュベートで生成した 11 種類の代謝物は LC-MS/MS 法により同定された ヒトに特有な代謝物は認められなかった 動物種及びヒトで検出された主な代謝物として BMS BMS BMS ( ダクラタスビルの水酸化体 ) BMS ( ダクラタスビルの水酸化体 ) 及び M27( ダクラタスビルの一酸化物 ) が挙

21 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 21 げられる ヒト肝ミクロソーム及び特異的な阻害剤を用いた初期の反応表現型検査からは ダクラタスビル ( 濃度 0.5 μm) は主として CYP3A4 を介して代謝され BMS ( ヒト血漿中に検出された唯一の代謝物で ヒトの排泄物中で最も量の多い代謝物 ) は CYP2C9 を介しても生成される ( スルファフェナゾールにより 38% 阻害 ) 可能性が示された ( 薬物動態試験概要表 Table C CTD ) ヒト肝ミクロソーム及び特異的な阻害剤を用いた さらに包括的な反応表現型検査並びに遺伝子組換えヒト CYP 酵素を用いた試験から ダクラタスビル ( 濃度 2 及び 20 μm) から BMS への代謝は主として CYP3A4 を介して行われ (Km = 2.53 ± 0.34 μm) CYP3A5(Km = 9.14 ± 0.59 μm) もわずかながら寄与することが示された ( 薬物動態試験概要表 Table C CTD ) また CYP2C8 は BMS ( ヒト試料中で未検出の代謝物 ) の生成に寄与する主酵素であることが明らかになった なお これらの試験において CYP2C9 は BMS の生成を触媒せず スルファフェナゾールによる阻害は認めらなかった 5.2 In vivoでの代謝マウス ラット ウサギ イヌ サル及びヒトに [ 14 C] ダクラタスビルを単回経口投与し ダクラタスビルの代謝を検討した 各動物種及びヒトで検出された代謝物とその化学構造式を薬物動態試験概要表の Table に示す マウス雄性 rash2 マウスに [ 14 C] ダクラタスビルを 50 mg/kg の用量で単回経口投与し ダクラタスビルの代謝を検討した ( 薬物動態試験概要表 Table A CTD ) 投与後 1 及び 4 時間に採血して得られた血漿 並びに投与後 168 時間までの蓄尿及び糞便を放射能測定及び LC-MS/MS 法で分析し 代謝物を調べた 全体として マウスで 11 種類の酸化物が生成した その他にいくつかの小さな放射能ピークが認められたものの 同定には至らなかった 投与後 1 及び 4 時間の血漿中の主たる放射性物質は未変化体で 血漿中放射能の 75%~90% を占めた BMS 及び BMS が血漿中に検出され 血漿中放射能のそれぞれ 1.6%~4.0% 及び 2.1%~3.2% であった BMS の血漿中濃度は 投与後 1 及び 4 時間でそれぞれ 282 及び 352 ng eq./ml であった 他の数多くの微量代謝物も血漿中に検出され 血漿中放射能の 1.5%~6.7% を占めた 投与量の 0.8% 及び 18.4% がそれぞれ尿中及び糞便中に代謝物として回収された 血漿中と同様に 未変化体が尿中及び糞便中の主化合物で それぞれ投与量の 0.4% 及び 34% を占めた 尿中の主代謝物は BMS 及び M9 (BMS の脱カルボキシメチル化体 ) で それぞれ投与量の 0.4% 及び 0.2% 相当であった 糞便中の主代謝物は BMS 及び BMS で それぞれ投与量の 5.9% 及び 7.3% 相当であった 尿中の微量代謝物は BMS 及び BMS 糞便中の微量代謝物は BMS M6( ダクラタスビルの水酸化体 ) 及び M15( ダクラタスビルの一酸化物 ) であった 排泄物中で回収された BMS 及び M9( 二次代謝物 ) の総量は 投与量の 1.4% であった

22 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page ラット雄性 SD ラットに [ 14 C] ダクラタスビルを 30 mg/kg の用量で単回経口投与し ダクラタスビルの代謝を検討した ( 薬物動態試験概要表 Table A CTD ) 投与後 1 2 及び 4 時間に採血して得られた血漿 並びに投与後 168 時間までの蓄尿及び糞便を放射能測定及び LC-MS/MS 法で分析し 代謝物を調べた 全体として ラットで 8 種類の酸化物が生成した その他にいくつかの小さな放射能ピークが認められたものの 同定には至らなかった 投与後 1~4 時間の血漿中の主放射性化合物は未変化体で 血漿中放射能の 85%~88% を占めた BMS 及び BMS が血漿中に検出され 血漿中放射能のそれぞれ 2.6%~2.9% 及び 1.9%~3.0% を占めた 血漿中 BMS 濃度は 投与後 1 2 及び 4 時間でそれぞれ 及び 24.0 ng eq./ml であった その他に複数の種類の微量代謝物が血漿中に検出され 血漿中放射能の 0.3%~4.5% を占めた 投与量の 0.6% 及び 27% がそれぞれ尿中及び糞便中に代謝物として回収された 尿中及び糞便中の未変化体は それぞれ投与量の 0.8% 及び 24.5% を占めた BMS M9 及び BMS は 尿中の主代謝物であった BMS が糞便中の主代謝物で 投与量の 9.4% に相当した その他に複数の種類の微量代謝物が糞便中に検出され 投与量の約 2%~4.9% に相当した 排泄物から回収された BMS の総量は 投与量の 2.2% に相当した 雄性 BDC ラットに [ 14 C] ダクラタスビルを 30 mg/kg の用量で単回経口投与し ダクラタスビルの代謝を検討した ( 薬物動態試験概要表 Table B CTD ) 胆汁は投与後 48 時間かけて採取した その結果 投与放射能の 38.5% が胆汁中から回収され 胆汁中の未変化体は投与量の 11.5% 相当であった 胆汁中で最も量の多い代謝物は BMS で 投与量の 10.1% に相当した また 数多くの微量代謝物が検出され その量は投与量の 0.1%~2.5% に相当した ウサギ雌性ニュージーランドホワイトウサギに [ 14 C] ダクラタスビルを 40 mg/kg の用量で単回経口投与し ダクラタスビルの代謝を検討した ( 薬物動態試験概要表 Table A CTD ) 投与後 及び 12 時間で採血して得られた血漿 並びに投与後 168 時間かけて採取した糞便を放射能測定及び LC-MS/MS 法で分析し 代謝物を調べた 全体として ウサギで 16 種類の代謝物 (15 種類の酸化物及び 1 種類の水和物 ) が生成した その他にいくつかの小さな放射能ピークが認められたものの 同定には至らなかった 投与後 1 ~12 時間の血漿中の主たる放射性物質は未変化体で 血漿中放射能の 90%~93% を占めた BMS 及び BMS が血漿中に検出され 血漿中放射能のそれぞれ 1.2%~1.9% 及び 0.5%~0.8% であった BMS の血漿中濃度は 投与後 及び 12 時間でそれぞれ 及び 398 ng eq./ml で AUC(0-12 h) 値は 8121 ng eq. h/ml であった 他の数多くの微量代謝物も検出され その量は痕跡程度から血漿中放射能の 1.9% の範囲であった 投与量の 26.2% が代謝物として糞便中から回収された 糞便中の主化合物は未変化体で その量は投与量の 51.9% に相当した そのほかに数多くの微量代謝物が検出され 投与量の 0.6% から 3.6% に相当した 糞便中の BMS 及び M9( 二次代謝物 ) の総量は 投与量の 4.9% であった

23 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page イヌ雄性 BDC イヌに [ 14 C] ダクラタスビルを 50 mg/kg の用量で単回経口投与し ダクラタスビルの代謝を検討した ( 薬物動態試験概要表 Table B CTD ) 投与後 及び 8 時間で採血して得られた血漿 並びに投与後 72 時間かけて採取した尿 胆汁及び糞便を放射能測定及び LC-MS/MS 法で分析し 代謝物を調べた 全体として 10 種類の代謝物 (9 種類の酸化物及び 1 種類のグルクロン酸抱合体 ) が生成した 投与後 1.5~8 時間の血漿中の主たる放射性物質は未変化体で 血漿中放射能の 87.5%~93.9% を占めた BMS が痕跡程度検出された BMS も血漿中に検出され 血漿中放射能の 2.3% とわずかであった 他の微量代謝物も血漿中に検出され その量は痕跡程度から血漿中放射能の 2.9% の範囲であった 投与放射能の 24.5% 8.75% 及び 29.7% がそれぞれ胆汁中 尿中及び糞便中で回収された 胆汁中 尿中及び糞便中の主化合物は未変化体で それぞれ投与量の 12.5% 7.4% 及び 16.6% に相当した その他に複数の種類の微量代謝物が胆汁中 尿中及び糞便中に検出され その量は投与量の 0.1%~6% に相当した 排泄物中に検出された BMS は 投与量の 6% に相当した サル雄性カニクイザルに [ 14 C] ダクラタスビルを 30 mg/kg の用量で単回経口投与し ダクラタスビルの代謝を検討した ( 薬物動態試験概要表 Table A CTD ) 投与後 1 4 及び 8 時間で採血して得られた血漿 並びに投与後 168 時間かけて採取した尿及び糞便を放射能測定及び LC-MS/MS 法で分析し 代謝物を調べた 全体として サルで 9 種類の酸化物が生成した その他にいくつかの小さな放射能ピークが認められたものの 同定には至らなかった 投与後 1~8 時間の血漿中の主たる放射性物質は未変化体で 血漿中放射能の74.2%~85.6% を占めた 血漿中の代謝物は2 種類のみであった BMS が主代謝物で 投与後 1 4 及び 8 時間でそれぞれ血漿中放射能の 21.8% 17.8% 及び 14.4% を占めた BMS の血漿中濃度は 投与後 1 4 及び 8 時間でそれぞれ 及び 130 ng eq./ml であった もう一つの代謝物は M12 で 血漿中放射能の最大で 2.1% であった BMS は 血漿中に検出されなかった 投与量のうちの 1.1% 及び 26% が それぞれ尿中及び糞便中から代謝物として回収された 尿中及び糞便中の未変化体は それぞれ投与量の 0.5% 及び 32.3% を占めた 尿中及び糞便中の主代謝物は BMS で それぞれ投与量の 0.7% 及び 16.8% に相当した その他の代謝物は 最大で投与量の 2.2% であった 排泄物中の BMS は 投与量の 17.5% に相当した また 排泄物中の BMS は 投与量の 0.9% に相当した 雄性 BDC カニクイザルに [ 14 C] ダクラタスビルを 100 mg/kg の用量で単回経口投与し ダクラタスビルの代謝を検討した ( 薬物動態試験概要表 Table B CTD ) 胆汁は投与後 72 時間かけて採取した 投与放射能のうちの 14.7% が胆汁中から回収され 胆汁中の未変化体は投与量の 1.4% に相当した 胆汁中では 19 種類の微量代謝物が検出され その量は投与量の 0.1% か

24 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 24 ら 7.2% に相当した BMS は 胆汁中及び糞便中で投与量の 10.5% を占めた ヒト AI 試験で 6 例の健康被験者に [ 14 C] ダクラタスビル 25 mg(106.9 μci) を単回経口投与し ダクラタスビルの代謝を検討した ( 薬物動態試験概要表 Table A CTD ) 投与後 及び 12 時間で採血して得られた血漿 投与後 72 時間かけて採取した尿及び 144 時間かけて採取した糞便を放射能測定及び LC-MS/MS 法で分析し 代謝物を調べた 全体として ヒトで 8 種類の代謝物 (7 種類の酸化物及び 1 種類の水和物 ) が生成した 未変化体が投与後 1~12 時間の血漿中の主たる放射性物質で 血漿中放射能の 96.8%~100% を占めた 唯一の血漿中代謝物は BMS で 投与後 1 及び 2 時間でそれぞれ血漿中放射能の 1.4% 及び 2% を占め 投与後 4 8 及び 12 時間では痕跡程度の量であった AI 試験でダクラタスビル 25 mg を単回経口投与したとき ダクラタスビルの AUC 値に対する BMS の AUC 値の割合は約 5% であり また AI 試験でダクラタスビル 60 mg を 1 日 1 回 7 日間反復経口投与したとき ダクラタスビル曝露量に対する BMS 曝露量の割合は 2.80%(AUC 値を基に算出 ) 及び 3.59%(Cmax 値を基に算出 ) であった (CTD ) これらの試験結果から BMS は血中の微量代謝物であり 反復投与後のダクラタスビルに比べて蓄積しないことが示された AI 試験で ヒトにダクラタスビル 25 mg を単回経口投与したとき BMS は定量下限未満であった 一方 AI 試験で ヒトにダクラタスビル 60 mg を 1 日 1 回 7 日間投与したとき BMS のCmax 及び AUC(TAU) 値はそれぞれ 57.4 ng/ml 及び 370 ng h/ml であった 投与量のうちの 0.3% 及び 29.8% が それぞれ尿中及び糞便中から代謝物として回収された 未変化体は糞便中の主化合物で その量は投与量の 52.5% に相当した BMS は糞便中の主代謝物で その量は投与量の 15.2% に相当した その他の代謝物も検出され その量は投与量の 0.9%~4.0% に相当した 排泄物中から回収された BMS は 投与量の 15.4% に相当した BMS は投与量の 4.1% に相当した

25 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 25 6 排泄 ダクラタスビルの消失経路としては 糞便中排泄 代謝 胆汁中排泄及び腸内分泌などの複数 の経路が挙げられる 腎クリアランスは ダクラタスビルの主要な消失経路ではなかった 6.1 マウス雄性 rash2 マウスに [ 14 C] ダクラタスビルを 50 mg/kg の用量で単回経口投与し ダクラタスビルのマスバランスを検討した ( 薬物動態試験概要表 Table A CTD ) 投与後 168 時間までの放射能回収率は 92.4% で 尿中で 1.40% 糞便中では 87.4% が回収された 投与後 24 時間以内に投与量の 81%( 総回収率の 88%) が回収された 代謝試験において 投与量の 34% が未変化体として糞便中に検出されたことから ( 薬物動態試験概要表 Table A CTD ) 糞中排泄がマウスにおけるダクラタスビルの主要な消失経路であることが示唆された ただし 糞便中のダクラタスビルの一部は未吸収分である可能性がある 腎クリアランスは マウスにおけるダクラタスビルの主要な消失経路ではなかった また 代謝物として投与量の 0.8% 及び 18.4% がそれぞれ尿中及び糞便中に排泄された 合計で投与量の 19.2% が代謝物として回収されたことから 代謝クリアランスは マウスにおけるダクラタスビルの消失に寄与する経路であることが示唆された 6.2 ラット雄性 SD ラットに [ 14 C] ダクラタスビルを 30 mg/kg の用量で単回経口投与し ダクラタスビルのマスバランスを検討した ( 薬物動態試験概要表 Table B CTD ) 投与後 168 時間での放射能回収率は 96.3% で 尿中で 1.55% 糞便中では 91.1% が回収された 放射能の 74.4% が投与後 24 時間以内に糞便中に回収された 代謝試験において 投与量の 24.5% が未変化体として糞便中で回収されたことから ( 薬物動態試験概要表 Table A CTD ) 糞便中排泄がラットにおけるダクラタスビルの主要な消失経路であることが示唆された 雄性 BDC ラットに [ 14 C] ダクラタスビルを 30 mg/kg の用量で単回経口投与した結果 投与放射能の 1.22% 38.5% 及び 42.3% がそれぞれ尿中 胆汁中及び糞便中に投与後 48 時間以内に排泄された ( 薬物動態試験概要表 Table CTD ) 投与量の 11.5% 及び 5.3% がダクラタスビルとしてそれぞれ胆汁中及び糞便中で回収された 代謝物は 主として胆汁中及び糞便中にそれぞれ投与量の 21.8% 及び 14.2% が排泄され 尿中には投与量の 0.4% が排泄された ( 薬物動態試験概要表 Table B CTD ) このことから 無処置ラットにおける糞便中放射能回収率 91.1% は 代謝物の胆汁中及び糞便中排泄によるものであることが示唆された 別の試験で BDC ラットに非標識ダクラタスビルを 5 mg/kg の用量で静脈内投与した結果 投与後 24 時間でダクラタスビルは主に胆汁中 ( 投与量の 29.5%) 及び糞便中 ( 投与量の 27.2%) に排泄され 尿中 ( 投与量の 0.49%) にはわずかに排泄された ( 薬物動態試験概要表 Table CTD ) また 投与量の 53% が代謝物 (BMS 及び BMS ) として胆汁中に排泄され 糞便中及び尿中にはそれぞれ投与量の 5.5% 及び 1.65% が排泄された ダクラタスビル

26 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 26 静脈内投与後の BDC ラットの腸管内にダクラタスビルが存在したことから P-gp 又は他のトランスポーターによる能動的な腸管への汲み出しの関与が示唆された 要約すると ラットにおいて ダクラタスビルは糞便中排泄 腸内分泌及び代謝 ( 代謝物の胆汁中及び糞便中排泄 ) により消失した 腎クリアランスは ラットにおけるダクラタスビルの主要な消失経路ではなかった 6.3 ウサギ雌性ニュージーランドホワイトウサギに [ 14 C] ダクラタスビルを 40 mg/kg の用量で単回経口投与し ダクラタスビルのマスバランスを検討した ( 薬物動態試験概要表 Table C CTD ) 投与後 168 時間での放射能回収率は 92.4% で 尿中で 0.73% 糞便中では 91.6% が回収された 投与後 48 時間以内に投与放射能の 81.4% が回収された 代謝試験において 投与量の 51.9% が未変化体として糞便中に検出されたことから ( 薬物動態試験概要表 Table A CTD ) 糞便中のダクラタスビルの一部は未吸収分である可能性があるものの 糞便中排泄がウサギにおけるダクラタスビルの主要な消失経路であることが示唆された また 投与量の 26.2% の代謝物が糞便中に検出されたことから 代謝クリアランスは ウサギにおけるダクラタスビルの消失に寄与する経路であることが示唆された 腎クリアランスは ダクラタスビルの主要な消失経路ではなかった 6.4 イヌ雄性 BDC イヌに [ 14 C] ダクラタスビルを 50 mg/kg の用量で単回経口投与した結果 投与放射能の 24.5% 29.7% 及び 8.75% がそれぞれ胆汁中 糞便中及び尿中に投与後 72 時間で排泄された ( 薬物動態試験概要表 Table CTD ) 投与量の 12.5% 16.6% 及び 7.4% が未変化体としてそれぞれ胆汁中 糞便中及び尿中に排泄されたことから 胆汁中及び糞便中排泄がイヌにおけるダクラタスビルの主要な消失経路であることが示唆された また 代謝物として投与量の 7.5% 8.5% 及び 0.7% がそれぞれ胆汁中 糞便中及び尿中に排泄された 合計で投与量の 16.7% が代謝物として排泄されたことから 代謝クリアランスは イヌにおけるダクラタスビルの消失に寄与する経路であることが示唆された ( 薬物動態試験概要表 Table B CTD ) 別の試験で BDC イヌに非標識ダクラタスビルを 1 mg/kg の用量で静脈内投与した結果 投与後 72 時間でダクラタスビルは主に胆汁中 ( 投与量の 11.4%) 及び糞便中 ( 投与量の 8.05%) に排泄され 尿中 ( 投与量の 0.26%) にはほとんど排泄されなかった ( 薬物動態試験概要表 Table CTD ) また 代謝物の BMS として 投与量の 44% が胆汁中に排泄され 糞便中及び尿中にはそれぞれ投与量の 5.8% 及び 0.57% が排泄された ダクラタスビル静脈内投与後の BDC イヌの腸管内にダクラタスビルとその代謝物が存在したことから P-gp 又は他のトランスポーターによる能動的な腸管への汲み出しの関与が示唆された 要約すると イヌにおいて ダクラタスビルは糞便中排泄 胆汁中排泄 腸内分泌及び代謝 ( 代謝物の胆汁中及び糞便中排泄 ) により消失した 腎クリアランスは イヌにおけるダクラタスビルの主要な消失経路ではなかった

27 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page サル雄性カニクイザルに [ 14 C] ダクラタスビルを 30 mg/kg の用量で単回経口投与し ダクラタスビルのマスバランスを検討した ( 薬物動態試験概要表 Table D CTD ) 投与後 168 時間での投与放射能の回収率は 90.5% で 尿中で 1.35% 糞便中で 69.4% 及びケージ残渣では 19.5% が回収された 投与後 24 時間以内に放射能の 20.1% 投与後 48 時間以内には放射能の 58.9% が回収された 代謝試験において 投与量の 32.3% が未変化体として糞便中に検出されたことから ( 薬物動態試験概要表 Table A CTD ) ラットと同様に 糞便中排泄がサルにおける主要な消失経路であることが示唆された ただし 糞便中のダクラタスビルの一部は未吸収分である可能性がある また 代謝物として投与量の 1.1% 及び 26% がそれぞれ尿中及び糞便中に排泄された 合計で投与量の 27.1% が代謝物として排泄されたことから 代謝クリアランスは サルにおけるダクラタスビルの消失に寄与する経路であることが示唆された 雄性 BDC サルに [ 14 C] ダクラタスビルを 100 mg/kg の用量で単回経口投与した結果 投与後 72 時間までに投与放射能の 4.53% 14.7% 及び 52.5% がそれぞれ尿中 胆汁中及び糞便中に排泄された ( 薬物動態試験概要表 Table CTD ) 投与量の 0.1% 1.4% 及び 12.3% がそれぞれ尿中 胆汁中及び糞便中に未変化体として排泄された また 投与量の 3.3% 11.7% 及び 17.9% がそれぞれ尿中 胆汁中及び糞便中に代謝物として排泄された 合計で投与量の 32.9% が代謝物として排泄されたことから 上記のカニクイザルの試験と同様に 代謝クリアランスはサルにおけるダクラタスビルの消失に寄与する経路であることが示唆された ( 薬物動態試験概要表 Table B CTD ) なお BDC サルの糞便中放射能回収率 52.5% は [ 14 C] ダクラタスビルの不完全吸収 [ 無処置サルの経口バイオアベイラビリティ :38%( 薬物動態試験概要表 Table D CTD )] 又はその代謝物の腸内分泌に起因する可能性がある 別の試験で 雄性 BDC サルに非標識ダクラタスビルを 1 mg/kg の用量で静脈内投与した結果 未変化体として投与量の 6.9% 1.9% 及び 0.11% がそれぞれ胆汁中 糞便中及び尿中に排泄された ( 薬物動態試験概要表 Table CTD ) 代謝物は主に胆汁中に排泄され ( 投与量の 58.1%) 糞便中及び尿中にはそれぞれ投与量の 10.5% 及び 1.86% が排泄された ダクラタスビル静脈内投与後の BDC サルの腸管内にダクラタスビルとその代謝物が存在したことから P-gp 又は他のトランスポーターによる能動的な腸管への汲み出しの関与が示唆された 要約すると サルにおいて ダクラタスビルは主に糞便中排泄及び代謝 ( 代謝物の胆汁中排泄 ) により消失した サルにおける薬物関連物質の消失速度は ラットのそれよりも遅かった 腎クリアランスは ダクラタスビルの主要な消失経路ではなかった 6.6 ヒト AI 試験で 6 例の健康被験者に [ 14 C] ダクラタスビル 25 mg を単回経口投与し ダクラタスビルのマスバランスを検討した ( 薬物動態試験概要表 Table E CTD ) 投与放射能の回収率は投与後 240 時間で 94.24%( 尿中 6.60% 糞便中 87.63%) で 投与後 24 時間以内に投与放射能の 14.2% 投与後 72 時間以内に 77% 投与後 120 時間以内には 93% が回収された 投与量の 52.5% が未変化体として糞便中に検出されたことから ( 薬物動態試験概要表 Table

