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さみかくはり
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以下の名称は東ソー株式会社の商標です HLC,, SuperMultipore, STAT BioAssist, Enantio, PStQuick, エンバイロパック /Enviropak, トヨパール /, ToyoScreen, GigaCap, トヨパールメガキャップ / MegaCap, トヨパールパック /PAK, TOYOPAK, FFLC, マイショリディスク外観

1 以下の名称は東ソー株式会社の商標です HLC,, SuperMultipore, STAT BioAssist, Enantio, PStQuick, エンバイロパック /Enviropak, トヨパール /, ToyoScreen, GigaCap, トヨパールメガキャップ / MegaCap, トヨパールパック /PAK, TOYOPAK, FFLC, マイショリディスク外観仕様は予告なく変更することがあります掲載写真と説明文構成ユニットは異なる場合があります製品の多くは毒性安全性について査されていません特に警告注意がなくても無害無毒であると保証されている訳ではありません当社製品を使用して得られた分離精製物または精製溶液を製品及び中間体として使用する場合は十分にその安全性の確認を行ってご使用ください記載されたデータは当社が取得した参考データで保証するデータではありませんお客様の使用環境条件判断基準に合わせてご確認もしくはデータの取得をお願い致します掲載の価格は 2017 年 8 月 1 日現在の価格です表示価格には消費税が含まれておりません別途申し受けます納期が記載されていない商品の納期は原則として受注後 1 週間以内です抗体医薬品のクロマトグラフィーによる分離精製及び品質管理シリーズバイオサイエンス事業部東京本社営業部 1(0) FAX(0) 東京都港区芝 -8-2 大阪支店バイオサイエンス G 1(06) FAX(06) 大阪市中央区高麗橋名古屋支店バイオサイエンス G 1(052) FAX(052) 名古屋市中区栄福岡支店 1(092) FAX(092) 福岡市中央区天神仙台支店 1(022) FAX(022) 仙台市青葉区本町山口営業所 1(084) FAX(084) 山口県周南市清水カスタマーサポートセンター 1(0467) FAX(0467) 神奈川県綾瀬市早川海外でのお求めについては海外でもご購入できます海外でのお問い合せは下記までお願いいたします Tosoh Bioscience LLC Address:604 Horizon Drive Suite 100, King of Prussia, PA 19406, USA Telephone: Fax: Tosoh Bioscience GmbH Address:Im Leuschnerpark 4, 6447 Griesheim, Germany Telephone: Fax: Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd. Address:Room 1001, Innov Tower, Block A, 1801 Hong Mei Road, Xu Hui District, Shanghai 2002, China Telephone: Fax: Tosoh Asia Pte., Ltd. Address:6 Market Street #10-0 Singapore Telephone: Fax: バイオサイエンス事業部ホームページ HPLC Applications Database お問い合せ製品全般カタログに関するお問い合せ hlc@tosoh.co.jp カラム分離に関するお問い合せ tskgel@tosoh.co.jp 装置の技術相談に関するお問い合せ csc@tosoh.co.jp 708GX- 品番 C

