1 γ- グルタミルトランスペプチダーゼ (GGT) の新規阻害剤 京都大学化学研究所生体機能化学研究系生体触媒化学研究領域 助教渡辺文太
2 γ- グルタミルトランスペプチダーゼ (GGT) とは グルタチオン ( -Glu-Cys-Gly) およびその抱合 体の γ- グルタミル結合を加水分解する酵素 -Glu-Cys-Gly + H 2 Glu + Cys-Gly ( 加水分解 ) -Glu-Cys-Gly + X -Glu-X + Cys-Gly ( ペプチド転移 ) X = アミノ酸 ペプチド アミン類 ほ乳類や植物 微生物までほとんどあらゆる生物に 普遍的に存在
3 グルタチオン (GSH) とは GGT H N N H SH グルタミン酸 システイン グリシン イソペプチドの一種 重金属やアルキル化剤 活性酸素種など生体異物の解毒 生体内の酸化還元バランスの調節
4 グルタチオン代謝酵素としての GGT Glu Cys Gly (GSH) Glu + GSH GGT GST X Glu Cys Gly γ GCS Glu Cys Cys GS Cys + Gly Gly GS X GSH/GSSG/G S X MR GR GSH GSSG GX GSH/GSSG/GS X
5 GGT の生理的意義 グルタチオンを加水分解し 細胞のグルタチ オン生合成に必要なシステインを供給する グルタチオン抱合体を代謝し 生体異物を解 毒する グルタチオン代謝により 生体の酸化還元バ ランスを調節する
6 GGT の pro-oxidant 効果 グルタチオン ( -Glu-Cys-Gly) の分解産物であるCys-Glyは極めて活性なチオールであり 生理的条件下で金属イオンを介して容易に酸素を還元し 活性酸素種を作り出す GGT 活性の増大はかえって酸化ストレスを亢 進させることにつながる BioFactors, 17, 187 (2003).
7 GGT と疾病 (1) 過度のアルコール摂取や薬物により 肝臓での GGT 発現および血中への漏出が顕著に起こる 肝疾患やアルコール依存症のマーカー酵素 (γ-gt) Crit. Rev. Clin Lab. Sci., 38, 263 (2001). 心筋梗塞や狭心症などの心血管疾患 2 型糖尿 病において 血中 GGT 活性の上昇は危険因子で ある Circulation, 112, 2130 (2005). Atherosclerosis, 194, 498 (2006). Eur. Heart J., 27, 2170 (2006). J. Intern. Med., 258, 527 (2005).
GGT と疾病 (2) ピロリ菌のGGTは 病害性因子として胃壁細胞のアポトーシスを誘導する Mol. Mocrobiol., 47, 443 (2003). GGTは骨再吸収因子として関節炎や骨粗鬆症に関与する Endocrinology., 148, 2708 (2007). ガン細胞では GGT を高発現するものが多く 抗が ん剤や放射線療法に対する耐性獲得や転移活性 との関係が示唆される roc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3070 (1992). Carcinogenesis, 20, 553 (1999). Biochem. harmacol., 71, 231 (2006). 8
9 本研究の目的 GGT の生理的役割を明確にするため 選択的 GGT 阻害剤を開発する 各種疾病と GGT 活性との具体的 グルタチオン代謝を通した 生体防御 な関係は? 酸化ストレスの亢進
10 従来の GGT 阻害剤 N Cl アシビシン (AT-125) Streptomyces sviceus の産生する抗生物質 グルタミン代謝拮抗剤として グルタミンアミドトランスフェラーゼ (GAT) 類に広く作用する 多くのグルタミン依存性酵素を阻害し 強い細胞毒性や中枢神経毒性を示す
11 アシビシンの問題点 低い GGT 選択性とそれに起因する毒性 GGT 阻害による影響を正確に評価できない GGT 選択性を向上させるための分子設計 GGT の触媒機構に着目
12 阻害剤の分子設計 GGT の触媒機構 NHR H-GGT - TS1 - NHR GGT H 2 NR GGT H 2 - TS2 - GGT NHR H + H-GGT 遷移状態アナログ阻害剤 Me X H-GGT Me GGT + H X