28 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page A CTD ) ラット及びサルと同様に ヒトにおいて 糞便中排泄がダクラタスビルの主要な消失経路であることが示唆された ダクラタスビルがラット及びサルの胆汁中に検出されたことから ヒトでもダクラタスビルの胆汁中排泄が起こる可能性があり また ヒト糞便中に検出されたダクラタスビルは 体内に吸収後排泄されたダクラタスビルと体内に吸収されなかったダクラタスビルとが合わさったものである可能性がある 要約すると ヒトにおいて ダクラタスビルは糞便中排泄及び代謝 ( 代謝物の糞便中排泄 ) により消失した

29 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 29 7 薬物動態学的薬物相互作用 In vitro において ダクラタスビルが各種の CYP 酵素及びトランスポーターの基質 誘導剤又は阻害剤であるかを評価した その結果 CYP3A4 がダクラタスビルの代謝を担う主酵素であることが確認された ( 薬物動態試験概要表 Table C CTD ) BMS ( ヒト血漿中に検出された唯一の代謝物かつヒト排泄物中で最も量の多い代謝物 ) は CYP3A5(Km = 9.14 ± 0.59 μm) によりわずかながら生成したが 主として CYP3A4(Km = 2.53 ± 0.34 μm) により生成した ( 薬物動態試験概要表 Table C CTD ) ダクラタスビルは P-gp の基質であるが BCRP MRP2 OATP1B1 OATP1B3 及び OATP2B1 の基質ではなかった ( 薬物動態試験概要表 Table B Table G H 及び F CTD CTD CTD 及び CTD ) したがって ダクラタスビルと CYP3A 及び P-gp の阻害剤又は誘導剤を併用投与すると 薬物相互作用が起こる可能性がある In vitro において ダクラタスビル ( 濃度 50 μm) はヒトプレグナン X 受容体を活性化させた [ 陽性対照のリファンピシン ( 濃度 10 μm) で引き起こされたトランス活性化の 13.6% 相当 ]( 薬物動態試験概要表 Table C CTD ) ヒト肝細胞において ダクラタスビルは CYP1A2 を誘導しなかったが CYP3A4 及び CYP2B6 の mrna レベルを用量に依存して増加させた ( 薬物動態試験概要表 Table D CTD 及び CTD ) FDA の薬物相互作用に関するガイダンス ( 案 ) 3) で説明されているベーシックモデル (CYP3A4 及び CYP2B6 の解析 ) 及びメカニスティックスタティックモデル (CYP2B6 の解析 ) を用いてこれらデータを解析した結果 ダクラタスビルは CYP3A4 の誘導剤であったが CYP2B6 の阻害剤ではなかった (CTD )

30 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 30 In vitro において ダクラタスビルが各種の CYP 酵素及びトランスポーターの基質 誘導剤又 は阻害剤であるかを評価した試験結果を表 7-1 に示す 表 7-1 In vitro における薬物代謝酵素及びトランスポーターの阻害剤としてのダクラタ スビルの評価の要約 酵素 / トランスポーター IC 50 (μm) 備考 CYP3A 11, 31.8 ヒト肝ミクロソームを用いた試験データ ダクラタスビルは 可逆的かつ時間依存的な CYP3A 阻害作用を有する CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 > 40 ヒト肝ミクロソームを用いた試験データ UGT1A ジゴキシントランスポーター 4.4 Caco-2 細胞を用いた試験データ P-gp > 7 濃度 7 μm での阻害率は 18.7% であった BCRP 10.9 ± 8.6 MRP2 32 ± 7.7 OATP1B1 2.3 OATP1B3 5.7 ± 1.3 OATP2B ± 4.0 NTCP 濃度 16 μm まで NTCP を阻害せず OAT1 > 8 最高試験濃度 8 μm での阻害率は 27.9% であった OAT3 > 8 最高試験濃度 8 μm での阻害率は 25.8% であった OCT1 1.4 OCT2 7.3 BSEP 6.39 出典 :CTD CTD CTD CTD CTD CTD CTD CTD CTD CTD 遺伝子組換え CYP 酵素及び蛍光プローブを用いた予備試験で ダクラタスビルは CYP2C9 及び CYP3A の阻害剤であることが示され IC 50 値はそれぞれ 16.1 μm 及び 7.9~14.8 μm であった ( 薬物動態試験概要表 Table A CTD ) ヒト肝ミクロソームを用いた最終試験において ダクラタスビルは CYP3A を阻害し ミダゾラム及びテストステロンを基質としたときの IC 50 値は それぞれ 31.8 及び 11.0 μm であった その他の CYP 酵素 CYP1A2 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C19 及び CYP2D6 の IC 50 値は 40 μm を上回った ( 薬物動態試験概要表 Table B CTD ) また ヒト肝ミクロソームとダクラタスビルを 30 分間プレインキュベートすると IC 50 値は 31.8 μm( 指標反応 : ミダゾラム 1'- 水酸化 ) から 13.5 μm 及び 11.0 μm ( 指標反応 : テストステロン 6β- 水酸化 ) から 8.9 μm に変わったことから ダクラタスビルは CYP3A を時間依存的に阻害することが示された さらに ダクラタスビルはヒト肝ミクロソームの UGT1A1 を阻害し IC 50 値は 12.7 μm であった ( 薬物動態試験概要表 Table E CTD ) ダクラタスビルは Caco-2 細胞におけるジゴキシン輸送を阻害し MDR1 発現 MDCK 細胞における P-gp を阻害したことから ( 薬物動態試験概要表 Table I 及び Table J CTD

31 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 及び CTD ) ダクラタスビルが P-gp の基質である化合物の吸収及び分布を変化させる可能性がある また ダクラタスビルは 吸収 分布及び排泄に関与する各種トランスポーター BCRP MRP2 OATP2B1 OATP1B1 OATP1B3 OCT1 OCT2 OAT1 OAT3 及び BSEP を阻害した ( 薬物動態試験概要表 Table K Table L Table M Table N Table O Table P 及び Table Q CTD CTD CTD CTD CTD CTD 及び CTD ) NTCP の阻害は認められなかった ( 薬物動態試験概要表 Table Q CTD ) FDA の薬物相互作用に関するガイダンス ( 案 ) 3) 及び International Transporter Consortium の白書 4) に基づくと IC 50 値に対する遊離型ダクラタスビルの Cmax 値の比が 0.1 未満であるため ダクラタスビルと OAT1 OAT3 OCT1 及び OCT2 の基質との相互作用は生じないものと考えられる なお AI 試験で HCV 患者にダクラタスビル 60 mg を反復投与したときの総ダクラタスビル ( 結合型 + 遊離型 ) の Cmax 値 2.34 μm(1.73 μg/ml) を評価で使用した しかしながら P-gp BCRP OATP1B1 OATP1B3 及び BSEP に関しては IC 50 値に対する遊離型ダクラタスビルの Cmax 値の比が 0.1 以上であるため ダクラタスビルとこれらトランスポーターの基質との相互作用は起こる可能性がある OATP2B1 及び NTCP の基質との相互作用は起こらないと考えられる 吸収相では薬物濃度が高いため P-gp 又は BCRP の基質との薬物相互作用は起こる可能性がある

32 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 32 8 考察及び結論マウス ラット イヌ及びサルにおけるダクラタスビルの経口吸収は速やかで サルを除いたマウス ラット及びイヌにおける絶対バイオアベイラビリティは 50% 以上と高かった また ヒトにおける絶対バイオアベイラビリティは 67% と良好であった In vitro 及び in vivo 試験データから ダクラタスビルは P-gp の基質であることが示された ダクラタスビルは P-gp の基質であるものの ダクラタスビルの経口吸収は 試験した用量及び大部分の動物種において良好であった イヌにおけるダクラタスビルの吸収は ph に依存しており ヒトへのファモチジン投与によりダクラタスビルの Cmax 値及び AUC(INF) 値がそれぞれ 44% 及び 18% 低下した試験結果 (AI 試験 ) 並びにヒトへのオメプラゾール投与によりダクラタスビルの Cmax 値及び AUC(INF) 値がそれぞれ 20%~36% 及び 16% 低下した試験結果 (AI 試験 ) と一致した ダクラタスビルは ヒト (60 mg 反復経口投与後の T-HALF = 14 時間 ) よりもマウス ラット イヌ及びサル (T-HALF = 1.1~4.7 時間 ) で速やかに消失した 肝細胞におけるダクラタスビルの代謝速度はマウス イヌ及びサルよりもヒトで遅かったことから ヒトにおけるダクラタスビルの長い消失半減期は 遅い代謝速度が原因である可能性がある ダクラタスビルの血清蛋白結合率は すべての動物種及びヒトで同程度であり 95.1%~99.5% の範囲であった ダクラタスビル ( 濃度 0.1~10 μm) の in vitro ヒト血漿蛋白結合率は 97.7%~ 98.0% で 濃度に依存しなかった 濃度 1 μm(0.739 μg/ml) は HCV 感染患者にダクラタスビル 60 mg を反復投与したときの Cmax 値 2.34 μm(1.73 μg/ml) に最も近いことから 濃度 1 μm (0.739 μg/ml) のダクラタスビルのヒト血漿蛋白結合率 (98.0 ± 0.1%) が ダクラタスビルのヒト血漿蛋白結合率の代表値であると判断された したがって 蛋白結合の違いによるダクラタスビルの体内動態の種差はないと考えられた ダクラタスビル ( 濃度 0.1~10 μm) の in vitro ヒト血漿蛋白結合率 (97.7%~98.0%) 又は ex vivo ヒト血漿蛋白結合率 (98.9%~99.3%) に比べて ダクラタスビル ( 濃度 10 μm) の in vitro ヒト血清蛋白結合率 (95.6%) は低かったが 実験上のばらつきに起因する可能性がある AI 試験において ダクラタスビルの ex vivo 血漿蛋白結合率は 健康被験者と HCV 感染患者で同程度であり 血漿試料中のダクラタスビル濃度の違いによる影響を受けなかった ダクラタスビルの血漿中濃度に対する血液中濃度は ヒトで 0.77 ~0.82 各種試験動物では 0.56~1.08 であったことから 血液中のダクラタスビルは優先的に血漿中に分布することが示唆された マウス ラット イヌ及びサルにおいて ダクラタスビルの Vss 値は全身水分量よりも大きかったことから ダクラタスビルは血管外に分布することが示唆された 雌雄ラットに [ 14 C] ダクラタスビルを単回及び反復経口投与したとき 放射性物質 ( ダクラタスビルとその代謝物 ) は 組織中に速やかに また広範に分布し 血漿中濃度に対する組織中濃度の比は多数の組織で 1 を上回った 血漿中濃度に対する肝臓中濃度の比は 単回及び反復投与後でそれぞれ 5~14 及び 5~21 であった マウス及びラット脳への放射能の移行はわずかであったことから P-gp はダクラタスビルとその代謝物の脳への移行を抑制する役割を担うものと考えられる なお [ 14 C] ダクラタスビルの反復投与後に 放射能の蓄積は認められなかった Long-Evans ラットの有色皮膚及び眼ブドウ膜からの [ 14 C] ダクラタスビルの消失速度は SD ラットに比べて遅かった 放射能濃度は投与後

33 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 時間まで測定可能であったことから 組織に含まれるメラニンに対する [ 14 C] ダクラタスビル由来放射能の特異的で可逆的な結合が示唆され これはダクラタスビルの塩基性及び親油性の性質に起因する可能性がある このような物理化学的諸性質が 有色ラットにおける薬物とメラニンの結合に関与することが文献 5) で報告されているが 薬物とメラニンの結合と有害作用との間 に直接的な因果関係はなく 薬物とメラニンの結合は眼毒性との関連性がないことが文献 6) で報 告されており ダクラタスビルの単回経口投与光毒性試験では Long-Evans ラットの眼及び皮膚に光毒性は認められなかった (CTD ) 妊娠ラットに [ 14 C] ダクラタスビルを経口投与した結果 放射能は投与後 4 時間で胎児の肝臓のみに検出された この試験結果から わずかな量のダクラタスビルとその代謝物が胎盤を通過することが示唆された 授乳中のラットに [ 14 C] ダクラタスビルを経口投与した結果 血漿中放射能に対する乳汁中放射能の AUC 比は 1.55 であったことから ダクラタスビルとその代謝物はラット乳汁中に移行することが示された この試験結果から ダクラタスビルの投与を受けている女性から授乳中の乳児は ダクラタスビルとその代謝物に曝露される可能性があることが示唆された ダクラタスビルは 多様な酸化物に代謝される しかしながら ヒトにおいては 酸化物の BMS が血漿中に検出された唯一の代謝物であった この代謝物は主として CYP3A4 により生成された ヒトに特有の代謝物は認められなかった In vitro 又は in vivo において ダクラタスビルの GSH 付加体は検出されなかったことから 活性代謝物は生成しないと考えられる ラット イヌ サル及びヒトのミクロソーム蛋白と放射性物質のわずかな不可逆的結合が確認された 無処置動物 ( マウス ラット ウサギ サル ) 及び BDC 動物 ( ラット イヌ サル ) において それぞれ投与量の 19%~28% 及び 17%~36% が代謝物として回収された 未変化体が動物血漿中の主化合物で 血漿中放射能の 74%~94% を占めた ヒトにおいて 代謝物として回収されたダクラタスビルは投与量の 30.1% を占め 動物のそれと同程度であり 未変化体が血漿中の主化合物で 血漿中放射能の 97%~100% を占めた BMS はヒト血漿中に検出された唯一の代謝物で 血漿中放射能の 2% と微量であった AI 試験でヒトにダクラタスビルを単回投与したとき 未変化体の AUC に対する代謝物 BMS の AUC の割合は約 5% であり また AI 試験でダクラタスビルを反復投与したときには 5% 未満であったことから BMS は蓄積しないことが示された 動物に [ 14 C] ダクラタスビルを単回経口投与したとき BMS はサル血漿中の主代謝物で 血漿中放射能の 14%~22% を占めたが マウス ラット及びウサギ血漿中では BMS は微量代謝物で それぞれ血漿中放射能の 1.6%~4% 2.6%~2.9% 及び 1.2%~1.9% を占めた イヌにおいて BMS は放射能検出法により定量できなかった ( 質量分析法でのみ検出可能 ) 各種動物に[ 14 C] ダクラタスビルを単回経口投与したときの血漿中 BMS 濃度に基づくと BMS はマウス ラット ウサギ及びサルの血漿中に安全性を評価する上で十分な量存在した また 反復経口投与毒性試験結果に基づくと BMS はイヌ血漿中に安全性を評価する上で十分な量存在した さらに 反復経口投与毒性試験から ヒト血漿中では定量下限未満の代謝物である BMS が サル血漿中濃度よりも高い濃度でイヌ血漿中に存在することが示された すなわち BMS のヒト血漿中濃度は イヌより

34 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 34 もサルの血漿中濃度と同程度であった このことから 当初はイヌが毒性試験の非げっ歯類動物種として選択されたが その後実施された長期投与試験ではサルが選択された ヒト及び動物における代謝物曝露量の詳細な比較検討は 毒性試験の概要文 (CTD 2.6.6) に記載した サル及びヒトにおける代謝の大部分が BMS への代謝であり BMS はサル及びヒトの排泄物中でそれぞれ投与量の 17.5% 及び 15.4% を占めたが マウス及びラットでは比較的少なく マウス及びラットの排泄物中でそれぞれ投与量の 1.2% 及び 2.2% を占めた BMS はサル及びヒトで比較的少ない量の代謝物であったが マウス及びラットでは主要な代謝物であり 排泄物中で投与量の 7.4%~9.8% を占めた ダクラタスビルの消失経路として 糞便中排泄 代謝クリアランス 胆汁クリアランス 腸内分泌及び腎クリアランスが挙げられる ダクラタスビルの糞便中排泄は 動物 ( マウス ラット ウサギ及びサルでそれぞれ投与量の 34% 24.5% 51.9% 及び 32.3%) よりもヒト ( 投与量の 52.5%) で多かった ダクラタスビルの代謝クリアランスは ヒト ( 投与量の 30.1%) と動物 ( 投与量の 19.2%~27.5%) で同程度であった また 胆汁クリアランスはダクラタスビルとその代謝物の主要な消失経路で BDC ラット BDC イヌ及び BDC サルの胆汁中に投与量の相当部分が未変化体 ( それぞれ投与量の 11.5% 12.5% 及び 1.4%) 及び代謝物 ( それぞれ投与量の 21.8% 7.5% 及び 11.7%) として排泄された ダクラタスビルはラット イヌ及びサルの胆汁中に検出されたため ヒトでもダクラタスビルの胆汁中排泄が起こる可能性がある BDC ラット BDC イヌ及び BDC サルにダクラタスビルを静脈内投与したとき 投与量の 27.2% 8.05% 及び 1.9% が未変化体として糞便中に排泄されたことから ダクラタスビルの腸内分泌は P-gp 又は他のトランスポーターに起因することが示唆された したがって 糞便中のダクラタスビルは 不完全な吸収のみならず胆汁中排泄及び腸内分泌が原因である可能性がある 尿中から未変化体として回収された量は 動物で投与量の 0.73%~1.55% ヒトでは 6.60% であったことから 腎クリアランスはダクラタスビルのマイナーな消失経路であることが示された ダクラタスビルは各種の代謝酵素及びトランスポーターの基質であった ダクラタスビルは P-gp の基質であるが BCRP MRP2 OATP1B1 OATP1B3 又は OATP2B1 の基質ではない したがって ダクラタスビルと P-gp の阻害剤又は誘導剤との併用投与は薬物相互作用の原因となる可能性がある ダクラタスビル ( ヒトで投与量の約 30%) の消失が代謝クリアランスに依存することは 他の薬剤によるダクラタスビル代謝の変化が薬物相互作用につながる可能性を高める いくつもの代謝経路がダクラタスビルの代謝に関与するものの CYP3A4 がダクラタスビルの代謝に関与する主たる酵素であることが示された これらは臨床試験にて確認された すなわち (i) ケトコナゾール (CYP3A4 及び P-gp の強力な阻害剤 ) を投与した健康被験者において ダクラタスビルの Cmax 値及び AUC 値はそれぞれ 1.57 及び 2.95 倍に増加し (AI 試験 ) (ii) リファンピシン (CYP3A4 及び P-gp の強力な誘導剤 ) を投与した被験者において ダクラタスビルの Cmax 値及び AUC 値はそれぞれ 56% 及び 79% 低下し (AI 試験 ) また エファビレンツ (CYP3A4 及び P-gp の誘導剤 ) を投与した被験者において ダクラタスビルの Cmax 値及び AUC 値はそれぞれ 17% 及び 32% 低下した (AI 試験 ) ダクラタスビルは CYP3A に対して弱い阻害作用を有し テストステロン及びミダゾラムを基