2 抗体のプロセスクロマトグラフィーモノクローナル抗体はバイオ医薬品や診断査試薬として需要が高く大量精製高純度精製が必須となっていますそのためダウンストリームでのクロマトグラフィーによる精製がますます重要になっています表 1 に抗体精製に使われる各種クロマトグラフィー分離モードの特徴を示しますプロテイン A アフィニティークロマトグラフィーは抗体の精製純度が非常に高く初期精製に最もよく使用されていますイオン交換クロマトグラフィー (IEC) は高吸着タイプが普及してきました疎水クロマトグラフィー (HIC) は抗体の凝集体や漏出プロテイン A などの不純物除去に優れていますミックスモードクロマトグラフィー (MXC) は高い塩濃度の溶離液で吸着が可能です図 1 は抗体精製プラットフォームの一例ですプロテイン A ステップと陽イオン交換クロマトグラフィー陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせることにより不純物 ( ホストセルたんぱく質 ;HCP 核酸抗体凝集体漏出プロテイン A リガンド ) を除去し純度の高い抗体を回収できます表 1.各種クロマトグラフィー分離モードの特徴抗体吸着量抗体精製純度充塡剤の洗浄充塡剤のコストアフィニティーイオン交換疎水ミックスモード ; 特に優れている ++; 優れている +; 改善が望まれる * 陰イオン交換体はフロースルーモードで不純物を吸着除去するキャプチャー ( プロテイン A) ィス化中間精製 ( イオン交換 ) 精製 ( イオン交換 ) 図 1.抗体精製プラットフォーム例表 2. 主な抗体精製用のトヨパール製品 TPEARL AF-rProtein A HC-650F 中性で吸着性で性 TPEARL GigaCap S-650M 性離液グラジントで TPEARL NH2-750F 中性 ( ) 離液分離モード主な製品名抗体吸着量主な特徴 AFC IEC AF-rProtein A HC-650F 68 g/l 高吸着耐アルカリ AF-rProtein L-650F 64 g/l フラグメント抗体への適用 GigaCap S-650M g/l 高吸着型 Sulfate-650F 114 g/l 塩耐性凝集体分離に優れる GigaCap Q-650M 162 g/l ( * 1) フロースルーモード高吸着型 NH2-750F 70 g/l フロースルーモード塩耐性凝集体分離に優れる MXC Mx-Tp-650M 75 g/l ミックスモード塩耐性凝集体分離に優れる HIC ( * 1) B S A ( 2) リゾチーム * Phenyl-600M g/l ( * 2) 高吸着高回収率 PPG-600M 20-5 g/l 疎水性の高い抗体 ADC への適用 Hexyl-650C 0-50 g/l ( * 2) 低塩濃度フロースルーモードプロテイン A プロテイン L 担体初期精製工程では大量の培養上清を迅速に精製することが要求されるため高吸着量で高速処理が可能なプロテイン A 担体が広く使用されています AF-rProtein A HC-650Fは新規のアルカリ耐久性のある遺伝子組み換えプロテイン Aを抗体精製に最適化したベース基材に多点結合で固定化した担体で高い吸着量を有しています ( 図 2) 高濃度(10 g/l) の抗体試料液でも汎用流速で非常に高い吸着量を示します ( 図 ) またリガンドの漏出も少なく ( 図 4) HCPの除去効率にも優れています ( 図 5) さらにアルカリ洗浄による繰り返し CIP でも吸着量の低下が少ない優れたプロテイン A 担体です一方プロテイン L 担体は抗体 κ 軽鎖に親和性を有していますプロテイン A 担体では適用できない Fab scfv 等 Fc 