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プロテオームプロファイリング ( タンパク質組成分析 ) は組織 血液などのペプチドやタンパク質の検出を目指す技術です 液体クロマトグラフィー タンデム質量分析法に基づき タンパク質の混合物を質量分析法で同定し データ解析が行われます トランスクリプトーム解析とともに 生体システムにおけるダイナミックな変化を網羅的に解析できます 高解像度と高精度 : 解像度は 10 5 超 精度は 1ppm 未満 高同定率 :3,000 種類以上のタンパク質を同定可能 無制限 : 理論的にはどんな生物種も解析可能 タンパク質抽出 SDS-PAGE 酵素カット - 54 - 酵素カット LC-MS/MS MS と MS/MS スペクトルピークのリストデータベースでの捜索品質管理とデータのフィルタリング信頼できるタンパク質の同定データの統計と品質管理タンパク質の同定タンパク質の機能アノテーション タンパク質の GO 解析 タンパク質の COG 解析 タンパク質の pathway 解析 HPLC
データの統計と品質管理 タンパク質同定の結果 タンパク質の GO 解析 タンパク質の COG 解析 タンパク質の代謝経路解析 1. サンプル サンプル量 タンパク質 500µg ( 濃度 1mg/mL) 2. :SDS-PAGE-LC-MS/MS SCX-HPLC -LC-MS/MS 3. :Triple TOF TM 5600 LTQ OrbitrapVelos TM 納品データ例 Query number # of query Charge Pdeptide mass Ions score 1 Homology score Identity score Evalue 55 3-0 48.14 28 38 0.006 Peptide sequence KTVTAM- DVVYALK Protein ID Modification Retention time IPI00453473 2089 2-0 46.5 0 40 0.013 MLTELEK IPI00007047 10000 20000 30000 40000 50000 60000 0 65.6876% 2 約 40 営業日 28.0031% 1 5.3306% 0.8816% 0.0886% 0.0084% 3 4 5 6 7 Charge # of fragmentions 7e+05 6e+05 5e+05 4e+05 3e+05 2e+05 1e+05 0e+00 Fragment lons Mass delta/da Oxidation (M)@6 Oxidation (M)@1 25.38 13.4-55 - significant not significant -0.5368-0.4737-0.4105-0.3474-0.2842-0.2211-0.1579-0.0947-0.0316 0.0316 0.0947 0.1579 0.2211 0.2842 0.3474 0.4105 0.4737 0.5368 0.6000 2
定量プロテオミクスは プロテオームを構成するすべてのタンパク質を精確に同定した上で タンパク質の差異発現をスクリーニングすることができ 細胞生理や細胞病理の機能解明に利用されています 研究方法は安定同位体標識法 (itraq SILAC ICAT 他 ) と非標識定量法 (label-free) があります 柔軟性 :label-free と itraq の二つの定量法を柔軟に選択可能 高解像度と高精度 :LTQ Orbitrap Velos TM プラットフォームでは 解像度は 10 5 超 精度は 1ppm 未満 ハイスループット :itraq では 8 サンプルを 1 ランで label-free では大規模サンプルを同時に解析可能 タンパク質抽出 酵素カット itraq 標識 標識なし - 56 - HPLC 分離 LC-MS/MS MS と MS/MS スペクトルデータベースでの捜索品質管理とデータのフィルタリングタンパク質の定量タンパク質の機能アノテーション Differentially expressed proteins GO 解析 (DEPs) のスクリーニング COG 解析 DEPs のクラスター分析 Pathway 解析 DEPs の GO 解析 DEPs の pathway enrichment 解析