35 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 35 質としたときの IC 50 値は 11 及び 31.8 μm であった 肝細胞を用いた誘導試験データ及びベーシック又はメカニスティックスタティックモデルに基づくと ダクラタスビルは CYP3A4 の誘導剤であったが CYP1A2 及び CYP2B6 の誘導剤ではなかった AI 試験において ダクラタスビル ( 反復投与 ) と CYP3A の高親和性基質であるミダゾラム ( 経口投与 ) との間で薬物相互作用は生じなかったことから ダクラタスビルは CYP3A を介した相互作用により CYP3A 基質の曝露量に影響を及ぼさないことが示唆された なお 臨床試験において 高ビリルビン血症 [ 総ビリルビン又は間接ビリルビン (UGT1A1 基質 ) の上昇 ] とダクラタスビル曝露量との間に明確な相関性が認められなかったため ダクラタスビルによる UGT1A1 の in vitro 阻害は in vivo ではみられなかった In vitro において ダクラタスビルは Caco-2 細胞におけるジゴキシン輸送 (IC 50 = 4.4 μm) 及び MDR1 発現 MDCK 細胞における P-gp(IC 50 > 7 μm) を阻害した ダクラタスビルは 薬物の吸収 分布及び排泄に関与するいくつかのトランスポーターを阻害した 総ダクラタスビル ( 結合型ダクラタスビル+ 遊離型ダクラタスビル ) の曝露量又は遊離型ダクラタスビルの曝露量と IC 50 値との比較から ダクラタスビルは P-gp BCRP OATP1B1 OATP1B3 及び BSEP の基質との薬物相互作用を引き起こすと予測された 一方 ダクラタスビルは NTCP OATP2B1 OAT1 OAT3 OCT1 及び OCT2 の基質との薬物相互作用を引き起こさないと予測された ヒトでの薬物相互作用試験 (AI 試験 ) において P-gp の高親和性基質であるジゴキシンの曝露量に及ぼすダクラタスビルの影響は 軽度から中程度 [AUC(TAU): 1.27 倍増加 Cmax: 1.65 倍増加 ] であった また 別の薬物相互作用試験 (AI 試験 ) において OATP1B1 OATP1B3 及び BCRP 基質のロスバスタチンの曝露量に及ぼすダクラタスビルの影響は 軽度 [ AUC(INF): 1.58 倍増加 Cmax: 2.04 倍増加 ] であった AI 試験で 健康被験者にダクラタスビルとアスナプレビル (OATP の基質 ) を併用投与したところ アスナプレビルの曝露量に及ぼすダクラタスビルの影響はわずかであったが AI 試験で 健康被験者にリファンピシン (OATP 阻害剤 ) とアスナプレビルを併用投与したところ アスナプレビルの曝露量は増加した (Cmax: 21.1 倍増加 AUC: 14.8 倍増加 ) これらのデータに基づくと P-gp BCRP 又は OATP の他の基質の PK に及ぼすダクラタスビルの影響は 臨床上わずかであると予測された ダクラタスビルは アスナプレビルと併用投与される ヒトにおいて ダクラタスビルは主に CYP3A4 を介した代謝により消失する In vitro において ダクラタスビルは P-gp の基質 CYP3A の誘導剤かつ阻害剤 P-gp BCRP 及び OATP の阻害剤である 同様に アスナプレビルはヒトで主に CYP3A を介した代謝により消失し P-gp 及び OATP の基質かつ阻害剤であり CYP3A の誘導剤かつ阻害剤である これらのデータから ダクラタスビルとアスナプレビルを併用投与した場合 薬物相互作用が起こる可能性が示唆された しかしながら 臨床試験において ダクラタスビル (AI 試験 :1 日 1 回 30 mg AI 試験 :1 日 1 回 60 mg) とアスナプレビル (AI 及び AI 試験 :1 日 2 回 200 mg) を併用投与した結果 健康被験者及び HCV 感染患者に臨床的意義のある薬物相互作用が認められなかった 要約すると 動物において ダクラタスビルは十分に吸収され 経口で生物学的に利用可能であり 体内に広範に分布した ダクラタスビルの消失には 酸化的代謝 胆汁クリアランス 糞

36 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 36 便中排泄及び腸内分泌などの複数の経路が関与する ヒトに特有の代謝物は認められなかった 動物及びヒトにおいて ダクラタスビルが血漿中の主化合物であった In vitro データに基づくと トランスポーターを介した薬物相互作用や CYP3A 及び P-gp の阻害剤又は誘導剤との薬物相互作用が予測されたものの ヒトでの薬物相互作用試験では軽度の薬物相互作用のみが観察された

37 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験の概要文 Page 37 9 参考文献 1) 2) 3) 4) 5) 6) Davies B, Morris T. Physiological parameters in laboratory animals and humans. Pharm Res 1993; 10: Marino A M, Yarde M, Patel H, et al. Validation of the 96 well Caco-2 cell culture model for high throughput permeability assessment of discovery compounds. Intl J Pharmaceut 2005; 297: FDA Guidance for industry: Drug interaction studies- Study design, data analysis, implications for dosing, and labeling recommendations. Draft Guidance, February Giacomini et al. Membrane transporters in drug development. Nature Reviews. 2010; 9: Zane PA, Brindle SD, Gause DO et al., Physicochemical factors associated with binding and retention of compounds in ocular melanin of rats: correlation using data from whole-body autoradiography and molecular modeling for multiple linear regression analyses. Pharmaceutical Research, 1990; 7: Leblanc B, Jezequel S, et al., Binding of drugs to eye melanin is not predictive of ocular toxicity. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 1998; 28:

38 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 1 CTD 第 2 部 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 薬物動態試験概要表 ブリストル マイヤーズ株式会社

39 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 2 目次 1 薬物動態試験 : 一覧表 分析方法及びバリデーション試験 薬物動態試験 : 単回投与後の吸収 薬物動態試験 : 反復投与後の吸収 薬物動態試験 : 分布 薬物動態試験 : 蛋白結合 薬物動態試験 : 妊娠又は授乳動物における試験 薬物動態試験 : その他の分布試験 薬物動態試験 :In vivo での代謝 薬物動態試験 :In vitro での代謝 薬物動態試験 : 推定代謝経路 薬物動態試験 : 薬物代謝酵素の誘導 / 阻害 薬物動態試験 : 累積排泄 薬物動態試験 : 胆汁中排泄 薬物動態試験 : 薬物相互作用 薬物動態試験 : その他... 88

40 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 3 1 薬物動態試験 : 一覧表 Table : Type of Study Pharmacokinetics: Overview Test System Method of Administration Testing Facility Test Article: Daclatasvir Study Number / DCN Location Absorption Single-dose PK Mouse IV, oral BMS NA / CTD Single-dose PK Rat IV, oral, intraportal BMS NA / CTD Single-dose PK Dog IV, oral BMS NA / CTD Single-dose PK Monkey IV, oral BMS NA / CTD Membrane permeability PAMPA, Caco-2 cells NA BMS NA / CTD Human BCRP substrate MDCK cells NA BMS NA/ CTD Human MRP2 substrate Membrane vesicles from SF-9 cells NA BMS NCPK 22 / CTD Distribution In vitro serum protein binding Mouse, rat, rabbit, dog, monkey, and human NA BMS NA / CTD In vitro plasma protein binding Human NA NCPK 52 / CTD Blood cell partitioning Mouse, rat, dog, monkey, and human NA BMS NA / CTD Tissue distribution (Single dose), QWBA Rat (male) Oral 20N-0711 / CTD Tissue distribution(single and multiple doses), QWBA Rat (male and female) Oral NCPK 26/ CTD Tissue distribution, QWBA Pregnant rat Oral NCPK 26/ CTD Organ distribution, Mouse IV, oral BMS NA / CTD Organ distribution Rat IV, oral BMS NA / CTD Organ distribution Dog Oral BMS NA / CTD Organ distribution Monkey Oral BMS DM07005 / CTD Distribution into milk Rat Oral NCPK 26/ CTD Placental transfer Rat Oral NCPK 26/ CTD Hepatocyte uptake Rat hepatocytes NA BMS NA / CTD Hepatocyte uptake Cryopreserved human hepatocytes NA BMS NCPK 24/ CTD OATP1B1, 1B3, and 2B1 substrate HEK-293 cells NA BMS NCPK 23 / CTD

41 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 4 Table : Type of Study Pharmacokinetics: Overview roatp1, roatp2, roatp4, and human OATP1B3 substrate Metabolism In vitro metabolism rate In vitro metabolite formation In vivo metabolite formation Test System Method of Administration Testing Facility Test Article: Daclatasvir Study Number / DCN Location Xenopus laevis oocytes NA BMS NA/ CTD Mouse, rat, dog, monkey, human liver microsomes, and hepatocytes Mouse, rat, rabbit, dog, monkey, human liver microsomes and hepatocytes; Aroclor 1254-induced rat S9 Intact mouse, rat, monkey, and human; BDC rat, dog, and monkey NA BMS NA / CTD NA BMS NA / CTD Oral BMS NA / CTD In vivo metabolite formation Rabbit Oral BMS NCPK6 / CTD [ 3 H]Daclatasvir in vitro covalent Rat, monkey, and human NA BMS NA/ CTD binding liver microsomes NA BMS NA/ CTD PXR Transactivation HepG2/C3A cells NA BMS NA / CTD / CYP induction Human hepatocytes NA CTD XT (NCPK 33)/ CYP induction Human hepatocytes NA CTD CYP induction Human hepatocytes NA BMS NCPK 47/ CTD CYP inhibition Recombinant CYP enzymes NA BMS NA / CTD CYP inhibition Human liver microsomes NA BMS NA/ CTD [ 14 C]Daclatasvir in vitro covalent Rat, dog, monkey, and binding human liver microsomes Reaction phenotyping, CYP Reaction phenotyping, CYP Human liver microsomes and recombinant CYP enzymes Human liver microsomes and recombinant CYP enzymes NA BMS NA / CTD NA BMS NCPK 18/ CTD

42 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 5 Table : Type of Study Pharmacokinetics: Overview Test System Method of Administration Testing Facility Test Article: Daclatasvir Study Number / DCN Location Excretion Mass balance Mouse Oral MBA00393/ CTD Mass balance Rat Oral MBA00391/ CTD Mass balance Rabbit Oral / CTD Mass balance Monkey Oral MBA00394/ CTD Mass balance Human Oral MBA00411/ CTD Excretion into bile BDC rat Oral MBA00392/ CTD Excretion into bile BDC dog Oral BMS PK_3852/ CTD Excretion into bile BDC monkey Oral BMS PK_3855/ CTD Excretion into bile Rat, dog, and monkey IV BMS NA / CTD Other Pharmacokinetic Studies P-gp inhibition Caco-2 cells NA BMS NA / CTD Human P-gp inhibition MDCK-MDR1 cells NA BMS NCPK 25/ CTD Human BCRP inhibition MDCK cells NA BMS NA/ CTD Human MRP2 inhibition membrane vesicles from SF-9 cells NA BMS NA/ CTD Human BSEP and NTCP Inhibition SF-9 and CHO cells NA NCPK 29/ CTD Human OAT1, OAT3, OCT1, and OCT2 Inhibition HEK-293 cells NA BMS NCPK 19/ CTD OATP2B1 Inhibition HEK-293 cells NA BMS NCPK 21/ CTD Human OATP 1B3 Inhibition HEK-293 cells NA BMS NA/ CTD Human OATP1B1 inhibition HEK-293 cells NA BMS NA / CTD Human UGT1A1 inhibition Human liver microsomes NA BMS NCPK 8/ CTD Abbreviations: BMS: Bristol-Myers Squibb. BCRP: breast cancer resistance protein. BDC: bile duct-cannulated. BSEP: bile salt export pump. :, (. ( ). (. CYP: cytochrome P450. IV: intravenous. NA: not applicable. MRP: membrane resistance protein. NTCP: N+-taurocholate-cotransporting peptide. OAT: organic anion transporter. OATP: organic anion transporting polypeptide. OCT: organic cation transporter. PAMPA: parallel artificial membrane permeability assay. P-gp: P-glycoprotein. PK: pharmacokinetics. QPS: QPS Pharmaceutical Servcies (Newark, DE). QWBA: Quantitative whole-body autoradiography. roatp: rat organic anion transporting polypeptide. ( ). UGT: uridine-diphosphoglucuronosyl transferase. ( ).

43 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 6 2 分析方法及びバリデーション試験 Table : Document Control Number Pharmacokinetics: Analytical Methods and Validation Reports Standard Sample Regression Method Curve Range Matrix Model (ng/ml) Analyte Daclatasvir Daclatasvir Daclatasvir Daclatasvir Asunaprevir BMS BMS mouse plasma (K 2 EDTA) mouse plasma (EDTA) rat plasma (K 2 EDTA) rat plasma (EDTA) rat plasma (EDTA) rat plasma (EDTA) rat plasma (EDTA) LC-MS/ MS LC-MS/ MS LC-MS/ MS LC-MS/ MS LC-MS/ MS LC-MS/ MS LC-MS/ MS 1/x 2 weighted linear 1/x 2 weighted linear 1/x 2 weighted linear 1/x 2 weighted linear 1/x 2 weighted linear 1/x 2 weighted linear 1/x 2 weighted linear Inter- Precision (%CV) Intra- Precision (%CV) Accuracy (% Deviation) NA 4.4 ± NA 9.9 ± ± ± ± ± ± 2.9 Stability (RT, F/T, LTS) RT = 24 h, LTS = 3 months at 20 C RT = 24 h, F/T = 5 cycles, LTS = 90 days at 20 C, 7 days at 70 C RT = 24 h, F/T = 5 cycles, LTS=287 days at 20 C RT = 24 h, F/T = 5 cycles, LTS=93 days at 20 C RT = 24 h, F/T = 5 cycles, LTS = 93 days at 20 C RT = 24 h, F/T = 5 cycles, LTS = 93 days at 20 C RT = 24 h, F/T = 5 cycles, LTS = 93 days at Study Number DM10043 DS10043 DN11083 DS08152 DN07054 DN08011 DN11038 DS07055 DS07207 DS08002 DS08011 DS10042 DS08101 DS08101 DS08101 DS08101

44 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 7 Table : Document Control Number Pharmacokinetics: Analytical Methods and Validation Reports Standard Sample Regression Analyte Method Curve Range Matrix Model (ng/ml) Daclatasvir Asunaprevir BMS BMS Daclatasvir Daclatasvir rat plasma (EDTA) rat plasma (EDTA) rat plasma (EDTA) rat plasma (EDTA) rabbit plasma (K 2 EDTA) dog plasma (K 2 EDTA) LC-MS/ MS LC-MS/ MS LC-MS/ MS LC-MS/ MS LC-MS/ MS LC-MS/ MS 1/x 2 weighted linear 1/x 2 weighted linear 1/x 2 weighted linear 1/x 2 weighted linear 1/x 2 weighted linear 1/x 2 weighted linear Inter- Precision (%CV) Intra- Precision (%CV) Accuracy (% Deviation) ± ± ± ± NA 2.0 ± NA 4.1 ± 6.6 Stability (RT, F/T, LTS) 20 C RT = 31 h 45 min, F/T = 5 cycles, LTS = 155 days at 20 C RT = 31 h 45 min, F/T = 5 cycles, LTS = 155 days at 20 C RT = 31 h 45 min, F/T = 5 cycles, LTS=155 days at 20 C RT = 31 h 45 min, F/T = 5 cycles, LTS = 155 days at 20 C RT = 24 h, LTS = 3 months at 20 C RT = 24 h, LTS = 74 days at 20 C Study Number DN08034 DS08126 DM11028 DN11082 DN12003 DN12004 DM09003 DS08126 DM09003 DM09003 DN07051 DN08012 DS07058 DS07186

45 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 8 Table : Document Control Number Pharmacokinetics: Analytical Methods and Validation Reports Standard Sample Regression Analyte Method Curve Range Matrix Model (ng/ml) Daclatasvir Asunaprevir BMS BMS Daclatasvir Daclatasvir Asunaprevir ribavirin dog plasma (EDTA) dog plasma (EDTA) dog plasma (EDTA) dog plasma (EDTA) monkey plasma (EDTA) monkey plasma (K 2 EDTA) monkey plasma (K 2 EDTA) monkey plasma (EDTA) LC-MS/ MS LC-MS/ MS LC-MS/ MS LC-MS/ MS LC-MS/ MS LC-MS/ MS LC-MS/ MS LC-MS/ MS 1/x 2 weighted linear 1/x 2 weighted linear 1/x 2 weighted linear 1/x 2 weighted linear 1/x 2 weighted linear 1/x 2 weighted linear 1/x 2 weighted linear 1/x 2 weighted linear Inter- Precision (%CV) Intra- Precision (%CV) Accuracy (% Deviation) NA 4.5 ± NA 8.9 ± NA 6.9 ± NA 7.3 ± NA 1.2 ± NA 9.0 ± NA 18.6 ± ± 4.8 Stability (RT, F/T, LTS) RT = 24 h 15 min, F/T = 5, LTS = 80 days at 20 C RT = 24 h 15 min, F/T = 5, LTS = 80 days at 20 C RT = 24 h 15 min, F/T = 5, LTS = 80 days at 20 C RT = 24 h 15 min, F/T = 5, LTS = 80 days at 20 C RT = 24 h, F/T = 5, LTS = 137 days at 20 C RT = 23 h 15 min, F/T = 5, LTS = 104 days at 20 C RT = 23 h 15 min, F/T = 5, LTS = 104 days at 20 C RT = 24 h, F/T = 5, LTS = 184 days at 20 C Study Number DM09002 DM09009 DM09009 DM09002 DM09009 DM09002 DM09009 DS08003 DS08039 DM09008 DS08077 DS08143 DM09008 DS09019 DS08143 DS08077 DS08147 DS09019

46 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 9 Table : Document Control Number Pharmacokinetics: Analytical Methods and Validation Reports Standard Sample Regression Method Curve Range Matrix Model (ng/ml) Analyte Peginterferon alfa-2b (PegIntron) monkey plasma (Li Heparin) ECLA 4-parameter logistic w/ 1/y 2 weighting pg /ml Inter- Precision (%CV) Intra- Precision (%CV) Accuracy (% Deviation) ± 8.1 Stability (RT, F/T, LTS) RT = 24 h 10 min, F/T = 3, LTS = 196 days at 70 C Study Number DS08077 DS08147 DS09019 Abbreviations: NA: not applicable. F/T = freeze-thaw stability. LC-MS/MS = liquid chromatography tandem mass spectrometry, LTS = long-term stability, RT = room temperature, and ECLA = electrochemiluminescent assay. Additional non-glp analyses were performed for multiple analytes in various biological matrices, more details are available in the toxicokinetic reports.

47 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 10 3 薬物動態試験 : 単回投与後の吸収 Table A: Pharmacokinetics: Absorption After a Single Dose (Mouse) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control Number: NA/ Species/ Strain: Mouse/ P-gp double (mdr1a/1b) knockout and Wild type Gender/ Number of Animals: Male/ 3 per timepoint Vehicle/ Formulation: PEG-400/ propylene glycol/ ethanol/ water (30:25:10:35)/ Solution Dose (mg/kg): 3 Sample: Plasma Analyte: Daclatasvir Assay: LC-MS/MS P-gp Knockout Mice Wild-type Mice Feeding condition: Non-fasted Fasted Non-fasted Fasted Method of Administration: Injection Gavage Injection Gavage Route: IV Oral IV Oral Cmax (μg/ml) NA 1.8 NA 2.3 AUC(0-8 h) (μg h/ml) Tmax (h) NA 2.0 NA 0.5 CL (ml/min/kg) 4.0 NA 9.3 NA Vss (L/kg) 0.61 NA NC NA T-HALF (h) 1.6 NA 1.1 NA Bioavailability (%) NA 91 a NA 123 a BMS AUC(0-8 h) (μg h/ml) BMS AUC(0-8 h) / Daclatasvir AUC(0-8 h) BMS AUC(0-8 h) (μg h/ml) BMS AUC(0-8 h) / Daclatasvir AUC(0-8 h) Additional Information: NA: not applicable. NC: not calculated as the terminal profile was not well characterized. P-gp: P-glycoprotein. PEG: polyethylene glycol. Pharmacokinetic parameters were generated from composite serum concentration-time curves. BMS (descarboxymethyl daclatasvir) and BMS (pyrrolidine-hydroxylated rearranged daclatasvir) are metabolites of daclatasvir; see Table for structures. Metabolite-to-parent ratios are based on molar concentrations. a Bioavailability was calculated using the AUC(0-8 h) of daclatasvir after oral and IV administration of daclatasvir.

48 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 11 Table B: Pharmacokinetics: Absorption After a Single Dose (Rat) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control Number: NA/ Species/ Strain: Rat/ Sprague-Dawley Gender/ Number of Animals: Male/ 3 Vehicle/ Formulation: PEG-400/ Solution Sample: Plasma Analyte: Daclatasvir Assay: LC-MS/MS Feeding condition: Non-fasted Non-fasted Fasted Fasted Method of Administration: Infusion (10 minutes) Infusion (10 minutes) Gavage Infusion (30 minutes) Route: IV IV Oral IPT Dose (mg/kg): Cmax (μg/ml) NA NA 0.59 ± ± 0.25 AUC(INF) (μg h/ml) 3.7 ± ± ± ± 0.49 Tmax (h) NA NA 2.7 ± ± 0.0 CLTp (ml/min/kg) 9.1 ± ± 1.6 NA NA Vss (L/kg) 1.2 ± ± 1.1 NA NA T-HALF (h) 3.3 ± ± 1.0 NA 1.2 ± 0.05 MRT (h) 2.2 ± ± 1.0 NA NA Bioavailability (%) NA NA 50.4 a NA Additional Information: NA: not applicable. PEG: polyethylene glycol. IPT: intraportal vein. Values are mean ± standard deviation. a Bioavailability was calculated using the dose-normalized AUC(INF) of daclatasvir after oral and 2 mg/kg IV administration of daclatasvir.

49 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 12 Table C: Pharmacokinetics: Absorption After a Single Dose (Dog) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control Number: NA/ Species/ Strain: Dog/ Beagle Gender/ Number of Animals: Male/ 5 Sample: Plasma Analyte: Daclatasvir Assay: LC-MS/MS Vehicle/Formulation: PEG-400/ water (85:15)/ Solution PEG-400/ povidone K-30/ Vitamin E TPGS/ Tween 80 (95:2:2:1)/ Solution Feeding condition: Non-fasted Fasted Method of Administration: Infusion (5 minutes) Gavage Route: IV Oral Dose (mg/kg): 1 3 Cmax (μg/ml) NA 0.85 ± 0.51 AUC(INF) (μg h/ml) 1.31 ± ± 3.64 Tmax (h) NA 2.9 ± 1.6 CLTp (ml/min/kg) 20.3 ± 21.3 NA Vss (L/kg) 5.4 ± 4.6 NA T-HALF (h) 3.9 ± 1.4 NA MRT (h) 4.8 ± 1.0 NA Bioavailability (%) NA 144 Additional Information: NA: not applicable. PEG: polyethylene glycol. TPGS: d-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate. Values are mean ± standard deviation. This was not a crossover-design study. Bioavailability value was calculated based on mean AUC values after oral and IV dosing.