阻害剤の合成 Br Et C C 2 Et 2 Et Et 2 C + Et 2 C Et AcHN Et AcHN Na + (E t) 2 C, toluene rfx Et 1) 6N HCl, rfx 2) propylene oxide (97%) H H 1) Cbz-C l, NaH 2) B nh, S Cl 2 (64%) CbzHN C 2 Bn H H (CCl) 2, DMF CH 2 Cl 2 CbzHN C 2 Bn Cl Cl MeH Et 3 N, -65ºC CbzHN C 2 Bn Cl Me + H X Et 3 N 0ºC (31~54%) CbzHN C 2 Bn Me X H 2, d/c or AlCl 3 (48~70%) Me X
阻害活性の測定 H N γ-glu-amc Me GGT H + Me 7- アミノ -4- メチルクマリン (AMC) 100 mm コハク酸 -Na (ph 5.5) 4.0 or 0.2 M -Glu-AMC 阻害剤 ヒト GGT or 大腸菌 GGT AMC nm 30 25 20 15 10 [I] = 0 M 10 20 30 40 60 蛍光測定 5 励起波長 :350 nm 蛍光波長 :440 nm 0 0 100 200 300 400 500 600 Time sec GGT の時間依存的失活 14
15 阻害活性の評価 酵素と阻害剤との 2 次反応速度定数 k on を阻害活 性の指標とする E + S E S E + 30 25 [I] = 0 M 10 V inact = k on [E] [I] E-I AMC nm 20 15 10 20 30 40 60 k on が大きいほど酵素が速やかに失活する強い阻害剤である 5 0 0 100 200 300 400 500 600 Time sec GGT の時間依存的失活
16 ヒトおよび大腸菌 GGT に対する阻害活性 Me X H-GGT Me GGT + H 脱離基 X No. 1 2 3 X pk a k on [M -1 s -1 ] k on [M -1 s -1 ] No. X pk a ヒト大腸菌ヒト大腸菌 4-Me 10.40 0.16 19 8 4-8.70 5.2 3200 4-Me 10.21 0.24 24 9 4-CF 3 8.51 12 2900 H 9.98 0.40 120 10 3-N 2 8.36 49 5100 4 4-CH 2 9.84 0.33 210 11 4-CN 7.95 46 12000 5 3-CH 2 9.71 51 150 12 4-N 2 7.15 130 35000 6 7 4-Cl 9.41 5.0 610 3-9.14 1.6 450 N ( アシビシン ) Cl -6.18 (HCl) 0.40 4200
17 ブレンステッドプロット ヒト GGT 大腸菌 GGT Me pk on 化合物 5 pk on pk a pk a
18 活性中心についての考察 ヒト GGT 大腸菌 GGT H 3 N + C 2 H N δ - δ - Thr N H SH C 2 H X + H 3 N + C 2 H N δ - δ - Thr N H SH C 2 H 3 N + C 2 H Me Thr C 2 H X + H 3 N + C 2 H Me Thr X ヒト GGT はグルタチオン C 末端の負電荷を厳密に認識している
19 水溶液中での安定性 No. 構造 k on ( ヒト GGT) D 2 ( 室温 /12 時間 ) 備考 5 51 分解せず D 2 中室温で 1 ヶ月後も安定 Me 11 Me CN 46 12% 分解 12 Me N 2 130 49% 分解 NaHC 3 :100% 分解 CD 3 C 2 D 中 :40% 分解 CF 3 C 2 D または DCl: 24 時間後も安定 ( いずれも 1M)
20 化合物 5 の特徴 GGT 選択性 GAT( アスパラギン合成酵素のグルタミナーゼドメイン ) を全く阻害しない (10 mm 2 時間 ) 安全性 アシビシンは 0.1 mm の濃度で GAT を 90% 以上失活させる 雌雄マウスに対して急性毒性を示さない (100 mg/kg 単回静脈内投与 2 週間観察 ) エイムス試験において変異原性を示さない
21 まとめ Me GGT の新規阻害剤を開発した 阻害活性 ( ヒト GGT) 選択性 安全性の面で 既存の GGT 阻害剤であるアシビシンより優れる
22 想定される業界 試薬メーカー 用途 : グルタチオン代謝に関する基礎研究全般に有用な生化学用試薬
23 本技術に関する知的財産権 発明の名称 : ホスホン酸ジエステル誘導体 およびその製造方法 出願番号 : 特願 2007-549163 出願人 発明者 : 国立大学法人京都大学 : 平竹潤 坂田完三 韓立友
24 お問い合わせ先 関西 TL 株式会社 アソシエイト大西晋嗣 TEL 075-753-9150 FAX 075-753-9169 e-mail ohnishi@kansai-tlo.co.jp