1. データ統計 タンパク質同定の結果 タンパク質定量の結果 タンパク質の GO 解析 タンパク質の COG 解析 タンパク質の代謝経路解析 異なるタンパク質の GO 解析 異なるタンパク質の代謝経路解析 マルチサンプルの発現パターンのクラスター分析 2. itraq プロテオミクスとトランスクリプトームデータの比 較分析 プロテオミクスとトランスクリプトーム解析結果 の比較分析 異なるタンパク質と遺伝子の比較分析 プロテオミクスとトランスクリプトームのクラス ター分析 タンパク質相互作用ネットワークの解析 お客様のご要望に合わせ データ解析をカスタマイ ズします 1. サンプル サンプル量 タンパク質 500µg ( 濃度 1mg/mL) 2. :itraq Label-free 3. :Triple TOF TM 5600 LTQ OrbitrapVelos TM 納品データ例 0% 2% 3% 70%-100%(0) 7% 60%-70%(0) 7% 50%-60%(2) 40%-50%(9) 45% 30%-40%19) 11% 20%-30%(41) 15%-20%(39) 10%-15%(63) 5%-10%(134) 24% 0%-5%(252) 1 itraq: 約 40 営業日 Label-free: 約 60 営業日 Number of peptides 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 Peptide Ratios(117/119)Distribution -2-1 -0 1 Peptide ratios 2-57 -
ターゲットプロテオミクスでは 多重反応モニタリング (MRM:Multiple Reaction Monitoring) 技術に基づき 特別な機能を持つタンパク質を相対定量と絶対定量の二つの方法で解析できます ターゲットプロテオミクスは特異性が高く高感度な質量分析法として 低濃度タンパク質の同定 翻訳後修飾されたタンパク質の同定 バイオマーカーの検証 ファミリータンパク質とオルソロガスタンパク質の差異検出などの研究で利用されています 高解像度 : オルソロガスタンパク質の高感度検出が可能 ハイスループット : 数十個のタンパク質を同時に定量可能 高再現性 :MRM 技術に基づくターゲットプロテオミクスの結果は 異なる実験室で再現可能 短周期 : 抗体作成からの解析では半年必要だったものが ターゲットプロテオミクスでは 10 週で解析可能 広検出範囲 : 検出範囲は 1,000 ~ 10 万 MRM 技術開発 サンプル解析 タンパク質 - 58 - ターゲットタンパク質の情報 MRM トランジションのデザイン MRM トランジションの最適化 1. ターゲットタンパク質の選定 トランジションの予測 ターゲットタンパク質の同定 ターゲットタンパク質の定量 2. お客様のご要望に合わせ データ解析をカスタマイズします トリプシン消化 LC-MRM 生データ ターゲットタンパク質の同定 ターゲットタンパク質の定量
1. サンプル サンプル量 タンパク質 500µg ( 濃度 1mg/mL) 2. :MRM 3. :QTRAP 5500 納品データ例 4000 y11-1172.5906+ y7-758.4155+ Predicted 24.1 3000 Intensity 2000 1000 約 60 営業日 Measured Time 24.6 24.4 24.2 24.0 23.8 23.6 23.4 23.2 0 23.0 y11-1172.5906+ y5-558.2994+ 23.5 24.0 24.5 25.0 Retention Time 1 sample1 y7-758.4155+ y4-457.2518+ Replicate y6-657.3678 sample2 2-59 -
リン酸化プロテオーム解析では タンパク質のリン酸化修飾情報を網羅的に解析できます リン酸化部位の識別と機能分析はもちろんのこと itraq や Label-free などの相対定量法を併用して リン酸化されたタンパク質の解析もできます この技術はリン酸化部位の同定率を高めるだけでなく 細胞内シグナル伝達ネットワーク中のリン酸化タンパク質も迅速に解析できます リン酸化プロテオーム解析は既にシグナル伝達ネットワークの研究 疾患研究 環境応答などの研究領域で利用されています 高解像度 : リン酸化されたアミノ酸部位を精確に同定可能 高効率 :1 ランで何千ヶ所ものリン酸化部位を同定可能 ハイスループット :itraq では 8 サンプルのリン酸化タンパク質を同時に同定可能 複数の断片化モデル :Collision-induced dissociation (CID) electron-transfer dissociation (ETD) Higher-energy C-trap dissociation (HCD) などのフラグメンテーションモデルを提供 複数のスキャンモデル :MS2 や MS3 などのスキャンモデルを提供 タンパク質抽出 - 60 - 酵素カットリン酸化タンパク質の濃縮 LC-ESI-MS/MS ピークのリストデータベースでの捜索品質管理とデータのフィルタリング信頼できるタンパク質の同定タンパク質の機能アノテーションリン酸化タンパク質の Enrichment 解析 タンパク質 GO 解析 GO Enrichment 解析 タンパク質 COG 解析 Pathway Enrichment 解析 タンパク質 Pathway 解析