50 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 13 Table C (continued): Pharmacokinetics: Absorption After a Single Dose (Dog) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control Number: NA/ Species/ Strain: Dog/ Beagle Gender/ Number of animals: Male/ 3 Sample: Plasma Analyte: Daclatasvir Assay: LC-MS/MS Vehicle/Formulation: PEG-400/ ethanol/ 10 mm phosphate buffer ph 6.8 PEG-400/ ethanol/ water (60:10:30)/ Powder in capsule Powder in capsule (60:10:30)/ Solution Solution Feeding condition: Not Fasted Fasted Fasted Fasted Method of administration: Infusion (10 minutes) Gavage Gavage Gavage Pretreatment: None Pentagastrin Pentagastrin Famotidine Route: IV Oral Oral Oral Dose (mg/kg): Cmax (μg/ml) NA 1.8 ± ± ± 1.0 AUC(INF) (μg h/ml) 3.3 ± ± ± ± 4.4 Tmax (h) NA 1.8 ± ± ± 1.5 CLTp (ml/min/kg) 5.5 ± 2.1 NA NA NA Vss (L/kg) 1.4 ± 0.29 NA NA NA T-HALF (h) 3.5 ± 0.68 NA NA NA MRT (h) 4.5 ± 1.0 NA NA NA Bioavailability (%) NA 130 ± ± ± 24 BMS AUC(0-24 h) (μg h/ml) ± ± ND ND BMS AUC/ Daclatasvir AUC 0.09 ± ± NA NA BMS AUC(0-24 h) (μg h/ml) ± ± ND ND BMS AUC/ Daclatasvir AUC ± ± NA NA Additional Information: NA: not applicable. ND: not determined. PEG: polyethylene glycol. Values are mean ± standard deviation. This was a crossover-design study. BMS (descarboxymethyl daclatasvir) and BMS (pyrrolidine-hydroxylated rearranged daclatasvir) are metabolites of daclatasvir; see Table for structures. Metabolite-to-parent ratios based on molar concentrations.

51 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 14 Table D: Pharmacokinetics: Absorption After a Single Dose (Monkey) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control Number: NA/ Species/ Strain: Monkey/ Cynomolgus Gender/ Number of Animals: Male/ 3 Sample: Plasma Analyte: Daclatasvir Assay: LC-MS/MS Vehicle/ Formulation: PEG-400/water (85:15)/ Solution PEG-400/ Povidone K-30/ TPGS/ Tween 80 (95:2:2:1)/ Solution Feeding condition: Non-fasted Fasted Method of Administration: Infusion (5 minutes) Gavage Route: IV Oral Dose (mg/kg): Cmax (μg/ml) NA 0.20 ± AUC(INF) (μg h/ml) 1.63 ± ± 0.32 Tmax (h) NA 2.0 ± 0.0 CLTp (ml/min/kg) 12.4 ± 4.2 NA Vss (L/kg) 2.2 ± 0.88 NA T-HALF (h) 3.7 ± 0.31 NA MRT (h) 3.0 ± 0.48 NA Bioavailability (%) NA 38 ± 17 BMS AUC(0-24 h) (μg h/ml) ± ± 0.08 BMS AUC/ Daclatasvir AUC ± ± Additional Information: NA: not applicable. PEG: polyethylene glycol. TPGS: d-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate. Values are mean ± standard deviation. Metabolite-to-parent ratios based on molar concentrations. BMS (descarboxymethyl daclatasvir) and BMS (pyrrolidine-hydroxylated rearranged daclatasvir) are metabolites of daclatasvir; see Table for structures. BMS concentrations after oral dosing were below the limit of quantification (14.6 ng/ml). Bioavailability was calculated using the dose-normalized AUC(INF) of daclatasvir after oral and IV administration of daclatasvir.

52 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 15 4 薬物動態試験 : 反復投与後の吸収 Table : Pharmacokinetics: Absorption after Repeated Doses Absorption after repeated pharmacological doses was not studied. Repeat-dose toxicokinetic data appear in the Toxicology Summary.

53 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 16 5 薬物動態試験 : 分布 Table A: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Male Rats, Single Dose, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: QPS 20N-0711/ Species/ Strain: Rat/ Long-Evans and Sprague-Dawley Sex/ Number of Animals: Male/ 1 per timepoint Feeding condition: Fasted Vehicle/ Formulation: PEG 400 / Povidone K-30 / Vitamin E TPGS / 0.1 M H 3 PO 4 buffer ph 3 (15:5:5:75, w/w/w/w) Method of Administration: Oral gavage Dose: 10.5 mg/kg (115 μci/kg) Radionuclide: 14 C Specific activity: μci/mg Sampling Times: 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 96, 168, and 840 hours (Long-Evans rats); 1, 8, and 24 hours (Sprague-Dawley rats) Assay: Quantitative whole-body autoradiography Radioactivity Concentration (μg-equivalents/g) Long-Evans Rats Sprague-Dawley Rats Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 48 h 96 h 168 h 840 h 1 h 8 h 24 h Adipose (brown) BLQ BLQ BLQ BLQ NS BLQ Adipose (white) BLQ BLQ BLQ BLQ NS NS NS 0.21 BLQ BLQ Adrenal gland Bile BLQ NS NS NS Blood BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ NS 0.43 BLQ BLQ Bone BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ NS NS NS BLQ BLQ BLQ Bone marrow BLQ NS Brain (entire) BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ NS NS NS BLQ BLQ BLQ Brain cerebellum BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ NS NS NS BLQ BLQ BLQ Brain cerebrum BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ NS NS NS BLQ BLQ BLQ Brain medulla BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ NS NS NS BLQ BLQ BLQ

54 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 17 Table A: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Male Rats, Single Dose, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: QPS 20N-0711/ Radioactivity Concentration (μg-equivalents/g) Long-Evans Rats Sprague-Dawley Rats Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 48 h 96 h 168 h 840 h 1 h 8 h 24 h Cecum NS NS NS Cecum contents BLQ a 775 a NS NS NS BLQ Epididymis BLQ 0.09 NS NS NS BLQ Eye BLQ BLQ Eye lens BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ Eye uveal tract b 2.19 b 1.97 b BLQ Harderian gland BLQ NS Kidney BLQ Kidney cortex Kidney medulla BLQ BLQ Large intestine NS NS NS Large intestinal contents BLQ BLQ a 1047 a BLQ NS NS BLQ Liver BLQ Lung BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ NS BLQ Lymph nodes NS Muscle BLQ BLQ BLQ BLQ NS NS NS 0.44 BLQ BLQ Myocardium BLQ BLQ BLQ NS NS NS BLQ Pancreas BLQ BLQ NS NS NS BLQ Pituitary gland NS NS Prostate gland BLQ BLQ NS NS NS

55 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 18 Table A: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Male Rats, Single Dose, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: QPS 20N-0711/ Radioactivity Concentration (μg-equivalents/g) Long-Evans Rats Sprague-Dawley Rats Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 48 h 96 h 168 h 840 h 1 h 8 h 24 h Salivary gland BLQ 0.09 NS 0.08 NS Skin (pigmented) NA NA NA Skin (non-pigmented) BLQ BLQ BLQ NS NS NS Small intestine NS NS NS Small intestinal contents NS NS NS Spinal cord BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ NS NS NS BLQ BLQ BLQ Spleen Stomach BLQ BLQ NS NS NS Stomach contents BLQ BLQ NS NS NS 456 BLQ 1.78 Testis BLQ BLQ BLQ NS NS NS BLQ BLQ Thymus Thyroid Urinary bladder BLQ BLQ NS NS NS Urine BLQ BLQ NS NS NS 0.16 BLQ BLQ Additional Information: BLQ: below limit of quantification (0.069 μg-equivalents/g). NS: Not sampled. TGPS: d-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate. a Value is higher than upper limit of quantification (595 μg equivalent/g). b Mean of multiple readings of eye uveal tract sample

56 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 19 Table A: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Male Rats, Single Dose, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: QPS 20N-0711/ Tissue-to-Blood Radioactivity Concentration Ratio Long-Evans Rats Sprague-Dawley Rats Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 1 h Adipose (brown) Adipose (white) Adrenal gland Bile Blood Bone Bone marrow Brain (entire) Brain cerebellum Brain cerebrum Brain medulla Cecum Cecum contents Epididymis Eye Eye lens Eye uveal tract Harderian gland Kidney Kidney cortex Kidney medulla Large intestine Large intestinal contents Liver Lung Lymph nodes Muscle Myocardium Pancreas Pituitary gland

57 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 20 Table A: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Male Rats, Single Dose, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: QPS 20N-0711/ Tissue-to-Blood Radioactivity Concentration Ratio Long-Evans Rats Sprague-Dawley Rats Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 1 h Prostate gland Salivary gland Seminal vesicle Skin (pigmented) NA Skin (non-pigmented) Small intestine Small intestinal contents Spinal cord Spleen Stomach Stomach contents Testis Thymus Thyroid Urinary bladder Urine Additional Information: NA: not applicable.

58 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 21 Table A: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Male Rats, Single Dose, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: NCPK 26/ Species/ Strain: Rat / Sprague-Dawley Sex/ Number of Animals: Male/ 1 per timepoint Feeding condition: Not fasted Vehicle/ Formulation: 0.1 M Phosphoric acid buffer, ph 3.0/PEG400/povidone K-30/vitamin E TPGS (75:15:5:5, w/w/w/w)/ Solution Method of Administration: Oral gavage Dose: 30 mg/kg (100 μci/kg) Radionuclide: 14 C Specific activity: 66.8 μci/mg Sampling Times: 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 72, and 168 hours Assay: Quantitative whole-body autoradiography Radioactivity Concentration (μg-equivalents/g) Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 72 h 168 h Adrenal gland(s) 7.27 ND Arterial wall ND ND Bile ND Blood BLQ ND ND Bone BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ ND ND ND Bone marrow BLQ Brain cerebellum BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ ND ND ND Brain cerebrum BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ ND ND ND Brain choroid plexus BLQ BLQ ND Brain medulla BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ ND ND ND Brain olfactory lobe BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ ND ND ND Bulbo-urethral gland NR 1.71 NR ND Cecum BLQ ND Cecum contents BLQ ND Diaphragm BLQ ND ND Epididymis BLQ BLQ BLQ BLQ Esophagus BLQ ND Esophageal contents BLQ ND ND Exorbital lacrimal gland

59 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 22 Table A: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Male Rats, Single Dose, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: NCPK 26/ Radioactivity Concentration (μg-equivalents/g) Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 72 h 168 h Eye lens BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ ND ND ND Eye uveal tract BLQ ND Eye(s) BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ ND Fat (abdominal) BLQ BLQ ND ND Fat (brown) BLQ ND Harderian gland Intervertebral ligaments ND ND NR 7.90 ND ND ND Intra-orbital lacrimal gland Kidney cortex Kidney medulla BLQ Kidney(s) Large intestine BLQ ND Large intestine contents BLQ BLQ BLQ ND Liver BLQ Lung(s) ND ND Lymph nodes BLQ Muscle BLQ ND ND Myocardium ND ND Nasal turbinates BLQ Pancreas BLQ ND Pituitary gland Preputial gland ND Prostate gland BLQ ND Salivary gland(s) BLQ BLQ Salivary gland(s), parotid BLQ ND Seminal vesicle(s) ND ND Skin (non-pigmented) BLQ ND Small intestine ND BLQ ND Small intestinal contents ND Spinal cord BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ ND ND ND ND

60 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 23 Table A: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Male Rats, Single Dose, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: NCPK 26/ Radioactivity Concentration (μg-equivalents/g) Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 72 h 168 h Spleen Stomach BLQ ND Stomach contents BLQ BLQ ND Stomach mucosa ND ND ND Stomach wall ND ND BLQ BLQ ND Testis(es) BLQ BLQ BLQ BLQ Thymus Thyroid Urinary bladder BLQ ND Urine BLQ BLQ ND Additional Information: BLQ: below limit of quantification (< μg-equivalents/g). ND: not detectable (sample shape not discernible from background or surrounding tissue).

61 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 24 Table A: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Male Rats, Single Dose, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: NCPK 26 / Species / Strain: Rat / Sprague-Dawley Sex / Number of Animals: Male/ 1 per timepoint Feeding condition: Not fasted Vehicle / Formulation: 0.1 M Phosphoric acid buffer, ph 3.0/PEG400/povidone K-30/vitamin E TPGS (75:15:5:5, w/w/w/w)/ Solution Method of Administration: Oral gavage Dose: 30 mg/kg (100 μci/kg) Radionuclide: 14 C Specific activity: 66.8 μci/mg Sampling Times: 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 72, and 168 hours Assay: Quantitative whole-body autoradiography Tissue-to-Plasma Radioactivity Concentration Ratio Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 72 h 168 h Adrenal gland(s) 3.13 NA NA NA Arterial wall NA NA Blood NA NA NA Bone NA NA NA NA NA NA NA NA NA Bone marrow NA NA Brain cerebellum NA NA NA NA NA NA NA NA NA Brain cerebrum NA NA NA NA NA NA NA NA NA Brain choroid plexus NA NA NA Brain medulla NA NA NA NA NA NA NA NA NA Brain olfactory lobe NA NA NA NA NA NA NA NA NA Bulbo-urethral gland NA 2.84 NA NA NA Cecum NA NA

62 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 25 Table A: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Male Rats, Single Dose, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: NCPK 26 / Tissue-to-Plasma Radioactivity Concentration Ratio Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 72 h 168 h Diaphragm NA NA NA Epididymis NA NA NA NA Esophagus NA NA Exorbital lacrimal gland NA NA Eye lens NA NA NA NA NA NA NA NA NA Eye uveal tract NA NA Eye(s) NA NA NA NA NA NA NA NA Fat (abdominal) NA NA NA NA Fat (brown) NA NA Harderian gland NA NA Intervertebral ligaments NA NA NA 13.1 NA NA NA Intra-orbital lacrimal gland NA NA Kidney cortex NA NA Kidney medulla NA NA Kidney(s) NA NA Large intestine NA NA Liver NA NA Lung(s) NA NA Lymph nodes NA NA Muscle NA NA NA

63 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 26 Table A: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Male Rats, Single Dose, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: NCPK 26 / Tissue-to-Plasma Radioactivity Concentration Ratio Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 72 h 168 h Myocardium NA NA Nasal turbinates NA NA Pancreas NA NA Pituitary gland NA NA Preputial gland NA NA Prostate gland NA NA Salivary gland(s) NA NA Salivary gland(s), parotid NA NA Seminal vesicle(s) NA NA Skin (non-pigmented) NA NA Small intestine NA NA NA Spinal cord NA NA NA NA NA NA NA NA NA Spleen NA NA Stomach NA NA Stomach mucosa NA NA NA NA Stomach wall NA NA NA NA NA Testis NA NA NA NA Thymus NA NA Thyroid NA NA Urinary bladder NA NA Additional Information: NA: not applicable.

64 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 27 Table A: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Female Rats, Single Dose, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No.: NCPK 26/ Species / Strain: Rat / Sprague-Dawley Sex / Number of Animals: Female/ 1 per timepoint Feeding condition: Not fasted Vehicle / Formulation: 0.1 M Phosphoric acid buffer, ph 3.0/PEG400/povidone K-30/vitamin E TPGS (75:15:5:5, w/w/w/w)/ Solution Method of Administration: Oral gavage Dose: 30 mg/kg (100 μci/kg) Radionuclide: 14 C Specific activity: 66.8 μci/mg Sampling Times: 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 72, and 168 hours Assay: Quantitative whole-body autoradiography Radioactivity Concentration (μg-equivalents/g) Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 72 h 168 h Adrenal gland(s) a 7.63 a BLQ Arterial wall ND ND Bile ND ND Blood BLQ ND ND ND Bone BLQ BLQ BLQ ND ND ND ND ND ND Bone marrow BLQ Brain cerebellum BLQ ND ND ND ND ND ND ND ND Brain cerebrum BLQ ND ND ND ND ND ND ND ND Brain choroid plexus ND ND ND Brain medulla BLQ ND ND ND ND ND ND ND ND

65 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 28 Table A: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Female Rats, Single Dose, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No.: NCPK 26/ Radioactivity Concentration (μg-equivalents/g) Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 72 h 168 h Brain olfactory lobe BLQ ND ND ND ND ND ND ND ND Cecum ND ND Cecum contents BLQ ND Diaphragm BLQ ND ND ND Esophagus ND ND Esophagus contents BLQ BLQ ND ND Exorbital lacrimal gland BLQ Eye lens BLQ BLQ ND ND ND ND ND ND ND Eye uveal tract ND ND ND ND Eye(s) BLQ BLQ BLQ BLQ ND ND ND ND Fat (abdominal) ND ND ND ND Fat (brown) BLQ ND Harderian gland BLQ Intervertebral ligaments ND ND Intra-orbital lacrimal gland BLQ Kidney cortex Kidney medulla BLQ BLQ Kidney(s) Large intestine BLQ ND Large intestine contents BLQ ND

66 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 29 Table A: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Female Rats, Single Dose, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No.: NCPK 26/ Radioactivity Concentration (μg-equivalents/g) Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 72 h 168 h Liver BLQ Lymph nodes ND Lung(s) BLQ ND ND ND Muscle BLQ ND ND ND Myocardium BLQ BLQ ND ND Nasal turbinates ND ND Ovaries 1.71 a 2.19 a 2.77 a 2.45 a 1.28 a BLQ a a ND ND Pancreas BLQ ND ND Pituitary gland ND Preputial gland a NR Salivary gland(s) ND Salivary gland(s), parotid ND ND Skin (non-pigmented) BLQ ND ND Small intestine ND Small intestine contents BLQ ND Spinal cord BLQ BLQ BLQ ND ND ND ND ND ND Spleen Stomach BLQ ND Stomach contents ND Stomach mucosa ND ND ND ND Stomach wall ND ND ND ND Thymus Thyroid Urinary bladder 1.38 ND a 1.43 ND ND ND ND Urine ND ND ND Uterus a ND Additional Information: BLQ: below limit of quantification (< μg-equivalents/g). ND: not detectable (sample shape not discernible from background or surrounding tissue). NR: not represented (tissue not present in section) a Tissues appear to be fat soaked.

67 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 30 Table A: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Female Rats, Single Dose, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No.: NCPK 26/ Species / Strain: Rat / Sprague-Dawley Sex / Number of Animals: Female / 1 per timepoint Feeding condition: Not fasted Vehicle / Formulation: 0.1 M Phosphoric acid buffer, ph 3.0/PEG400/povidone K-30/vitamin E TPGS (75:15:5:5, %w/w/w/w)/ Solution Method of Administration: Oral gavage Dose: 30 mg/kg (100 μci/kg) Radionuclide: 14 C Specific activity: 66.8 μci/mg Sampling Times: 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 72, and 168 hours Assay: Quantitative whole-body autoradiography Tissue-to-Plasma Radioactivity Concentration Ratio Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 72 h 168 h Adrenal gland(s) NA Arterial wall NA NA Blood NA NA NA NA Bone NA NA NA NA NA NA NA NA NA Bone marrow NA Brain cerebellum NA NA NA NA NA NA NA NA NA Brain cerebrum NA NA NA NA NA NA NA NA NA Brain choroid plexus NA NA NA Brain medulla NA NA NA NA NA NA NA NA NA Brain olfactory lobe NA NA NA NA NA NA NA NA NA Cecum NA NA Diaphragm NA NA NA NA

68 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 31 Table A: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Female Rats, Single Dose, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No.: NCPK 26/ Tissue-to-Plasma Radioactivity Concentration Ratio Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 72 h 168 h Esophagus NA NA Exorbital lacrimal gland NA Eye lens NA NA NA NA NA NA NA NA NA Eye uveal tract NA NA NA NA Eye(s) NA NA NA NA NA NA NA NA Fat (abdominal) NA NA NA NA Fat (brown) NA NA Harderian gland NA Intervertebral ligaments NA NA Intra-orbital lacrimal gland NA Kidney cortex NA Kidney medulla NA NA Kidney(s) NA Large intestine NA NA Liver NA Lung(s) NA NA NA NA Lymph nodes NA Muscle NA NA NA NA Myocardium NA NA NA NA Nasal turbinates NA NA Ovaries NA 3.63 NA NA

69 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 32 Table A: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Female Rats, Single Dose, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No.: NCPK 26/ Tissue-to-Plasma Radioactivity Concentration Ratio Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 72 h 168 h Pancreas NA NA NA Pituitary gland NA Preputial gland NA NA Salivary gland(s) NA Salivary gland(s), parotid NA NA Skin (non-pigmented) NA NA NA Small intestine NA Spinal cord NA NA NA NA NA NA NA NA NA Spleen NA Stomach NA NA Stomach mucosa NA NA NA NA Stomach wall NA NA NA NA Thymus NA Thyroid NA Urinary bladder NA NA NA NA NA Uterus NA Additional Information: NA: not applicable.

70 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 33 Table B: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Multiple Doses, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: NCPK 26 / Species / Strain: Rat / Sprague-Dawley Sex / Number of Animals: Male/ 1 per timepoint Feeding condition: Not fasted Vehicle / Formulation: 0.1 M Phosphoric acid buffer, ph 3.0/PEG400/povidone K-30/vitamin E TPGS (75:15:5:5, %w/w/w)/ Solution Method of Administration: Oral gavage Dose: 30 mg/kg (40 μci/kg) Radionuclide: 14 C Specific activity: 66.8 μci/mg Sampling Times: 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 75, 168, 672 and 2016 hours after last dose (Day 14) Assay: Quantitative whole-body autoradiography Radioactivity Concentration (μg-equivalents/g) Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 75 h 168 h 672 h 2016 h Adrenal gland(s) a a 1.95 a 1.36 a 1.25 a BLQ a BLQ a Arterial wall ND ND ND ND ND Bile ND ND ND ND ND Blood BLQ ND ND ND ND ND Bone ND BLQ ND ND ND ND ND ND ND ND ND Bone marrow BLQ BLQ Brain cerebellum BLQ ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Brain cerebrum BLQ ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Brain choroid plexus ND ND ND ND ND ND ND Brain medulla BLQ ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Brain olfactory lobe BLQ ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Bulbo-urethral gland ND ND

71 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 34 Table B: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Multiple Doses, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: NCPK 26 / Radioactivity Concentration (μg-equivalents/g) Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 75 h 168 h 672 h 2016 h Cecum ND ND ND ND Cecum contents ND ND ND Diaphragm ND BLQ ND ND ND ND ND Epididymis BLQ BLQ 2.08 a BLQ BLQ Esophagus BLQ ND ND ND ND ND Esophagus contents BLQ BLQ ND ND ND ND ND Exorbital lacrimal gland Eye lens ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Eye uveal tract ND ND ND ND ND ND Eye(s) BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ ND ND ND ND ND ND Fat (abdominal) BLQ BLQ ND ND ND ND ND ND Fat (brown) BLQ ND ND Harderian gland BLQ ND Intervertebral ligaments ND ND ND ND ND ND ND Intra-orbital lacrimal gland Kidney cortex BLQ ND Kidney medulla BLQ ND Kidney(s) BLQ BLQ Large intestine ND ND ND ND ND ND Large intestine contents ND ND ND Liver ND BLQ

72 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 35 Table B: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Multiple Doses, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: NCPK 26 / Radioactivity Concentration (μg-equivalents/g) Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 75 h 168 h 672 h 2016 h Lung(s) ND ND ND ND ND ND Lymph nodes ND Muscle BLQ ND ND ND ND ND ND Myocardium BLQ ND ND ND ND ND Nasal turbinates BLQ BLQ Pancreas ND ND ND ND ND Pituitary gland BLQ ND ND Preputial gland 2.94 a 5.65 a 5.48 a 5.66 a a a 4.76 a ND ND Prostate gland ND BLQ ND ND ND ND Salivary gland(s) BLQ ND Salivary gland(s), parotid ND ND Seminal vesicle(s) ND BLQ BLQ ND ND ND ND ND ND Skin (non-pigmented) ND ND Small intestine ND 1.12 ND ND Small intestine contents ND ND ND ND Spinal cord BLQ ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Spleen BLQ Stomach BLQ ND ND Stomach contents ND ND ND ND Stomach mucosa ND ND ND ND ND ND ND ND Stomach wall ND ND ND ND ND ND ND ND Testis BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ Thymus Thyroid Urinary bladder BLQ ND ND ND ND Urine ND ND ND ND ND ND Additional Information: BLQ: below limit of quantification (< μg-equivalents/g). ND: not detectable (sample shape not discernible from background or surrounding tissue). a Tissue appeared to be fat soaked.