領域を有さないフラグメント抗体のアフィニティー精製が可能となります AF-rProtein L-650Fは従来のプロテイン Lの弱点であった吸着量アルカリ耐久性を大きく改善したもので実用的な生産プロセスレベルへの適用が可能です ( 図 6 7) またフラグメント抗体に限らず IgM IgAといった抗体クラスへの親和性もありプロテイン Aを補完する特性を有していますイオン交換担体プロテイン Aに続く中間精製最終精製工程にはイオン交換モードが広く使用されておりその吸着量は官能基の導入技術の進歩により g/lの高吸着タイプが主流になっています抗体の等電点は一般に中性から弱塩基性であるため抗体は陽イオン交換体で吸着分離されます GigaCap S-650M は担体表面にカチオン性グラフトポリマーを導入しており高い抗体吸着量を示しますさらに溶出時のピークもシャープであることから試料を高濃度で溶出させることが可能です ( 図 8) Sulfate-650F は高い塩濃度を含有 (0.15 mol/l 程度の NaCl) する試料でもたんぱく質を吸着できる塩耐性を有するため前工程の溶出液を脱塩等の処理なしで負荷することもできます陰イオン交換体は抗体をフロースルーモードで溶出させホストセルたんぱく質核酸エンドトキシン抗体凝集体などを吸着除去します NH2-750F はユニークな分離特性を有し優れた凝集体除去性能を示します ( 図 9) また Sulfate-650F と同様に塩耐性の特性も有していますミックスモード担体充塡剤官能基がイオン性及び疎水性の両方の性質を有する担体ですミックスモード担体は試料中の塩濃度が高い場合 (0.15 mol/l NaCl 程度 ) でも抗体を十分吸着します MX-Trp-650M は官能基としてトリプトファンを有し抗体に対して高い吸着量 (70 g/l 以上 ) を示します疎水クロマトグラフィー担体疎水クロマトグラフィーはホストセルたんぱく質核酸プロテイン A 漏出物などの不純物ほか抗体の構造異性体凝集体なども分離が可能です 600シリーズは充塡剤の細孔径を最適化することで抗体吸着量を向上させた第二世代の疎水クロマトグラフィー担体です抗体の動的吸着量は g/l ですが疎水クロマトグラフィー担体は抗体の疎水性と回収率や分離能も含めて選択する必要があります一般的な抗体分離にはフェニル基またはブチル基を持つ担体 ( Phenyl-650M, Phenyl-600M, Butyl-650M, Butyl-600M) が適しており疎水性の高い抗体にはやや疎水性の弱い担体 PPG-600Mが適していますまた混合塩溶液 (Dual salts) の利用で吸着量を向上させたり Hexyl-650Cを用いたフロースルーモードへの応用や精製抗体と薬物を結合したAntibody- Drug-Conjugate(ADC) の分離精製に Phenyl-650, Butyl-650M, PPG-600, Ether-650Mなどが使用されていますプロセス開発スクリーニング用カラム ToyoScreen MiniChrom RoboColumn ToyoScreen は各種を充塡した簡易型のスクリーニング用カラムです 1 ml 5 mlのカートリッジカラムが用意されており精製プロセス開発のための充塡剤スクリーニングや分離条件の初期討が汎用 LCシステム等に接続して容易に行えます MiniChrom はカラムサイズ 8 mm I.D. 10 cm( 容量 5 ml) で ToyoScreen カラムでのスクリーニング後分離条件の至適化や小スケールでの分取精製用に設計されたカラムです RoboColumn は Tecan 社 Freedom EVO のような全自動分注システムとの組み合わせで使用するミニカラムでハイスループットでの充塡剤スクリーニングや条件討が可能です 2