1. データベースの検索 データベース検索結果の統計解析 データベース検索結果の品質管理 リン酸化タンパク質の検出と同定 タンパク質の GO COG 代謝経路解析 リン酸化タンパク質の GO Pathway Enrichment 解析 2. お客様のご要望に合わせ タンパク質相互作用ネッ トワークの解析等 データ解析をカスタマイズしま す 1. サンプル サンプル量 タンパク質 5mg ( 濃度 1mg/mL) 2. :TiO 2 Enrichment LC-ESI-MS/MS 3. :LTQ Orbitrap Velos TM Triple TOF TM 5600 Number of proteins 0 20 40 60 80 100 120 0 5 10 15 20 25 30 35 The number of peptides 1 Mascot Ion Score 約 60 営業日 120 100 80 60 40 20-10 -5 0 5 10 Mass delta (ppm) 2 Number of Peptides 140 120 100 80 60 40 20 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 Peptide Length 3-61 -
タンパク質同定とは MALDI-TOF/TOF または LC-MS/MS 質量分析法を用いて 電気泳動したゲルから切り出したタンパク質スポットやバンドを 免疫沈降 (IP:immunoprecipitation) や精製してから同定を行う技術です データ解析はタンパク質同定の結果とデータ解析の結果 (GO と pathway 解析 ) を含みます 高解像度と高精度 :LTQ Orbitrap Velos TM プラットフォームでは 解像度は 10 5 超 精度は 1ppm 未満 高速スキャニング :Ultrafle Xtreme プラットフォーム (TOF と TOF/TOF モード ) のスピードは 1KHz 以上 高感度 : 低濃度のタンパク質に対して優れた検出効果があり ナノグラムレベルでも検出可能 タンパク質抽出 酵素カット MALDI-TOF/TOF LC-MS/MS - 62 - MS/MS ピークのリスト データベースでの捜索 信頼できるタンパク質の同定 タンパク質同定の結果 タンパク質の GO 解析 タンパク質の COG 解析 タンパク質の Pathway 解析 データの統計と品質管理 タンパク質同定の結果 タンパク質の GO 解析 (LC-MS/MS 解析のみ ) タンパク質の COG 解析 (LC-MS/MS 解析のみ ) タンパク質の Pathway 代謝経路解析 (LC-MS/MS 解析のみ )
1. SDS-PAGE スライス 2D-PAGE ゲルスポット : 1.5mm 3 クマシーブルー染色や銀染色によってゲルを可視化させ 電気泳動後 一週間以内に弊社まで送付してください 銀染色の場合 グルタルアルデヒドを混入しないように注意してください 2. :LC-MS/MS MALDI-TOF/TOF 3. MALDI TOF/TOF TM LTQ Orbitrap Velos TM Triple TOF TM 5600 納品データ例 IDs 90.00% Protein ID:gi/533066 Sequence Coverage:28.82% Matched peptides shown in Bold Red: 2 VGFKAGVKDY KLTYYTPDYE TKDTDILAAF RVTPQPGVPP EEAGAAVAAE SSTGTWTTVW TDGLTSLDRY KGRCYHIEPV AGEESQFIAY VAYPLDLFEE GSVTNMFTSI VGNVFGFKAL RALRLEDLRI PPAYVKTFQG PPHGIQVERD KLNKYGRPLL GCTIKPKLGL SAKNYGRAVY ECLRGGLDFT KDDENVNSQP FMRWRDRFLF CAEAIYKAQA ETGEIKGHYL NATAGTNEDM MKRAVFAREL ゲルスポット : 約 15 営業日 ゲルバンド : 約 20 営業日 1 None IDs 10.00% Intensity 4000 6000 8000 10000 0 2000 809.3366 839.0858 855.0509 871.0310 861.0671 877.0424 917.2810 921.3223 985.5725 1005.6100 1025.6100 1050.0928 1060.0809 1063.0629 1250.0928 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 M/Z 2 PMF 1464.0609-63 - 1963.0629