73 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 36 Table B: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Multiple Doses, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: NCPK 26 / Species / Strain: Rat / Sprague-Dawley Sex / Number of Animals: Male/ 1 per timepoint Feeding condition: Not fasted Vehicle / Formulation: 0.1 M Phosphoric acid buffer, ph 3.0/PEG400/povidone K-30/vitamin E TPGS (75:15:5:5, %w/w)/ Solution Method of Administration: Oral gavage Dose: 30 mg/kg (40 μci/kg) Radionuclide: 14 C Specific activity: 66.8 μci/mg Sampling Times: 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 75, 168, 672 and 2016 hours Assay: Quantitative whole-body autoradiography Tissue-to-Plasma Radioactivity Concentration Ratios Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 75 h 168 h 672 h 2016 h Adrenal gland(s) NA NA NA NA Arterial wall NA NA NA NA NA Blood NA NA NA NA NA NA Bone NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA Bone marrow NA NA NA NA Brain cerebellum NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA Brain cerebrum NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA Brain choroid plexus NA NA NA NA NA NA NA Brain medulla NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA Brain olfactory lobe NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA Bulbo-urethral gland NA NA NA NA Cecum NA NA NA NA

74 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 37 Table B: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Multiple Doses, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: NCPK 26 / Tissue-to-Plasma Radioactivity Concentration Ratios Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 75 h 168 h 672 h 2016 h Diaphragm NA NA NA NA NA NA NA Epididymis NA NA NA NA NA Esophagus NA NA NA NA NA NA Exorbital lacrimal gland NA NA NA NA Eye lens NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA Eye uveal tract NA NA NA NA NA NA Eye(s) NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA Fat (abdominal) NA NA NA NA NA NA NA NA Fat (brown) NA 6.54 NA NA NA NA Harderian gland NA NA NA NA Intervertebral ligaments NA NA NA NA NA NA NA Intra-orbital lacrimal gland NA NA NA NA Kidney cortex NA NA NA NA Kidney medulla NA NA NA NA Kidney(s) NA NA NA NA Large intestine NA NA NA NA NA NA Liver NA NA NA NA Lung(s) NA NA NA NA NA NA Lymph nodes NA NA NA NA Muscle NA NA NA NA NA NA NA

75 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 38 Table B: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Multiple Doses, Quantitative Whole-body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: NCPK 26 / Tissue-to-Plasma Radioactivity Concentration Ratios Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 75 h 168 h 672 h 2016 h Myocardium NA NA NA NA NA NA Nasal turbinates NA NA NA NA Pancreas NA NA NA NA NA Pituitary gland NA NA NA NA Preputial gland NA NA NA NA Prostate gland NA NA NA NA NA NA Salivary gland(s) NA NA NA NA Salivary gland(s), parotid NA NA NA NA Seminal vesicle(s) NA NA NA NA NA NA NA NA NA Skin (non-pigmented) NA NA NA NA Small intestine NA NA NA NA Spinal cord NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA Spleen NA NA NA NA Stomach NA NA NA NA Stomach mucosa NA NA NA NA NA NA NA NA Stomach wall NA NA NA NA NA NA NA NA Testis NA NA NA 6.43 NA NA NA NA Thymus NA NA NA NA Thyroid NA NA NA NA Urinary bladder NA NA NA NA NA Additional Information: NA: not applicable.

76 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 39 6 薬物動態試験 : 蛋白結合 Table : Study system: Target entity, test system and method: Pharmacokinetics: Serum Protein Binding Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No.: NA/ In vitro equilibrium dialysis Daclatasvir was incubated with mouse, rat, dog, monkey, rabbit, and human serum samples (N = 3) and dialyzed against Krebs-ringer buffer (ph 7.4) at 37 C in 10% CO 2 for 4 hours using a 12,000-14,000-dalton molecular weight-cutoff membrane followed by LC-MS/MS analysis. Species Concentration Tested (μm) Percent Bound Mouse ± 0.8 Rat ± 0.1 Dog ± 0.7 Rabbit ± 0.1 Monkey ± 0.1 Human ± 0.3 Additional Information: NA: not applicable. Values are mean ± standard deviation.

77 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 40 Table (continued): Pharmacokinetics: Human Plasma Protein Binding Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No.: NCPK 52/ Study system: In vitro equilibrium dialysis Target entity, test system and method: Daclatasvir was incubated with human plasma samples (N = 6) and dialyzed against Krebs-ringer phosphate buffer (ph 7.4) at 37 C in 10% CO 2, 85% humidity for a minimum of 5 hours using a 8,000-dalton molecular weight-cutoff membrane followed by LC-MS/MS analysis. Species Concentration Tested (μm) Percent Bound Percent Free Human Mean ± Standard deviation 97.9 ± ± 0.15 Additional Information: NA: not applicable. Values are mean ± standard deviation. In separate studies, the ex vivo plasma protein binding of daclatasvir was 99.4% in healthy subjects, a 98.9% to 99.3% in subjects infected with HCV genotype 1, b and 99.4%, 99.1%, and 99.0% in subjects with Child-Pugh A, B, and C hepatic impairment, c respectively a Healthy subjects (Study AI444013, DCN ). b Subjects infected with HCV genotype 1 (Study AI444004, DCN ). c Subjects with Child-Pugh A, B, and C hepatic impairment (Study AI444013, DCN ).

78 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 41 7 薬物動態試験 : 妊娠又は授乳動物における試験 Table A: Pharmacokinetics: Study in Pregnant or Nursing Animals (Organ Distribution, Quantitative Whole Body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: NCPK 26 / Species / Strain: Rat / Sprague-Dawley, pregnant (Gestation Day 18) Sex / Number of Animals: Female/ 1 per timepoint Feeding condition: Non-fasted Vehicle / Formulation: 0.1 M Phosphoric acid buffer, ph 3.0/PEG400/povidone K-30/vitamin E TPGS (75:15:5:5, w/w/w/w)/ Solution Method of Administration: Oral gavage Dose: 30 mg/kg (100 μci/kg) Radionuclide: 14 C Specific activity: μci/mg Sampling Times: 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, and 48 hours Assay: Quantitative whole-body autoradiography Radioactivity Concentration (μg-equivalents/g) Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 48 h Adrenal gland(s) a 3.84 a Amniotic fluid BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ ND ND Amniotic sac Arterial wall ND ND ND Bile ND ND Blood ND ND Bone BLQ 0.30 BLQ BLQ BLQ ND ND ND Bone marrow Brain cerebellum BLQ BLQ ND ND ND ND ND ND Brain cerebrum BLQ BLQ ND ND ND ND ND ND Brain choroid plexus ND ND Brain medulla BLQ BLQ ND ND ND ND ND ND

79 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 42 Table A: Pharmacokinetics: Study in Pregnant or Nursing Animals (Organ Distribution, Quantitative Whole Body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: NCPK 26 / Radioactivity Concentration (μg-equivalents/g) Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 48 h Brain olfactory lobe BLQ BLQ ND ND ND ND ND ND Cecum ND b 2.18 ND b NR 2.28 Cecum contents BLQ NR 43.6 Diaphragm ND ND Esophagus ND Esophagus contents BLQ BLQ ND Exorbital lacrimal gland Eye lens BLQ ND ND ND ND ND ND ND Eye uveal tract ND ND Eye(s) BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ ND ND Fat (abdominal) BLQ BLQ BLQ ND ND Fat (brown) ND ND Fetal blood ND ND BLQ ND ND ND ND ND Fetal brain ND ND ND ND ND ND ND ND Fetal eye ND ND ND ND ND ND ND ND Fetal gastrointestinal tract ND ND ND ND ND ND ND ND Fetal heart ND ND ND ND ND ND ND ND Fetal kidney ND ND ND ND ND ND ND ND Fetal liver ND ND BLQ BLQ ND ND ND Fetal lung(s) ND ND BLQ ND ND ND ND ND Fetal muscle ND ND ND ND ND ND ND ND Fetal spinal cord ND ND ND ND ND ND ND ND Fetus BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ ND ND

80 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 43 Table A: Pharmacokinetics: Study in Pregnant or Nursing Animals (Organ Distribution, Quantitative Whole Body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: NCPK 26 / Radioactivity Concentration (μg-equivalents/g) Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 48 h Harderian gland Intervertebral ligaments Intra-orbital lacrimal gland BLQ Kidney cortex Kidney medulla BLQ Kidney(s) Large intestine ND ND Large intestine contents BLQ Liver Lung(s) ND ND Lymph node(s) Mammary gland BLQ Muscle ND ND Myocardium ND ND Nasal turbinates BLQ ND Ovary(ies) 0.98 a 1.39 a 1.52 a 1.54 a BLQ a a ND ND Pancreas BLQ ND Pituitary gland Placenta BLQ BLQ Preputial gland NR Salivary gland(s) BLQ Salivary gland(s), parotid ND ND Skin (nonpigmented) ND ND

81 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 44 Table A: Pharmacokinetics: Study in Pregnant or Nursing Animals (Organ Distribution, Quantitative Whole Body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: NCPK 26 / Radioactivity Concentration (μg-equivalents/g) Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 48 h Small intestine BLQ Small intestine contents Spinal cord BLQ BLQ BLQ BLQ ND ND ND ND Spleen Stomach BLQ ND Stomach contents Stomach mucosa ND Stomach wall BLQ ND Thymus Thyroid Urinary bladder NR NR 2.38 NR ND NR Urine NR NR BLQ NR BLQ BLQ ND NR Uterus BLQ ND Additional Information: NA: not applicable. BLQ: below limit of quantification (< μg-equivalents/g). ND: not detectable (sample shape not discernible from background or surrounding tissue). NR: not represented (tissue not present in section). a Tissue appeared to be fat soaked. b Tissue was not detectable due to flare from gastrointestinal contents.

82 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 45 Table A: Pharmacokinetics: Study in Pregnant or Nursing Animals (Organ Distribution, Quantitative Whole Body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: NCPK 26 / Species / Strain: Rat / Sprague-Dawley, pregnant (Gestation Day 18) Sex / Number of Animals: Female/ 1 per timepoint Feeding condition: Non-fasted Vehicle / Formulation: 0.1 M Phosphoric acid buffer, ph 3.0/PEG400/povidone K-30/vitamin E TPGS (75:15:5:5, %w/w)/ Solution Method of Administration: Oral gavage Dose: 30 mg/kg (100 μci/kg) Radionuclide: 14 C Specific activity: μci/mg Sampling Times: 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, and 48 hours Assay: Quantitative whole-body autoradiography Tissue-to-Blood Radioactivity Concentration Ratios Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 48 h Adrenal gland(s) NA Amniotic fluid NA NA NA NA NA NA NA NA Amniotic sac NA Arterial wall NA NA NA Blood NA NA Bone NA NA NA NA NA NA NA Bone marrow NA Brain cerebellum NA NA NA NA NA NA NA NA Brain cerebrum NA NA NA NA NA NA NA NA Brain choroid plexus NA NA Brain medulla NA NA NA NA NA NA NA NA Brain olfactory lobe NA NA NA NA NA NA NA NA

83 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 46 Table A: Pharmacokinetics: Study in Pregnant or Nursing Animals (Organ Distribution, Quantitative Whole Body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: NCPK 26 / Tissue-to-Blood Radioactivity Concentration Ratios Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 48 h Cecum NA 4.61 NA NA NA Diaphragm NA NA Esophagus NA Exorbital lacrimal gland NA Eye lens NA NA NA NA NA NA NA NA Eye uveal tract NA NA Eye(s) NA NA NA NA NA NA NA NA Fat (abdominal) NA NA NA NA NA Fat (brown) NA NA Fetal blood NA NA NA NA NA NA NA NA Fetal brain NA NA NA NA NA NA NA NA Fetal eye NA NA NA NA NA NA NA NA Fetal gastrointestinal tract NA NA NA NA NA NA NA NA Fetal heart NA NA NA NA NA NA NA NA Fetal kidney NA NA NA NA NA NA NA NA Fetal liver NA NA NA NA NA NA NA Fetal lung(s) NA NA NA NA NA NA NA NA Fetal muscle NA NA NA NA NA NA NA NA Fetal spinal cord NA NA NA NA NA NA NA NA Fetus NA NA NA NA NA NA NA NA Harderian gland NA Intervertebral ligaments NA Intra-orbital lacrimal gland NA NA

84 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 47 Table A: Pharmacokinetics: Study in Pregnant or Nursing Animals (Organ Distribution, Quantitative Whole Body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: NCPK 26 / Tissue-to-Blood Radioactivity Concentration Ratios Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 48 h Kidney cortex NA Kidney medulla NA Kidney(s) NA Large intestine NA NA Liver NA Lung(s) NA NA Lymph node(s) NA Mammary gland NA Muscle NA NA Myocardium NA NA Nasal turbinates NA NA Ovary(ies) NA NA NA Pancreas NA NA Pituitary gland NA Placenta NA NA Preputial gland NA Salivary gland(s) NA Salivary gland(s), parotid NA NA Skin (nonpigmented) NA NA Small intestine NA Spinal cord NA NA NA NA NA NA NA NA Spleen NA Stomach NA NA

85 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 48 Table A: Pharmacokinetics: Study in Pregnant or Nursing Animals (Organ Distribution, Quantitative Whole Body Autoradiography) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: NCPK 26 / Tissue-to-Blood Radioactivity Concentration Ratios Time after Dosing: 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 48 h Stomach mucosa NA Stomach wall NA NA Thymus NA Thyroid NA Urinary bladder NA NA NA NA NA Uterus NA NA Additional Information: NA: not applicable.

86 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 49 Table B: Pharmacokinetics: Study in Pregnant or Nursing Animals (Lacteal Excretion) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No. / Document Control No.: NCPK 26/ Species/ Strain: Rat/ Sprague-Dawley Sex/ Number of Animals: Female/ 3 per timepoint Feeding condition: Non-fasted Vehicle/ Formulation: 0.1 M Phosphoric acid buffer, ph 3.0/PEG400/povidone K-30/vitamin E TPGS (75:15:5:5, w/w/w/w)/ Solution Method of Administration: Oral gavage Dose: 30 mg/kg, 100 μci/kg Radionuclide: 14 C Specific activity: μci/mg Sampling Times: 0.5, 1, 4, 8, 12, 24, 48, and 72 hours Assay: Liquid scintillation counting Matrix Cmax (μg-equivalents/g) Tmax (hours) AUC(0-72 h) (μg-equivalents x h/g) Maternal Blood Maternal Milk Maternal Plasma Milk-to-Plasma Cmax AUC(INF) Concentration Ratio Additional Information: NA: not applicable. PEG: polyethylene glycol. TPGS: d-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate:

87 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 50 8 薬物動態試験 : その他の分布試験 Table A: Pharmacokinetics: Other Distribution Study (Blood Cell Partitioning) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NA/ Study system: Fresh pooled mouse, rat, dog, monkey, and human blood Daclatasvir (10 μm) was incubated in blood at 37 C for 0.5 and 2 hours. Samples of blood were then taken and split; 1 Test system and method: aliquot was hemolyzed and the other was centrifuged to obtain plasma. Hemolyzed blood and plasma were analyzed by LC-MS/MS analysis (N = 3). Species Time (h) Blood-to-Plasma Concentration Ratio ± 0.01 Mouse ± ± ± 0.05 Rat ± ± ± 0.04 Dog ± ± ± 0.08 Monkey ± ± ± 0.06 Human ± ± 0.11 Additional Information: NA: not applicable. Values are mean ± standard deviation.

88 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 51 Table B: Pharmacokinetics: Other Distribution Study (P-gp Knockout Mice) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No. NA/ Species/ Strain: Mouse/ P-gp double (mdr 1a/1b) knockout and Wild-type/ FVBETA Gender/ Number of Animals: Male/ 3 per time point Feeding condition: Fasted Vehicle/ Formulation: PEG-400/ propylene glycol/ ethanol/ water (30:25:10:35, w/w/w/w)/ Solution Method of Administration: IV bolus and oral gavage Dose (mg/kg): 3 Sample: Brain, liver, and plasma Assay: LC-MS/MS Wild-Type Route: IV Oral Analyte: Daclatasvir BMS Daclatasvir BMS Plasma AUC(0-8 h) (μg h/ml) Liver AUC(0-8 h) (μg h/ml) Brain AUC(0-8 h) (μg h/ml) BLQ BLQ Liver AUC/ plasma AUC Brain AUC/ plasma AUC NC NC P-gp Knockout (MDR 1a/1b) Route: IV Oral Analyte: Daclatasvir BMS Daclatasvir BMS Plasma AUC(0-8 h) (μg h/ml) Liver AUC(0-8 h) (μg h/ml) Brain AUC(0-8 h) (μg h/ml) Liver AUC/ plasma AUC Brain AUC/ plasma AUC Additional Information: NA: not applicable. BLQ: below lower limit of quantification (2.72 ng/ml in brain tissue). P-gp: P glycoprotein. PEG: polyethylene glycol. NC: not calculated (due to lack of quantitative data). AUC values were generated from composite concentration-time data. BMS (descarboxymethyl daclatasvir) is a metabolite of daclatasvir; see Table for structure.

89 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 52 Table C: Pharmacokinetics: Other Distribution Study (Rat Tissue Distribution) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NA/ Species/ Strain: Rat/ Sprague-Dawley Gender/ Number of Animals: Male/ 2 per time point Feeding condition: Fasted Sample: Plasma, liver, brain, heart, and spleen Assay: LC-MS/MS Analyte: Daclatasvir Vehicle/ Formulation: PEG-400 (100)/ Solution PEG-400/ Povidone K-30/ Vitamin E TPGS/ Tween 80 (95:2:2:1)/ Solution Method of Administration: Bolus injection Gavage Route: IV Oral Dose (mg/kg): 2 5 Tissue AUC(0-4 h) Tissue AUC/ AUC(0-4 h) Tissue AUC/ (μg h/ml) Plasma AUC (μg h/ml) Plasma AUC Plasma 2530 NA 1077 NA Liver Brain < LOQ NC Heart Spleen Additional Information: NA: not applicable. LOQ: lower limit of quantification (4.4 ng/ml in brain tissue). NC: not calculated. PEG: polyethylene glycol TPGS: d-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate. AUC values were generated from composite concentration-time data.

90 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 53 Table D: Pharmacokinetics: Other Distribution Study (Dog Tissue Distribution) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NA/ Species/ Strain: Dog/ Beagle Gender/ Number of Animals: Male/ 1 per time point Feeding condition: Fasted Vehicle/ Formulation: PEG-400/ ethanol/ water (60: 10: 30)/ Solution Method of Administration: Oral gavage Dose (mg/kg): 3 Sample: Plasma, heart, spleen, and liver Assay: LC-MS/MS AUC(0-T) (μg h/ml) a Analyte: Daclatasvir BMS BMS Plasma Liver Spleen < LOQ Atrium < LOQ Ventricle < LOQ Tissue AUC/ Plasma AUC Analyte: Daclatasvir BMS BMS Liver Spleen NC Atrium NC Ventricle NC Additional Information: NA: not applicable. PEG: polyethylene glycol. NC: not calculated. LOQ: lower limit of quantification (18.5 ng/ml for BMS in spleen and heart homogenates). AUC values were generated from composite concentration data. BMS (descarboxymethyl daclatasvir) and BMS (pyrrolidine-hydroxylated rearranged daclatasvir) are metabolites of daclatasvir; see Table for structures. Tissue-to-plasma ratios were calculated using plasma AUC(0-T), where 0-T is the same time span as for the AUC of the relevant tissue. a T = 24 h for BMS in all tissues and daclatasvir in plasma. T = 8 h for daclatasvir in liver. T = 4 h for daclatasvir in atrium and ventricle and for BMS in plasma and liver. T = 2 h for daclatasvir in spleen.

91 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 54 Table E: Pharmacokinetics: Organ Distribution (Monkey Liver and Bile) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No.: DM07005/ Species/ Strain: Monkey/ Cynomolgus Sex/ Number of Animals: Male/ 4 Feeding condition: Non-fasted Vehicle/ Formulation: PEG 400 / Povidone K-30 / TPGS / Tween 80 (95:2:2:1, w/w/w/w)/ Solution Method of Administration: Oral gavage Dose: 2.8 mg/kg Radionuclide: None Assay: LC-MS/MS AUC(0-T) (μg h/ml) Liver- or Bile-to-Plasma AUC Ratio Tissue Daclatasvir BMS BMS Daclatasvir BMS BMS Plasma NC NA NA NA Liver NC Bile NC Additional Information: NA: not applicable. NC: not calculated (concentrations were below limit of quantification, 23 ng/ml). PEG: polyethylene glycol. TPGS: d-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate. BMS (descarboxymethyl daclatasvir) and BMS (pyrrolidine-hydroxylated rearranged daclatasvir) are metabolites of daclatasvir; see Table for structures. For AUC(0-T), T is 24 hours except for daclatasvir in plasma, for which it is 8 hours. Four animals were dosed. One animal was sacrificed at each timepoint for collection of samples. Thus, for plasma N = 4 at 1 hour, N = 3 at 2 hours, N = 2 at 8 hours, and N = 1 at 24 hours. For bile and liver, N = 1 at each timepoint. AUC was calculated from the composite concentration-time curves.

92 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 55 9 薬物動態試験 :In vivo での代謝 Table A: Pharmacokinetics: Metabolism In Vivo (Intact Animals) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No.: NA/ Species/ Strain: Mouse/ rash2 Rat/ Sprague-Dawley Monkey/ Cynomolgus Human Gender/ Number of animals: Male/ 9 Male/ 3 Male/ 3 Male/ 6 Feeding condition: Fasted Fasted Fasted Fasted 0.1 M H3PO4 buffer (ph 0.1 M H3PO4 buffer (ph 0.1 M H3PO4 buffer (ph Vehicle/Formulation: 3)/ PEG-400/ Povidone 3)/ PEG-400/ Povidone 3)/ PEG-400/ Povidone K-30/ Vitamin E TPGS K-30/ Vitamin E TPGS K-30/ Vitamin E TPGS (75:15:5:5)/ Solution (75:15:5:5)/ Solution (75:15:5:5)/ Solution Simple syrup, NF/ 0.1 M citrate buffer ph 3 (33.3:66.6) Method of Administration: Oral gavage Oral gavage Oral gavage Oral Dose: 50 mg/kg 30 mg/kg 30 mg/kg 25 mg Specific activity (μci/mg): a b c d Compound Percent of Total Plasma Radioactivity Mouse Rat Monkey Human a 1 h 4 h 1 h 2 h 4 h 1 h 4 h 8 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h Daclatasvir BMS b 4.0 b 2.9 c 2.8 c 2.6 c 21.8 d 17.8 d 14.4 d MS MS MS BMS ND ND ND ND ND ND ND ND M9 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND M ND ND ND ND ND ND ND ND M ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND M12 ND ND ND ND ND MS 2.1 MS ND ND ND ND ND M15 MS ND ND ND ND ND ND ND ND BMS ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND M27 MS 2.4 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND In plasma, the mean Cmax and AUC(TAU) values of BMS were 57.4 ng/ml and 370 ng h/ml, respectively, after 60 mg daily oral doses of DCV for 7 days in humans. In mouse plasma, the radioactivity concentration of BMS was 282 and 352 ng DCV equivalent/ml at 1 and 4 hours postdose, respectively. In rat plasma, the radioactivity concentration of BMS was 62.1, 47.6, and 24.0 ng DCV equivalent/ml at 1, 2, and 4 hours postdose, respectively. In monkey plasma, the radioactivity concentration of BMS was 207, 522, and 130 ng DCV equivalent/ml at 1, 4, and 8 hours postdose, respectively.

93 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 56 Table A (continued): Pharmacokinetics: Metabolism In Vivo (Intact Animals) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Percent of Dose Recovered Urine Feces Mouse Rat Monkey Human Mouse Rat Monkey Human Compound (0-168 h) (0-168 h) (0-168 h) (0-72 h) (0-168 h) (0-168 h) (0-168 h) (0-144 h) Daclatasvir BMS MS ND ND ND ND ND ND ND BMS BMS ND ND M6 ND ND ND ND BMS MS ND ND ND ND ND ND ND M9 0.2 ND ND ND ND ND ND ND M ND ND ND ND ND ND ND M12 ND ND ND ND ND ND 1.9 ND M13 ND ND ND ND ND ND M15 ND ND ND ND 1.0 ND M16 ND ND ND ND ND ND M17 ND ND ND ND ND ND 0.6 ND BMS ND M21 ND ND ND ND ND 4.1 ND 2.4 M24 ND ND ND ND ND 2.8 ND ND M27 MS ND ND ND ND ND ND ND Percentage of dose recovered as metabolites Additional Information: NA: not applicable. ND: not detected by radioactivity detection. MS: presence of metabolite detected by LC-MS/MS. Values are from analysis of pooled samples. M9 and M28 co-eluted in mouse and BDC dog plasma. See Table for structures. Of the dose, 19.2%, 27.5%, 27.1%, and 30.1% was recovered as metabolites in mice, rats, monkeys, and humans, respectively. BMS : pyrrolidine-hydroxylated rearranged daclatasvir; BMS : descarboxymethyl daclatasvir; M9: descarboxymethyl BMS ; M28: desimidazodaclatasvir napthoic acid; M6, BMS , M11, BMS : hydroxydaclatasvir; M12: dioxy daclatasvir; M13: hydrated daclatasvir; M15, M27: monooxy daclatasvir; BMS : desimidazodaclatasvir-2-oxo-napthyl ethanoic acid; M16, M17: carboxy daclatasvir; M21: desimidazodaclatasvir-2,3-dioxo-napthyl; M24: bisoxy daclatasvir Note: The in vivo metabolism results reported in DCN are not presented since they are superseded by the above data.

94 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 57 Table A (continued): Pharmacokinetics: Metabolism In Vivo (Intact Animals) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No.: NCPK6 / Species/ Strain: Rabbit/ New Zealand White Gender/ Number of animals: Female/ 3 Feeding condition: Fasted Vehicle/Formulation: 0.1 M H 3 PO 4 buffer (ph 3)/ PEG-400/ Povidone K-30/ Vitamin E TPGS (75:15:5:5)/ Solution Method of Administration: Oral gavage Dose: 40 mg/kg (40 μci/kg) Specific activity (μci/mg): 3.35 Percent of Total Radioactivity Percent of Dose Recovered Plasma Feces Compound 1 h 4 h 8h 12 h h Daclatasvir BMS BMS a 1.2 a 1.4 a 1.9 a 3.6 BMS M M M M13 ND ND ND ND 2.9 M15 MS 0.1 MS MS 0.7 M16 ND ND ND ND 1.5 M17 ND ND ND ND 1.1 BMS M21 ND ND ND ND 2.1 M24 ND ND ND ND 2.0 M27 MS 0.3 MS M M MS MS 0.6

95 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 58 Table A (continued): Pharmacokinetics: Metabolism In Vivo (Intact Animals) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No.: NCPK6 / Percent of Total Radioactivity Percent of Dose Recovered Plasma Feces Compound 1 h 4 h 8h 12 h h Percentage of dose recovered as metabolites in feces NA NA NA NA 26.2 Additional Information: NA: not applicable. ND: not detected by radioactivity detection. PEG: polyethylene glycol. TPGS: d-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate. MS: presence of metabolite detected by LC-MS/MS. Values are from analysis of pooled samples. M9 and M28 co-eluted in mouse and BDC dog plasma. See Table for structures. BMS : hydroxy daclatasvir; BMS : pyrrolidine-hydroxylated rearranged daclatasvir; BMS : descarboxymethyl daclatasvir; M6 and M12: dioxy daclatasvir; M9: descarboxymethyl BMS ; M15 and M27: monooxy daclatasvir; BMS : desimidazodaclatasvir-2-oxo-napthyl ethanoic acid; M16 and M17: carboxy daclatasvir; M21: desimidazodaclatasvir-2,3-dioxo-napthyl. M28: desimidazodaclatasvir napthoic acid. a In rabbit plasma, the radioactivity concentration of BMS was 751, 918, 652, and 398 ng DCV equivalent/ml at 1, 4, 8, and 12 hours postdose, respectively. The estimated AUC(0-12h) was 8121 ng h/ml.

96 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 59 Table B: Pharmacokinetics: Metabolism In Vivo (Bile Duct-cannulated Animals) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No.: NA/ Species/ Strain: Rat/ Sprague Dawley (BDC) Dog/ Beagle (BDC) Monkey/ Cynomolgus (BDC) Gender/ Number of animals: M/3 Male/ 3 M/3 Feeding condition: Fasted Fasted Fasted 0.1 M H 3 PO 4 buffer (ph 0.1 M H 3 PO 4 buffer (ph 0.1 M H 3 PO 4 buffer (ph 3)/ Vehicle/Formulation: 3)/PEG400/Povidone 3)/ PEG-400/ Povidone PEG-400/ Povidone K-30/ K-30/Vitamin E TPGS K-30/ Vitamin E TPGS Vitamin E TPGS (75:15:5:5)/ Solution (75:15:5:5)/ Solution (75:15:5:5)/ Solution Method of Administration: Oral gavage Oral gavage Oral gavage Dose (mg/kg): Specific activity (μci/mg): Percent of Total Plasma Radioactivity BDC Dog Compound 1.5 h 4 h 8 h Daclatasvir BMS MS MS MS BMS MS M9 M28 MS BMS ND ND ND M12 ND ND ND M MS MS BMS ND ND ND M27 ND ND ND

97 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 60 Table B (continued): Pharmacokinetics: Metabolism In Vivo (Bile Duct-cannulated Animals) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Percent of Dose Recovered BDC Rat BDC Dog BDC Monkey Compound Urine (0-48 h) Bile (0-48 h) Feces (0-48 h) Urine (0-72 h) Bile (0-72 h) Feces (0-72 h) Urine (0-72 h) Bile (0-72 h) Feces (0-72 h) Daclatasvir BMS ND ND 0.1 ND ND MS ND BMS M3 ND ND ND ND ND ND ND 0.3 ND BMS M5 ND ND ND ND ND ND ND 0.2 ND M6 ND ND 2.6 ND ND 0.2 ND ND 0.8 BMS ND ND ND ND ND ND ND ND M8 ND ND ND ND ND ND ND 0.4 ND M9 ND ND ND M28 ND ND ND ND ND ND ND M10 ND ND ND ND ND ND ND BMS ND 2.5 ND ND ND ND ND 0.1 ND M12 ND 0.4 ND ND 0.1 ND M13 ND ND ND ND ND ND ND M14 ND ND ND ND ND ND ND M15 ND 0.5 ND ND ND ND ND 0.03 ND M16 ND ND ND 0.5 ND M17 ND ND ND ND ND BMS ND ND 1.6 ND M21 ND ND 2.5 ND ND ND ND ND ND M22 ND ND ND ND ND ND ND M23 ND ND ND ND ND ND ND ND 2.7 M24 ND ND 2.8 ND ND ND ND ND 1.5 M26 ND ND ND ND ND ND ND 0.2 ND M27 ND 0.5 ND ND ND ND ND MS ND

98 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 61 Table B (continued): Pharmacokinetics: Metabolism In Vivo (Bile Duct-cannulated Animals) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Percent of Dose Recovered BDC Rat BDC Dog BDC Monkey Compound Urine (0-48 h) Bile (0-48 h) Feces (0-48 h) Urine (0-72 h) Bile (0-72 h) Feces (0-72 h) Urine (0-72 h) Bile (0-72 h) Feces (0-72 h) Percentage of dose recovered as metabolites Additional Information: NA: not applicable. ND: not detected by radioactivity detection. MS: presence of metabolite detected by LC-MS/MS. Values are from analysis of pooled samples. BDC: bile duct cannulated. M9 and M28 co-eluted in BDC rat and monkey plasma. See Table for structures. The majority of the in vivo metabolism results reported in DCN are not presented since they are superseded by the above data. BMS : pyrrolidine-hydroxylated rearranged daclatasvir; M3: desimidazo daclatasvir taurine conjutate; BMS : descarboxymethyl daclatasvir; M5: Tetraoxy daclatasvir; BMS : hydroxy daclatasvir; M8: bisoxy hydroxy daclatasvir; M9: descarboxymethyl BMS ; M10, M14, and M26: hydroxy BMS ; M28: desimidazodaclatasvir napthoic acid; M6, BMS , M11: BMS , and BMS : hydroxy daclatasvir; M12: dioxy daclatasvir; M13: hydrated daclatasvir; M15, M27: monooxy daclatasvir; BMS : desimidazodaclatasvir-2-oxo-napthyl ethanoic acid; M16, M17: carboxy daclatasvir; M21: desimidazodaclatasvir-2,3-dioxo-napthyl; M22: O-desmethyl daclatasvir glucuronide; M23: keto daclatasvir; M24: bisoxy daclatasvir; M28: desimidazodaclatasvir napthoic acid

99 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 薬物動態試験 :In vitro での代謝 Table A: Pharmacokinetics: Metabolism In Vitro (Metabolism Rate) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NA/ Type of Study: Evaluation of in vitro metabolism rates of daclatasvir in liver microsomes and hepatocytes from various species Method: Daclatasvir (0.5 μm) was incubated with liver microsomes (1 mg protein/ml) in the presence of NADPH (1 mm) at 37 C for 120 minutes. Daclatasvir (3 μm) was also incubated with hepatocytes at 37 C for 2 hours. Metabolism rates were determined based on the parent drug disappearance, as measured by LC-MS/MS. N=3. Mouse Rat Dog Monkey Human Metabolism rate in liver microsomes (pmol/min/mg protein): Metabolism rates in hepatocytes (pmol/min/10 6 cells): Additional Information: NA: not applicable. NADPH: β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate.

100 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 63 Table B: Pharmacokinetics: Metabolism In Vitro (Metabolic Fate) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No. NA/ Liver microsomes (1 mg protein/ml): 10 μm [ 14 C]daclatasvir, 1-hour incubation with NADPH (1 mm), with and without glutathione Study system: (5 mm) at 37 C. Liver S9 fraction from mouse, Aroclor 1254-pretreated rats, dog, monkey, and human: 10 μm daclatasvir, 1-hour incubation at 37 C. Hepatocytes: 10 μm daclatasvir, 4-hour incubation at 37 C. Type of Study: In vitro metabolite profiling by LC-MS/Radioactivity Percent of Sample Radioactivity Mouse Rat Rabbit Dog Monkey Human Metabolite H M S H M S M H M S H M S H M S Daclatasvir BMS ND ND ND MS ND ND MS MS ND ND MS ND ND MS BMS BMS MS MS M6 ND MS MS ND MS 0.9 ND ND MS MS ND ND ND ND 0.2 ND M9 MS MS MS MS MS ND MS MS MS MS 2.9 MS MS ND ND ND BMS MS ND MS ND ND MS MS ND ND ND ND ND MS MS MS M12 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 2.7 ND ND ND ND ND M13 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND MS ND ND ND ND ND BMS MS MS 0.4 MS MS 1.4 MS MS ND ND MS 0.3 MS MS 0.3 MS M27 MS MS MS MS ND ND MS ND ND ND MS ND ND MS ND ND M28 MS MS 0.3 MS MS MS MS MS MS MS Additional Information: NA: not applicable. ND: not detected. MS: presence of metabolite detected by LC-MS/MS. H: hepatocytes. M: microsomes. S: hepatic S9 fraction from Aroclor 1254-induced rats. NADPH: β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. BMS : hydroxy daclatasvir; BMS : pyrrolidine-hydroxylated, rearranged daclatasvir. BMS : descarboxymethyl daclatasvir; M6: hydroxydaclatasvir; M9: descarboxymethyl BMS ; BMS : hydroxydaclatasvir; M12: dioxy daclatasvir; M13: hydrated daclatasvir; BMS-95238: desimidazodaclatasvir-2-oxo-napthyl ethanoic acid; M27: monooxy daclatasvir; M28: desimidazodaclatasvir napthoic acid. See Table for structures.

101 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 64 Table C: Pharmacokinetics: Metabolism In Vitro (Cytochrome P450 Reaction Phenotyping) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No. NA/ Type of Study: Determination of major CYP isoforms responsible for daclatasvir metabolism in human liver microsomes. Incubation of daclatasvir (0.5 μm) in human liver microsomes (2 mg protein/ml) at 37 C for 1.5 hours with or without selective chemical inhibitors. Furafylline and troleandomycin were preincubated in the incubation mixture for 15 minutes in Methods: the presence of NADPH and the reaction then initiated by adding daclatasvir. Other inhibitors were added concurrently with daclatasvir for a 5-minute preincubation, and the reaction was then initiated by adding NADPH. Turnover of daclatasvir was determined by measuring the disappearance of daclatasvir except in the case of CYP2C9, in which the appearance of the metabolite, BMS , was monitored. Quantification of daclatasvir and BMS was by LC-MS/MS. Percent Inhibition of BMS Formation Percent Inhibition of Daclatasvir Inhibitor: Sulfaphenazole Furafylline Benzylnirvanol Quinidine Ketoconazole Troleandomycin Inhibitor Concentration (μm): CYP inhibited: CYP2C9 CYP1A2 CYP2C19 CYP2D6 CYP3A4 CYP3A4 % Inhibition at 1.5 hr Additional Information: NA: not applicable. NADPH: β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. Inhibition of metabolism by more than 35% is considered meaningful due to the relatively-modest turnover of daclatasvir (~50% at 2 hours).

102 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 65 Table C (continued): Type of study: Methods: Pharmacokinetics: Metabolism In Vitro (Reaction Phenotyping) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NCPK 18/ Determination of major cytochrome P450 (CYP) isoforms responsible for daclatasvir metabolism by measuring the formation rate of BMS and BMS by individual human cdna-expressed CYP enzymes. Daclatasvir was incubated with recombinant singly-expressed CYP isozymes (Supersomes ), 50 pmol/ml, and 1 mm NADPH for 30 minutes. BMS and BMS were quantitated using LC-MS/MS. N = 3. Relative Percentage of BMS Formation Relative Percentage of BMS Formation Isozyme 2 μm Daclatasvir 10 μm Daclatasvir 2 μ Daclatasvir 10 μm Daclatasvir CYP1A2 0 0 < 0.1 < 0.1 CYP2A6 0 0 < 0.1 < 0.1 CYP2B6 0 0 < 0.1 < 0.1 CYP2C ± ± ± ± CYP2C9 0 0 < 0.1 < 0.1 CYP2C ± ± CYP2D6 0 0 < 0.1 < 0.1 CYP2E1 0 0 < 0.1 < 0.1 CYP2J2 0 0 < 0.1 < 0.1 CYP3A ± ± ± ± 4.48 CYP3A ± ± ± ± 1.8 FMO3 0 0 < 0.1 < 0.1 FMO5 0 0 < 0.1 < 0.1 HLM 100 ± ± ± ± 2.3 Additional Information: NADPH: β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate.

103 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 66 a Table C (continued): Pharmacokinetics: Metabolism In Vitro (Reaction Phenotyping) Test Articles: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No. NCPK 18/ Type of study: Determination of major cytochrome P450 (CYP) isoforms responsible for daclatasvir metabolism by measuring the effect of CYP-selective chemical inhibitors on the formation of BMS and BMS For time-dependent inhibitors, HLM were pre-incubated with the inhibitors and 1 mm NADPH for 10 minutes at 37 C prior to the Methods: addition of daclatasvir. Additional NADPH (1 mm) and daclatasvir (2 or 20 μm) were then added and the incubations were continued for 30 minutes. BMS and BMS were quantitated using LC-MS/MS. N = 3. Enzyme(s) Inhibited BMS Formation Rate (Percent of Control) BMS Formation Rate (Percent of Control) Inhibitor (Concentration) 2 μm Daclatasvir 20 μm Daclatasvir 2 μm Daclatasvir 20 μm Daclatasvir Furafylline (10 μm) a CYP1A ± ± ± ± 3.7 Tranylcypromine (2 μm) CYP2A6 104 ± ± ± ± 0.8 Thio-TEPA (50 μm) a CYP2B6 121 ± ± ± ± 4.5 Montelukast (3 μm) CYP2C ± ± ± ± 7.2 Sulfaphenazole (10 μm) CYP2C9 104 ± ± ± ± 6.0 Benzylnirvanol (1 μm) CYP2C ± ± ± ± 3.8 Quinidine (1 μm) CYP2D6 102 ± ± ± ± 3.8 Diethyldithiocarbamate (50 μm) a CYP2E ± ± ± ± 2.9 Ketoconazole (1 μm) CYP3A ± ± ± ± 0.33 Troleandomycin (20 μm) a CYP3A ± ± ± ± Aminobenzotriazole (1000 μm) a All CYPs 3.34 ± ± ± ± 0.24 Additional Information: NADPH: β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. HLM: human liver microsomes. Time-dependant inhibition study design.

104 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 67 Table C (continued): Pharmacokinetics: Metabolism In Vitro (Reaction Phenotyping) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NCPK 18/ Type of study: Determination of major cytochrome P450 (CYP) isoforms responsible for daclatasvir metabolism by measuring the formation rate of BMS and BMS by individual human cdna-expressed CYP enzymes. Methods: Daclatasvir was incubated with recombinant singly-expressed CYP isozymes (Supersomes ), 50 nm, and 1 mm NADPH for 30 minutes. BMS and BMS were quantitated using LC-MS/MS. N = 3. Isozyme Model Product Km (μm) Vmax (pmol/min/mg) a Vmax/Km (μl/min/mg) b HLM Michaelis-Menten BMS ± 1.6 ND ND HLM Substrate inhibition 7.19 ± ± CYP3A4 Michaelis-Menten BMS ± ± CYP3A5 Michaelis-Menten 9.14 ± ± Additional Information: ND: not determined. HLM: human liver microsomes. NADPH: β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. a HLM data are expressed as pmol/min/mg protein, while CYP3A4 and CYP3A5 data are expressed as pmol/min/pmol expressed enzyme. b HLM data are expressed as μl/min/mg protein, while CYP3A4 and CYP3A5 data are expressed as μl/min/pmol expressed enzyme.

105 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 68 Table D: Study system: Radiolabel: Detection: Pharmacokinetics: Metabolism In Vitro (Covalent Binding) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD , CTD Study No./Document Control No.: NA/ , NA/ Rat, monkey, and human liver microsomes were incubated with [ 3 H]daclatasvir (10 μm). Incubations were conducted with NADPH (1 mm) in the presence and absence of GSH (5 mm) at 37 C for 60 minutes. Protein was precipitated and washed 4 times with 80% methanol. Concentration of protein in each vial was determined using the bicinchoninic assay (BCA). Protein-associated radioactivity was measured by liquid scintillation counting. 3 H Liquid scintillation counting [ 3 H]Daclatasvir Covalent Binding Rate (pmol/mg/h) Without NADPH With NADPH With NADPH and GSH Species Human 15.8 ± ± ± 7.2 Rat 13.0 ± ± ± 3.0 Monkey 19.6 ± ± ± 5.8 [ 3 H]Imipramine Covalent Binding Rate (pmol/mg/h) Human 16.5 ± ± ± 9.6 Additional Information: NA: not applicable. [ 3 H]Imipramine was the positive control. GSH: glutathione. NADPH: β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate.

106 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 69 Table D (continued): Pharmacokinetics: Metabolism In Vitro (Covalent Binding) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NA/ Rat, dog, and human liver microsomes were incubated with [ 14 C]daclatasvir (10 μm). Incubations were conducted with Study system: NADPH (1 mm) in the presence and absence of GSH (5 mm) at 37 C for 60 minutes. Protein was precipitated and washed 4 times with 80% methanol. Concentration of protein in each vial was determined using the bicinchoninic assay (BCA). Protein-associated radioactivity was measured by liquid scintillation counting. Radiolabel: 14 C Detection: Liquid scintillation counting [ 14 C]Daclatasvir Covalent Binding Rate (pmol/mg/h) Species Without NADPH With NADPH With NADPH and GSH Human 25.6 ± ± ± 9.1 Rat 34.7 ± ± ± 2.0 Dog 29.2 ± ± ± 8.6 [ 3 H]Imipramine Covalent Binding Rate (pmol/mg/h) Human 12.5 ± ± ± 2.7 Rat 14.7 ± ± ± 13.2 Additional Information: NA: not applicable. [ 3 H]imipramine was a positive control. GSH: glutathione. NADPH: β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate.

107 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 薬物動態試験 : 推定代謝経路 Table : Pharmacokinetics: Proposed Metabolic Pathways Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD and CTD Study No./Document Control No.: NA/ and Study System: Incubation of hepatocytes, microsomes, and liver S9 fraction with daclatasvir. Plasma, bile, urine, and feces after oral administration of daclatasvir to mice, rats, rabbits, BDC rats, BDC dogs, monkeys, BDC monkeys, and humans. Assay: LC-UV/MS and LC-MS/radioactivity

108 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 71 Table : Pharmacokinetics: Proposed Metabolic Pathways Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD and CTD Study No./Document Control No.: NA/ and

109 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 72 Table : Pharmacokinetics: Proposed Metabolic Pathways Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD and CTD Study No./Document Control No.: NA/ and Name Description BMS Daclatasvir BMS Hydroxy daclatasvir BMS Pyrrolidine-hydroxylated, rearranged daclatasvir M3 Desimidazo daclatasvir taurine conjutate BMS Descarboxymethyl daclatasvir M5 Tetraoxy daclatasvir M6 Hydroxy daclatasvir BMS Hydroxy daclatasvir M8 Bisoxy hydroxy daclatasvir M9 Descarboxymethyl BMS M10 Hydroxy BMS BMS Hydroxy daclatasvir M12 Dioxy daclatasvir M13 Hydrated daclatasvir M14 Hydroxy BMS M15 Monooxy daclatasvir M16 Carboxy daclatasvir M17 Carboxy daclatasvir BMS Desimidazodaclatasvir-2-oxo-napthyl ethanoic acid M21 Desimidazodaclatasvir-2,3-dioxo-napthyl M22 O-Desmethyl daclatasvir glucuronide M23 Keto daclatasvir M24 Bisoxy daclatasvir M26 Hydroxy BMS M27 Monooxy daclatasvir M28 Desimidazodaclatasvir napthoic acid Additional Information: NA: not applicable. BDC: bile duct-cannulated.

110 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 薬物動態試験 : 薬物代謝酵素の誘導 / 阻害 Table A: Pharmacokinetics: Induction/Inhibition of Drug-Metabolizing Enzymes (Inhibition of Recombinant Cytochrome P450) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NA/ Method: Daclatasvir (2 nm to 40 μm) incubated with individual recombinant CYPs and CYP-specific substrates that produce fluorescent metabolites in the presence of an NADPH-regenerating system at 37 C. Assay: Fluorescence detection Substrate Isozyme IC 50 for CYP Inhibition (μm) 3-Cyano-7-ethoxycoumarin CYP1A2 > 40 7-Methoxy-4-trifluoromethylcoumarin CYP2C Cyano-7-ethoxycoumarin CYP2C19 > 40 3-[2-N, N-diethyl-N-methylamino) ethyl]-7-methoxy-4-methylcoumarin CYP2D6 > 40 7-Benzyloxy-4-trifluromethylcoumarin CYP3A Resorufin benzyl ester CYP3A4 7.9 Additional Information: NA: not applicable. IC 50 : concentration that inhibits by 50%. CYP: cytochrome P450. NADPH: β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate.

111 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 74 Table B: Pharmacokinetics: Induction/Inhibition of Drug-Metabolizing Enzymes (Inhibition of Microsomal Cytochrome P450) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No.: NA/ Method: Human liver microsomes pre-incubated with daclatasvir for 0 or 30 minutes in the presence of NADPH, followed by addition of probe substrate. Incubation time varied with substrate. Concentration: 0.002, 0.006, 0.018, 0.055, 0.165, 0.490, 1.48, 4.40, 13.3, and 40.0 μm Assay: Solid-phase extraction with tandem mass spectrometry. Reaction Isozyme Reversible IC 50 (μm) Metabolism-dependant IC 50 (μm) Tacrine 1 -hydroxylation CYP1A2 > 40 > 40 Bupropion hydroxylation CYP2B6 > 40 > 40 Amodiaquine N-deethylation CYP2C8 > 40 > 40 Diclofenac 4 -hydroxylation CYP2C9 > 40 > 40 S-mephenytoin 4 -hydroxylation CYP2C19 > 40 > 40 Dextromethorphan O-demethylation CYP2D6 > 40 > 40 Midazolam 1 -hydroxylation CYP3A Testosterone 6β-hydroxylation CYP3A Additional Information: NA: not applicable. IC 50 : concentration that inhibits by 50%. CYP: cytochrome P450. NADPH: β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. Reversible inhibition results taken from experiment with no preincubation; metabolism-dependant inhibition results taken from experiment with 30-minute preincubation.

112 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 75 Table C: Method: Incubation time: Concentrations: Assay: Pharmacokinetics: Induction/Inhibition of Drug-Metabolizing Enzymes (Human Pregnane-X Receptor Transactivation Assay) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No.: NA/ Human pregnane-x receptor transactivation assay with HepG2/C3A cells transfected with human pregnane-x receptor and luciferase reporter. Rifampicin was included as a positive control. 24 hours , , 0.023, 0.069, 0.20, 0.62, 1.85, 5.50, 16.6, and 50.0 μm Luciferase assay system; chemiluminescence assay Substrate EC 50 (μm) Maximum Observed Transactivation Activity (%) Daclatasvir > Additional Information: NA: not applicable. EC 50 : concentration at which 50% activation is observed compared to activation by rifampicin (10 μm). Maximum observed transactivation activity expressed as a percent of transactivation activity observed for 10 μm rifampicin.

113 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 76 Table D: Pharmacokinetics: Induction/Inhibition of Drug-Metabolizing Enzymes (Induction of Cytochrome P450 in Human Hepatocytes) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No: / Study System: Incubation in human hepatocytes from 3 individual donors. Assessment of CYP activity in these hepatocytes via measurement of marker substrate metabolism and measurement of mrna levels. Incubation Time: 72 hours Concentration: 0.22, 2.2, and 13 μm Assay: LC-MS/MS (activity), real-time quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction assay (mrna) Percent of Positive Control a Phenacetin O-dealkylation (CYP1A2) Bupropion hydroxylation (CYP2B6) Testosterone 6β-hydroxylation (CYP3A4) Treatment Activity mrna Level Activity mrna Level Activity mrna Level Daclatasvir (0.22 μm) 1.28 ± ± ± ± ± ± 0.40 Daclatasvir (2.2 μm) 2.18 ± ± ± ± ± ± 0.83 Daclatasvir (13 μm) 2.56 ± ± ± ± ± ± 4.2 Additional Information: NA: not applicable. CYP: cytochrome P450. Values are mean ± standard deviation. Increase in enzyme activity by positive controls: 58- to 206-fold in CYP1A2 by 3-methylcholanthrene, 11- to 37-fold in CYP2B6 by phenobarbital, 29- to 62-fold in CYP3A4 by rifampicin. Increase in mrna level by positive controls: 204- to 1340-fold in CYP1A2 by 3-methylcholanthrene, 21- to 105-fold in CYP2B6 by phenobarbital, 52- to 144-fold in CYP3A4 by rifampicin. Percent of positive control = 100 x (value in daclatasvir-treated cells) - (value in vehicle-treated cells) (value in positive control-treated cells) - (value in vehicle-treated cells) a Note that a negative value is obtained if the value in vehicle control is greater than that in the daclatasvir-treated cells.

114 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 77 Table D (continued): Pharmacokinetics: Induction/Inhibition of Drug-Metabolizing Enzymes (Induction of Cytochrome P450 in Cryopreserved Human Hepatocytes) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No: NCPK 33/ Study System: Incubation in cryopreserved human hepatocytes from 3 individual donors. Assessment of CYP activity in these hepatocytes via measurement of marker substrate metabolism and measurement of mrna levels. Incubation Time: 72 hours Concentration: 0.22, 0.43, 1.01, 2.17, 3.38, 5.41, 8.12, and 13.0 μm Assay: LC-MS/MS (activity), real-time quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction assay (mrna) Percent of Positive Control a Phenacetin O-dealkylation (CYP1A2) Bupropion hydroxylation (CYP2B6) Testosterone 6β-hydroxylation (CYP3A4) Treatment Activity mrna Level Activity mrna Level Activity mrna Level DMSO (0.1%, v/v) 0.30 ± ± ± ± ± ± 0.00 Daclatasvir (0.22 μm) 0.31 ± ± ± ± ± ± 0.12 Daclatasvir (0.43 μm) 0.30 ± ± ± ± ± ± 0.16 Daclatasvir (1.01 μm) 0.34 ± ± ± ± ± ± 0.54 Daclatasvir (2.17 μm) 0.38 ± ± ± ± ± ± 0.43 Daclatasvir (3.38 μm) 0.41 ± ± ± ± ± ± 2.82 Daclatasvir (5.41 μm) 0.49 ± ± ± ± ± ± 3.5 Daclatasvir (8.12 μm) 0.52 ± ± ± ± ± ± 6.8 Daclatasvir (13.0 μm) 0.64 ± ± ± ± ± ± 9.7 Omeprazole (50 μm) 16.2 ± ± 31.7 NA NA NA NA Phenobarbital (750 μm) NA NA 9.03 ± ± 2.70 NA NA

115 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 78 Table D (continued): Pharmacokinetics: Induction/Inhibition of Drug-Metabolizing Enzymes (Induction of Cytochrome P450 in Cryopreserved Human Hepatocytes) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No: NCPK 33/ Percent of Positive Control a Phenacetin O-dealkylation (CYP1A2) Bupropion hydroxylation (CYP2B6) Testosterone 6β-hydroxylation (CYP3A4) Treatment Activity mrna Level Activity mrna Level Activity mrna Level Rifampin (10 μm) NA NA NA NA 162 ± ± 9.0 Flumazenil (50 μm) 0.32 ± ± ± ± ± ± 0.27 Additional Information: NA: not applicable. CYP: cytochrome P450. Values are mean ± standard deviation. Omerprazole, phenobarbital, and rifampin are the positive controls for CYP1A2, CYP2B6, and CYP3A4/5, respectively. DMSO is the vehicle control. Increase in enzyme activity by positive controls: 23- to 92-fold in CYP1A2 by omepreazole, 8- to 31-fold in CYP2B6 by phenobarbital, 14- to 31-fold in CYP3A4 by rifampicin. Increase in mrna level by positive controls: 42- to 104-fold in CYP1A2 by omepreazole, 8- to 13-fold in CYP2B6 by phenobarbital, 8- to 26-fold in CYP3A4 by rifampicin. Percent of positive control = 100 (value in daclatasvir-treated cells) - (value in vehicle-treated cells) (value in positive control-treated cells) - (value in vehicle-treated cells) a Values are the mean ± standard deviation (N = 3)

116 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 79 Table E: Pharmacokinetics: Induction/Inhibition of Drug-Metabolizing Enzymes (Inhibition of UDP-glucuronosyltransferase) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No.: NCPK 8/ Method: Human liver microsomes (0.5 mg/ml) were incubated for 15 minutes at 37 C with daclatasvir, UDPGA (2 mm), and β-estradiol (30 μm a ), a UGT1A1 substrate. Atazanavir, a UGT1A1 inhibitor, was included as a positive control. Incubation time: 15 minutes Concentrations: 0, 0.01, 0.05, 0.20, 0.78, 3.13, 12.5, and 50 μm Assay: LC-MS/MS Inhibitor IC 50 (μm) Daclatasvir 12.7 Atazanavir (positive control) Additional Information: NA: not applicable. IC 50 : concentration at which 50% activation is observed. UDPGA: uridine diphosphate glucuronic acid. UGT: UDP-glucuronosyltransferase. a Concentration ~ equal to the Km for metabolism of β-estradiol by UGT1A1.

117 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 薬物動態試験 : 累積排泄 Table A: Pharmacokinetics: Excretion (Mouse) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control Number: MBA00393/ Species/ Strain: Mouse/ rash2 Gender/ Number of Animals: Male/ 9 Feeding condition: Fasted Vehicle/ Formulation: 0.1 M Phosphoric acid buffer, ph 3.0/PEG-400/povidone K-30/vitamin E TPGS (75:15:5:5, %w/w)/ Solution Method of Administration: Oral gavage Dose: 50 mg/kg (166.7 μci/kg) Analyte: Total radioactivity, 14 C Assay: Combustion (feces only), liquid scintillation counting Percent of Dose Recovered a Time (h) Urine Feces Total ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.33 b Additional Information: PEG: polyethylene glycol. TPGS: d-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate. Values are mean ± standard deviation. a Recovery was based on 3 cages with 3 mice/cage b Includes cage wash, cage wipe, and cage debris.

118 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 81 Table B: Pharmacokinetics: Excretion (Rat) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control Number: MBA00391/ Species/ Strain: Rat/ Sprague-Dawley Gender/ Number of Animals: Male/ 3 Feeding condition: Fasted Vehicle/ Formulation: 0.1 M Phosphoric acid buffer, ph 3.0/PEG-400/povidone K-30/vitamin E TPGS (75:15:5:5, %w/w)/ Solution Method of Administration: Oral gavage Dose: 30 mg/kg (100 μci/kg) Analyte: Total radioactivity, 14 C Assay: Combustion (feces only), liquid scintillation counting Percent of Dose Recovered Time (h) Urine Feces Total ± 0.04 NA ± 0.04 NA ± 0.14 NA ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 1.94 a Additional Information: NA: not applicable. PEG: polyethylene glycol. TPGS: d-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate. Values are mean ± standard deviation. a Includes cage wash, cage wipe, and cage debris.

119 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 82 Table C: Pharmacokinetics: Excretion (Rabbit) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control Number: / Species/ Strain: Rabbit/ New Zealand White Gender/ Number of Animals: Female/ 3 Feeding condition: Fasted Vehicle/ Formulation: 0.1 M Phosphoric acid buffer, ph 3.0/PEG-400/povidone K-30/vitamin E TPGS (75:15:5:5, %w/w)/ Solution Method of Administration: Oral gavage Dose: 40 mg/kg (40 μci/kg) Analyte: Total radioactivity, 14 C Assay: Combustion (feces only), liquid scintillation counting Percent of Dose Recovered Time (h) Urine Feces Total ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 1.14 a Additional Information: PEG: polyethylene glycol. TPGS: d-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate. Values are mean ± standard deviation. a Includes cage wash, cage wipe, and cage debris.

120 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 83 Table D: Pharmacokinetics: Excretion (Monkey) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control Number: MBA00394/ Species/ Strain: Monkey/ Cynomolgus Gender/ Number of Animals: Male/ 3 Feeding condition: Fasted Vehicle/ Formulation: 0.1 M Phosphoric acid buffer, ph 3.0/PEG-400/povidone K-30/vitamin E TPGS (75:15:5:5, %w/w)/ Solution Method of Administration: Oral gavage Dose: 30 mg/kg (40 μci/kg) Analyte: Total radioactivity, 14 C Assay: Combustion (feces only), liquid scintillation counting Percent of Dose Recovered Time (h) Urine Feces Total ± 0.14 NA ± 0.10 NA ± 0.62 NA ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 1.85 a Additional Information: NA: not applicable. PEG: polyethylene glycol. TPGS: d-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate. Values are mean ± standard deviation. a Includes cage wash, cage wipe, and cage debris (total 19.7% of dose).

121 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 84 a Table E: Pharmacokinetics: Excretion (Human) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: MBA00411/ Species: Human Gender/ Number of Animals: Male/ 6 Feeding condition: Fasted Vehicle/ Formulation: 33.3% (w/w) simple syrup, NF, and 66.6% 0.1 M citrate buffer (ph3)/ Solution Method of Administration: Oral syringe Dose: 25 mg, μci Analyte: Total radioactivity, 14 C Assay: Combustion (feces only), liquid scintillation counting Percent of Dose Recovered Time (h) Urine Feces Total ±1.93 a 12.7 ± 18.1 (N = 4) ± ± ± ± 13.9 (N = 5) ± ± ± ± 2.60 (N = 5) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.07 (N = 5) ± ± ± 1.66 Urine data for 0-12 and hour intervals were combined into 0-24 hour interval.

122 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 薬物動態試験 : 胆汁中排泄 Table : Pharmacokinetics: Excretion into Bile (Bile Duct-cannulated Animals) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control Number: NA/ Species/ Strain: Rat/ Sprague-Dawley (BDC) Dog/ Beagle (BDC) Monkey/ Cynomolgus (BDC) Gender/ Number of animals: Male/ 3 Male/ 2 Male/ 2 Feeding condition: Non-fasted Non-fasted Non-fasted Vehicle/ Formulation: Propylene glycol/ethanol/ PEG-400/ethanol/phosphate buffer cremophor EL/water PEG-400/ water (85:15)/ Solution (60:10:30)/ Solution (40:10:10:40)/ Solution Method of Administration: IV bolus IV infusion, 10 minutes IV infusion, 10 minutes Dose (mg/kg): Analyte: Daclatasvir, BMS , and BMS Daclatasvir, and BMS Assay: LC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS Species Analyte Percent of Dose Recovered as Daclatasvir and Metabolites Urine Bile Feces Total Daclatasvir Rat BMS BMS Dog Monkey Daclatasvir, BMS , and BMS Daclatasvir BMS Daclatasvir BMS BMS Additional Information: NA: not applicable. BDC: bile duct-cannulated. PEG: polyethylene glycol. Values are mean. Pooled urine, bile, and fecal samples from rat (0-24 h), dog (0-72 h), and monkey (0-72 h) were analyzed. BMS (descarboxymethyl daclatasvir) and BMS (pyrrolidine-hydroxylated rearranged daclatasvir) are metabolites of daclatasvir. See Table for structures.

123 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 86 Table (continued): Pharmacokinetics: Excretion into Bile (Bile Duct-cannulated Animals) Test Article: [ 14 C]Daclatasvir Location in Dossier: CTD , CTD Study No./Document Control Number: MBA00392/ PK_3852/ PK_3855/ Species/ Strain: Rat/ Sprague-Dawley (BDC) Dog/ Beagle (BDC) Monkey/ Cynomolgus (BDC) Gender/ Number of Animals: Male/ 3 Male/ 3 Male/ 3 Feeding condition: Fasted Fasted Fasted 0.1 M H 3 PO 4 buffer (ph 3)/ 0.1 M H 3 PO 4 buffer (ph 3)/ 0.1 M H 3 PO 4 buffer (ph 3)/ Vehicle/Formulation: PEG-400/ Povidone K-30/ PEG-400/ Povidone K-30/ PEG-400/ Povidone K-30/ Vitamin E TPGS (75:15:5:5)/ Vitamin E TPGS (75:15:5:5)/ Vitamin E TPGS (75:15:5:5)/ Solution Solution Solution Method of Administration: Oral gavage Oral gavage Oral gavage Dose (mg/kg): Specific activity: 3.3 μci/mg 0.4 μci/mg 0.4 μci/mg Analyte: Total radioactivity Total radioactivity Total radioactivity Assay: Combustion (feces only), Liquid scintillation counting Liquid scintillation counting Liquid scintillation counting Percent of Dose Recovered (Total Radioactivity) Species Time Urine Bile Feces Total Rat 0-48 h a Dog 0-72 h 8.75 ± ± ± ± 8.26 Monkey 0-72 h 4.53 ± ± ± ± 3.98 Additional Information: PEG: polyethylene glycol. TPGS: d-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate. BDC: bile duct-cannulated. Values are mean or mean ± standard deviation. Unusually high recovery was found in cage wash for Rat No. 3, so data from that rat were excluded (N = 2). The percent of dose recovered in bile as parent compound was 11.5, 12.5, and 1.4% in rat, dog, and monkey, respectively. a Includes cage wash, cage wipes, and cage rinse.

124 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 薬物動態試験 : 薬物相互作用 Table : Pharmacokinetics: Drug-Drug Interactions No nonclinical drug-drug interaction studies were conducted. However, data pertaining to in vivo studies bearing on the potential for clinical drug-drug interactions can be found in Tables , C, A to E, B, and E to Q of this Tabulated Summary.

125 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 薬物動態試験 : その他 Table A: Pharmacokinetics: Other (Absorption Using PAMPA Model) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NA/ Method: Incubation of daclatasvir in 96-well PAMPA model followed by sample analysis using a UV plate reader. The study was conducted at 100 μm concentration with 4-hour incubation at room temperature. ph A-to-B Permeability Coefficient (nm/sec) ± ± 183 Additional Information: NA: not applicable. A: apical. B: basal. PAMPA: parallel artificial membrane permeability assay. Values are mean ± standard deviation.

126 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 89 Table B: Pharmacokinetics: Other (Absorption Using Caco-2 Model) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NA/ Method: Incubation of daclatasvir (0.3 μm) either alone or with an inhibitor of transporters, ketoconazole (50 μm) or cyclosporin A (50 μm), with Caco-2 cells and measurement of permeability across the Caco-2 cell monolayers. Basolateral ph was 7.4. Samples were analyzed by HPLC/UV. No Transporter Inhibitor Apical ph A-to-B Pc (nm/sec) B-to-A Pc (nm/sec) B-to-A/A-to-B 5.5 < ± 228 > < ± 97 > < ± 101 > 24 With Transporter Inhibitors Ketoconazole Cyclosporin A Apical ph A-to-B B-to-A A-to-B B-to-A B-to-A/A-to-B Pc (nm/sec) Pc (nm/sec) Pc (nm/sec) Pc (nm/sec) B-to-A/A-to-B ± ± ± ± Additional Information: NA: not applicable. A: apical. B: basal. Pc: Permeability coefficient. Values are mean ± standard deviation.

127 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 90 Table C: Pharmacokinetics: Other (Uptake by Rat Hepatocytes) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NA/ In rat hepatocytes, the uptake of [ 3 H]daclatasvir was investigated as a function of incubation time (0.25, 1, 3, 5, and 10 minutes) and daclatasvir concentration (0.5, 1, 5, 10, 25, and 50 μm). Uptake of [ 3 H]daclatasvir (1 μm) was also assessed in the presence of metabolic inhibitors [rotenone (30 μm) and FCCP (2 μm)] and transporter inhibitors [TEA (1 mm, oct 1 inhibitor), PAH (1 mm, oat 2 inhibitor), Method: taurocholate (0.1 mm, Ntcp, roatp1, roatp2, roatp3, and roatp4 inhibitor), and BSP (0.1 mm, Ntcp, roatp1, roatp3, and roatp4 inhibitor)] after and 1-minute incubations with rat hepatocytes. After incubation at 37 C, cells were separated by centrifugation. Cells and buffer samples analyzed by liquid scintillation counting. [ 3 H]Daclatasvir Uptake (pmol/mg) Time (minutes) Figure 1. Uptake by Rat Hepatocytes as a Function of Incubation Time [ 3 H]Daclatasvir Uptake Rate (pmol/min/mg) Daclatasvir (µm) Figure 2. Uptake by Rat Hepatocytes as a Function of Daclatasvir Concentration

128 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 91 Table C: Pharmacokinetics: Other (Uptake by Rat Hepatocytes) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NA/ Metabolic Inhibitors rotenone FCCP control [ 3 H]Daclatasvir Uptake [ 3 H]Daclatasvir Uptake (% of Control) (% of Control) Figure 3. Effect of Metabolic Inhibitors on Uptake Figure 4. Effect of Transporter Inhibitors on Uptake by Rat Hepatocytes by Rat Hepatocytes Additional Information: NA: not applicable. BSP: bromosulphophthalein. FCCP: carbonyl cyanide p-trifluoromethoxy-phenylhydrazole. roatp: rat organic anion transporter polypeptide. Ntcp: sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Oct: organic cation transporter. PAH: para-aminohippurate. TEA: tetraethylammonium. Transporter Inhibitors TEA PAH TC BSP control

129 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 92 Table D: Pharmacokinetics: Other (Uptake by Cryopreserved Human Hepatocytes) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NCPK 24/ In cryopreserved human hepatocytes, the uptake of [ 3 H]daclatasvir was investigated as a function of daclatasvir concentration (0.01, 0.1, 1, 5, 10, and 25 μm) and incubation time (0.25, 1, 2, 5, and 10 minutes). Uptake of [ 3 H]daclatasvir (10 nm or 1 μm) was also assessed in Method: the presence of a metabolic inhibitor [rotenone (30 μm)] and transporter inhibitor [BSP (50 μm)] after 0.25, 1, 2, 5, and 10 minutes incubation with human hepatocytes. After incubation at 37 C, cells were separated by centrifugation. Cells and buffer samples analyzed by liquid scintillation counting. Effect of Concentration on Uptake Effect of Metabolic Inhibitor and Transporter Effect of Time on Uptake Rate of Radioactivity Rate of Radioactivity Inhibitor on Uptake Rate of Radioactivity [ 3 H]Daclatasvir Concentration (μm) [ 3 H]Daclatasvir Uptake (pmol/min/mg) Incubation Time (minutes) [ 3 H]Daclatasvir Uptake (pmol/mg) [ 3 H]Estradiol- 17β-D-glucuronide Uptake (pmol/mg) Inhibitor [ 3 H]Daclatasvir Uptake (% of control) [ 3 H]Estradiol-17β-Dglucuronide Uptake (% of control) ± ,080 ± ± 2.2 None 100 ± ± ± ,710 ± ± 3.7 Rotenone 96.5 ± ± ± ,810 ± ± 5.6 BSP 94.8 ± ± ,280 ± ,930 ± ± 13.3 NA NA NA 10 4,330 ± ,980 ± ± 6.6 NA NA NA 25 10,300 ±1380 NA NA NA NA NA NA Additional Information: NA: not applicable. BSP: bromosulphophthalein. Values are mean ± standard deviation. N = 3. Estradiol-17β-D-glucuronide (1 μm), a substrate of organic anion transporting polypeptides, used as a positive control.

130 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 93 Table E: Pharmacokinetics: Other (roatp 1, roatp 2, roatp 4, and Human OATP1B3 Substrate) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NA/ Uptake of [ 3 H]daclatasvir (1 μm) was assessed after incubations with 7 to 10 Xenopus laevis oocytes injected with roatp1, roatp2, roatp4, or hoatp8 (also known as OATP1B3) transporters. Incubations were at room temperature for 1 hour. After Method: incubation, cells were washed 3 times with ice-cold buffer, after which 10% lysis buffer (SDS) was added to each oocyte. Samples analyzed by liquid scintillation counting. The extent of uptake in the treated oocytes was compared to control oocytes. [ 3 H]BMS Uptake (pmol/oocyte) [ 3 H]Daclatasvir uptake (pmol/oocyte) Un-injected or Transporter-cRNA injected Xenopus Laevisoocytes Un-injected or Transporter-cRNA injected Xenopus Laevisoocytes Additional Information: NA: not applicable. roatp: rat organic-anion transporting polypeptide. hoatp: human organic-anion transporting polypeptide. SDS: sodium dodecyl sulfate. BMS , a known substrate of roatp1, roatp2, roatp4 and hoatp8 transporters, was used as a positive control.

131 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 94 Table E (continued): Pharmacokinetics: Other (Human OATP1B1 Substrate) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NA/ Uptake of [ 3 H]daclatasvir (1 μm) was assessed after incubation with mock and human OATP1B1-expressing HEK-293 Method: cells. Incubations were at 37 C for 1, 3, 5, and 10 minutes. After incubation, cells were rinsed with buffer, dried at room temperature, and treated with 1N NaOH for 3 hours. Cell samples were analyzed by liquid scintillation counting. Cellular protein content determined by BCA protein assay [ 3 H]BMS Uptake (pmol/mg) Mock OATP-C [ 3 H]Daclatasvir Uptake (pmol/mg) Mock OATP-C Time (minutes) Time (minutes) Additional Information: NA: not applicable. BCA: bicinchoninic acid. OATP: organic anion transporting polypeptide. BMS , a known substrate of OATP1B1 transporter, was used as a positive control. Mock: HEK-293 cells without any transporter. Note that the term used in the study report (OATP-C) has been superseded by the new nomenclature of OATP1B1.

132 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 95 Table F: Pharmacokinetics: Other (OATP1B1, OATP2B1, and OATP1B3 Substrate) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NCPK 23/ Uptake of [ 3 H]daclatasvir (10 nm) was assessed after incubations with HEK-293cells expressing OATP1B1, OATP2B1, or Method: OATP1B3 in the presence and absence of BSP (50 μm). Incubations were at 37 C for 2 minutes. After incubation, cells were washed 3 times with ice-cold buffer, air dried, and lysed with 0.1% Triton X-100. Cell samples were analyzed by liquid scintillation counting. Cellular protein content determined by BCA protein assay. Substrate Transfected Uptake of Radioactivity (pmol/mg/x minutes) a Transporter Without BSP With BSP Mock 1.06 ± ± 0.01 [ 3 OATP2B ± ± 0.04 H]Daclatasvir OATP1B ± ± 0.01 OATP1B ± ± 0.06 [ 3 H]Estradiol-β-glucuronide (1 μm) OATP1B ± ± 0.03 [ 3 H]Cholecystokinin-8 (1 μm) OATP1B ± ± 0.04 [ 3 H]Estrone-3-sulfate (1 μm) OATP2B ± ± 0.56 Additional Information: BCA: bicinchoninic acid. BSP: bromosulfophthalein. OATP: organic-anion transporting polypeptide. Mock: HEK-293 cells without any transporter. [ 3 H]Estradiol-17β-D-glucuronide, [ 3 H]cholecystokinin-8, and [ 3 H]estrone-3-sulfate, known substrates of OATP1B1, OATP1B3, and OATP2B1 transporters, respectively, were used as positive controls. a x = 2 minutes for daclatasvir and 5 minutes for positive controls.

133 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 96 Table G: Pharmacokinetics: Other (BCRP Substrate) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NA/ Bi-directional permeability of [ 3 H]daclatasvir (1 μm) across wild-type MDCK cell monolayers and BCRP-transfected MDCK cells Method: monolayers was assessed. Incubations were at 37 C for 2 hours. Samples analyzed by liquid scintillation counting. Permeability Coefficient (nm/sec) B-to-A / A-to-B BCRP-transfected Cells Efflux Ratio / Cell Type A-to-B B-to-A (Efflux) Ratio Wild-type Cells Efflux Ratio Wild-type MDCK 17.4 ± ± BCRP-transfected MDCK 12.0 ± ± Additional Information: NA: not applicable. A-to-B: apical-to-basal. B-to-A: basal-to-apical. BCRP: breast cancer resistance protein.

134 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 97 Table H: Pharmacokinetics: Other (MRP2 Substrate) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No: NCPK 22 / Membrane vesicles (50 μg) prepared from Sf9 cells expressing MRP2 were preincubated at 37 C for 5 minutes and then incubated with [ 3 H]daclatasvir (5 μm), as well as estradiol-17β-d-glucuronide (a known MRP2 substrate, 50 μm), in the presence of AMP or ATP for Method: 10 minutes. Incubations were also conducted in the presence of 100 μm MK-571 (a known inhibitor of MRP2). Following incubation, the mixture was treated with an ice-cold buffer and filtered. Filter plates were air dried and analyzed for radioactivity by liquid scintillation counting. Uptake of [ 3 H]Daclatasvir or [ 3 H]Estradiol-17β-D-glucuronide (pmol/50 μg/10 min) [ 3 H]Daclatasvir [ 3 H]Daclatasvir + MK-571 [ 3 [ 3 H]Estradiol-17β-D- H]Estradiol-17β-D-glucuronide Transfected glucuronide + MK-571 Transporter + AMP + ATP + AMP + ATP + AMP + ATP + AMP + ATP MRP ± ± ± ± ± 8.6 1,440 ± ± ± 11.7 Additional Information: AMP: adenosine mono-phosphate. ATP: adenosine tri-phosphate. MRP: multi-drug resistance protein.

135 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 98 Table I: Pharmacokinetics: Other (Transporter Inhibition in Caco-2 Cells) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No.: NA/ Method: Bi-directional permeability of [ 3 H]digoxin across Caco-2 cell membranes was assessed in absence and presence of daclatasvir (0.1 to 50 μm). Verapamil (10 μm) was the positive control. Samples analyzed by liquid scintillation counting. Compound Percent Transporter Inhibition at 10 μm IC 50 (μm) Daclatasvir Verapamil 69.7 Not determined Additional Information: NA: not applicable. For daclatasvir, a steep-dose response curve, with negligible inhibition at 1 μm and ~ 60% inhibition at 5 μm, was observed.

136 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 99 Table J: Pharmacokinetics: Other (P-gp Inhibition) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No.: NCPK 25/ Bi-directional permeability of [ 3 H]digoxin (1 μm) across MDCK cells expressing human P-gp was assessed in absence and presence of Method: daclatasvir (0.1 to 10 μm). Quinidine and ketoconazole (10 μm), known inhibitors of P-gp, were the positive controls. Samples analyzed by liquid scintillation counting. Compound Percent P-gp Inhibition at 10 μm IC 50 (μm) Daclatasvir 17.5 > 7 a Quinidine 86.0 NA Ketoconazole 62.3 NA Additional Information: NA: not applicable. P-gp: P-glycoprotein. a 18.7% inhibition at 7 μm was observed.

137 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 100 Table K: Pharmacokinetics: Other (BCRP Inhibition) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NA/ Method: Effect of daclatasvir on the bi-directional permeability of [ 3 H]genistein (1 μm), a BCRP substrate, across BCRP-transfected MDCK cell monolayers was assessed. Incubations were at 37 C for 2 hours. Samples analyzed by liquid scintillation counting [ 3 H]Genistein Permeability Coefficient (nm/sec) B-to-A / A-to-B Inhibitor A-to-B B-to-A (Efflux) Ratio Percent Inhibiton IC 50 (μm) None 193 ± ± NA Daclatasvir (0.1 μm) 180 ± ± Daclatasvir (1 μm) 179 ± ± Daclatasvir (5 μm) 183 ± ± ± 8.6 Daclatasvir (20 μm) 255 ± ± Daclatasvir (50 μm) 218 ± ± FTC (10 μm) 207 ± ± NA Cyclosporin A (10 μm) 145 ± ± NA Additional Information: NA: not applicable. BCRP: breast cancer resistance protein. FTC and cyclosporin A are known BCRP inhibitors.

138 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 101 Table L: Pharmacokinetics: Other (MRP2 Inhibition) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NA/ Effect of daclatasvir on the ATP-dependent uptake of [ 3 H]estradiol-17β-D-glucuronide (1 μm), an MRP2 substrate, by Method: MRP2-expressing membrane vesicles was assessed. Incubations were at 37 C for 10 minutes. Samples analyzed by liquid scintillation counting. [ 3 H]Estradiol-17β-D-glucuronide Uptake Inhibitor (Percent of Control) IC 50 (μm) None 100 ± 5.2 Daclatasvir (0.1 μm) 104 ± 8.6 Daclatasvir (0.4 μm) 94.3 ± 6.3 Daclatasvir (1.2 μm) 95.6 ± ± 7.7 Daclatasvir (3.7 μm) 75.1 ± 11.1 Daclatasvir (11.1 μm) 72.9 ± 7.8 Daclatasvir (33.3 μm) 51.8 ± 2.2 [ 3 H]Estradiol-17β-D-glucuronide Uptake (pmol/50 μg/10 min) MK-571 (0 μm) 681 ± 60.3 MK-571 (10 μm) 560 ± 32.9 MK-571 (50 μm) 144 ± 4.4 MK-571 (100 μm) 78.4 ± 7.1 Additional Information: NA: not applicable. ATP: adenosine triphosphate. MRP: multidrug resistance protein. MK-571 is a known MRP2 inhibitor. Values are mean ± standard deviation (N = 3).

139 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 102 Table M: Pharmacokinetics: Other (OATP2B1 Inhibition) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NCPK 21/ Effect of daclatasvir on the uptake of [ 3 H]estrone-3-sulfate (1 μm), an OATP2B1 substrate, by OATP2B1-expressing Method: HEK-293 cells was assessed. Incubations were conducted at 37 C for 1 minute. Samples analyzed by liquid scintillation counting [ 3 H]Estrone-3-sulfate Uptake Inhibitor (Percent of Control) OATP2B1 IC 50 (μm) None 100 ± 7.1 Daclatasvir (0.1 μm) 104 ± 12 Daclatasvir (0.31 μm) 101 ± 9.4 Daclatasvir (0.93 μm) 96.2 ± 15 Daclatasvir (2.78 μm) 101 ± ± 4.0 Daclatasvir (8.33 μm) 79.2 ± 15 Daclatasvir (25 μm) 63.7 ± 2.4 Daclatasvir (50 μm) 47.2 ± 1.3 [ 3 H] Estrone-3-sulfate Uptake (Percent of Control) OATP2B1 IC 50 (μm) None 100 ± 16.8 Rifampin (0.1 μm) 104 ± 13.6 Rifampin (0.31 μm) 113 ± 6.4 Rifampin (0.93 μm) 102 ± 10.3 Rifampin (2.78 μm) 90.7 ± ± 6.0 Rifampin (8.33 μm) 85.5 ± 10.3 Rifampin 25 μm) 55.0 ± 4.9 Rifampin (50 μm) 50.3 ± 7.3 Additional Information: OATP: organic anion transporting polypeptide. Rifampin is a known OATP2B1 inhibitor. Values are mean ± standard deviation (N = 3).

140 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 103 Table N: Pharmacokinetics: Other (OATP1B1 Inhibition) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NA/ Effect of daclatasvir (0.1 to 50 μm) on the uptake of [ 3 H]BMS (0.1 μm), an OATP1B1 substrate, by Method: OATP1B1-expressing HEK-293 cells was assessed. Incubations were at 37 C for 5 minutes. After incubation, cells were rinsed with buffer, dried at room temperature, and treated with 1N NaOH for 3 hours. Cell samples were analyzed by liquid scintillation counting. Cellular protein content determined by BCA protein assay. 120 BMS uptake (% of control) Daclatasvir (µm) Additional Information: NA: not applicable. BCA: bicinchoninic acid. OATP: organic anion transporting polypeptide. Daclatasvir inhibited OATP1B1 with an IC 50 of 2.3 μm.

141 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 104 Table O: Pharmacokinetics: Other (OATP1B3 Inhibition) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NA/ Method: Effect of daclatasvir on the uptake of [ 3 H]CCK-8 (1 μm), a known OATP1B3 substrate, by OATP1B3-expressing HEK-293 cells was assessed. Incubations were at 37 C for 5 minutes. Samples were analyzed by liquid scintillation counting. Inhibitor [ 3 H]CCK-8 Uptake (Percent of Control) OATP1B3 IC 50 (μm) None 100 ± 11.8 Daclatasvir (0.01 μm) 79.7 ± 11.0 Daclatasvir (0.1 μm) 102 ± 8.8 Daclatasvir (0.5 μm) 105 ± 8.3 Daclatasvir (1 μm) 69.7 ± ± 1.3 Daclatasvir (5 μm) 53.5 ± 6.8 Daclatasvir (10 μm) 36.3 ± 7.9 Daclatasvir (25 μm) 15.6 ± 1.2 [ 3 H]CCK-8 Uptake (pmol/mg/5 min) None 37.6 ± 4.45 Rifampin (5 μm) 2.17 ± 0.77 Additional Information: NA: not applicable. OATP: organic anion transporting polypeptide. CCK-8: cholecystokinin-8. Rifampin is a known OATP1B3 inhibitor. Values are mean ± standard deviation (N = 3).

142 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 105 Table P: Pharmacokinetics: Other (Human OAT1, OAT3, OCT1, and OCT2 Inhibition) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./ Document Control No.: NCPK 19/ Effect of daclatasvir (0 to 8 μm) on the uptake of [ 3 H]p-aminohippuric acid (1 μm, an OAT1 substrate), [ 3 H]estrone-3-sulfate (1 μm, an OAT3 substrate), and [ 14 C]metformin (1 μm, a substrate of OCT1 and OCT2) by human OAT1-, human OAT3-, human OCT1-, or Method: human OCT2-expressing HEK-293 cells, was assessed. Incubations were conducted at 37 C for 1.5 minutes. After incubation, cells were washed 3 times with ice-cold buffer, air dried, and lysed with 0.1% Triton X-100. Cell samples were analyzed by liquid scintillation counting. Cellular protein content determined by BCA protein assay. Inhibitor Expressed Transporter IC 50 (μm) OAT1 > 8 a Daclatasvir OAT3 > 8 b OCT1 1.4 OCT2 7.3 Probenecid OAT OAT3 6.1 Pyrimethamine OCT1 2.7 OCT2 2.8 Additional Information: BCA: bicinchoninic acid. OAT: organic anion transporter. OCT: organic cation transporter. Probenecid (OAT1: 0.14 to 100 μm, OAT3: 0.41 to 100 μm) and pyrimethamine (0.41 to 100 μm) which are known inhibitors of OAT and OCT, respectively, were used as positive controls. a Maximum inhibition of 27.9% at the highest tested concentration (8 μm) was observed. b Maximum inhibition of 25.8% at the highest tested concentration (8 μm) was observed.

143 ダクラタスビル塩酸塩 薬物動態試験概要表 Page 106 Table Q: Pharmacokinetics: Other (BSEP and NTCP Inhibition) Test Article: Daclatasvir Location in Dossier: CTD Study No./Document Control No.: NCPK 29/ Effect of daclatasvir on the ATP-dependent uptake of [ 3 H]taurocholate (2 μm), a BSEP and NTCP substrate, by human Method: BSEP-expressing SF-9 cells and NTCP expressing CHO cells was assessed. Incubations were conducted at 37 C for 5 (BSEP) and 10 (NTCP) minutes. Samples were analyzed by liquid scintillation counting. [ 3 H]Taurocholate Uptake (Percent of Control) IC 50 (μm) Inhibitor BSEP Expressed NTCP Expressed BSEP NTCP None 100 ± ± 2.87 Daclatasvir (0.1 μm) 98.5 ± ± 7.27 Daclatasvir (0.3 μm) 103 ± ± 11.1 Daclatasvir (0.9 μm) 98.4 ± ± ND Daclatasvir (2.7 μm) 78.3 ± ± 2.89 Daclatasvir (5.4 μm) 59.5 ± ± 9.27 Daclatasvir (8.1 μm) 41.8 ± ± 5.88 Daclatasvir (16 μm) 21.1 ± ± 8.34 Cyclosporin A(20 μm) 4.32 ± 1.46 NA NA NA TCDC(100 μm) NA 3.03 ± 4.00 NA NA Additional Information: NA: not applicable. ATP: adenosine triphosphate. BSEP: bile salt export pump. NTCP: Na + -taurocholate-cotransporting polypeptide. TCDC: taurochenodeoxycholate. Cyclosporin A and TCDC are known inhibitors of BSEP and NTCP, respectively. Values are mean ± standard deviation (N = 3).