カラムサイズ : 10 mm I.D. 50 mm 試料 : 各抗体 1 g/l in 50 mm HEPES 緩衝液 + 150 mm NaCl (ph 7.0) 滞留時間 : 4 分 ( 吸着量は 10 % ブレークスルー測定値による ) 図 2.

プロテイン A リガンド漏れ出し比較出 : UV(280 nm) りん酸塩緩衝液 (ph 7.4)+0.15 mol/l NaCl 図. AF-rProtein A HC-650F における抗体濃度 ( 力価 ) と動的吸着量カラムサイズ :4.6 mm I.D. 50 mm 試料 : ヒト抗体 Fab 2 g/l in 0.1 mol/l りん酸ナトリウム緩衝液 (ph 6.

3 カラムサイズ : 10 mm I.D. 50 mm 試料 : 各抗体 1 g/l in 50 mm HEPES 緩衝液 mm NaCl (ph 7.0) 滞留時間 : 4 分 ( 吸着量は 10 % ブレークスルー測定値による ) 図 2. AF-rProtein A HC-650F の抗体動的吸着量 ( サンプル : 抗体医薬品バイオシミラー ) カラム : AF-rProtein A HC-650F(5 mm I.D. 5 cm) 試料 : 抗体溶液 ; g/l in 0.02 mol/l 滞留時間 : 2. 5 分図 4. プロテイン A リガンド漏れ出し比較出 : UV(280 nm) りん酸塩緩衝液 (ph 7.4)+0.15 mol/l NaCl 図. AF-rProtein A HC-650F における抗体濃度 ( 力価 ) と動的吸着量カラムサイズ :4.6 mm I.D. 50 mm 試料 : ヒト抗体 Fab 2 g/l in 0.1 mol/l りん酸ナトリウム緩衝液 (ph 6.5) ( 吸着量は10 % ブレークスルー測定値による ) 図 6. AF-rProtein L-650F の Fab 動的吸着量カラムサイズ :6 mm I.D. 4 cm 試料 : ヒト抗体 (1 g/l) 0.1 mol/l 酢酸塩緩衝液 (ph 4.7) 溶出 :0.1 mol/l 酢酸塩緩衝液 (ph 4.7)+ 1.0 mol/l NaCl 流速 : 試料負荷時 1.0 ml/min 溶出時 2.0 ml/min 図 8. 抗体溶出時の溶出ピーク幅 ( 溶出容量 ) 図 7. AF-rProtein L-650F の耐アルカリ性カラム : NH2-750F (5 mm I.D. 5 cm) 溶離液 A: 20 mmol/l トリス塩酸塩緩衝液 (ph 8.0) 溶離液 B: 20 mmol/l トリス塩酸塩緩衝液 +1.0 mol/l NaCl (ph 8.0) グラジエント : 溶離液 A B( リニア 60 分 ) 流速 : 1.0 ml/min 出 : UV (280 nm) 試料 : モノクローナル抗体 (IgG1 0.5 mg) 図 5. AF-rProtein A HC-650F による HCP 除去効果の比較 ( サンプル : 抗体医薬品バイオシミラー ) 図 9. モノクローナル抗体の凝集体の分離 4 5

4 製品一覧 ( プロセスクロマトグラフィー ) プロテイン A プロテイン L 担体イオン交換担体ミックスモード担体疎水クロマトグラフィー担体 6 7

5 トヨパールスクリーニング用充塡カラム (ToyoScreen) 個別グレードは総合カタログやトヨパールカタログリーフレットを参照ください 8 9

6 抗体医薬品の HPLC による分析抗体は複雑な構造を持つ糖たんぱく質で天然型でも均一ではありませんさらに製造工程 ( 培養精製 ) でも不均一性が生じるため品質管理ではこの不均一性の確認 ( 不均一性のパターンが常に一定であること ) が非常に重要です不均一性にはたんぱく質部分の二量体多量体脱アミド体末端アミノ酸変異などの他糖鎖部分のグリコフォームがありますがいずれも HPLC を用いた分析が多用されていますン交換クロマトグラフィー (IEC) を用います IEC では CM-STATや SP-STATを用いるサイズ排除クロマトグラフィーことで抗体医薬品の変異体等が高分離能短時間で分析で抗体 (IgG1) の分子量は約 15 万であり二量体凝きます ( 図 6) ヒト IgGのH 鎖 C 末端リジン (Lys) 残基は酵集体 ( 三量体以上の多量体など ) 及び抗体分解物など素 ( カルボキシペプチダーゼ ) により容易に切断されるためを分子サイズに基づいて分離定量するために結果として Lys 残基数の異なる荷電変異体が生じますこの G000SWXLや SuperSW000が広く利用されて荷電変異体は陽イオン交換クロマトグラフフィー (CIEC) にいます二量体単量体及び抗体分解物を汎用のHPLC より分析が可能です ( 図 7) インタクト抗体を CM- で同時に分離するには分離能が高い SuperSW STAT を用いて分離した結果では三つのメインピークが溶 mab HR が適しています ( 図 1) 一方出器セル容量や配出しています ( 図 7 下段クロマトグラム ) この抗体を酵素処管容量を小さくした HPLC やUHPLC を用いて抗体を分離す理し測定した結果 ( 図 7 上段クロマトグラム ) メインピークる場合は粒子径 2μm の充塡剤を4.6 mm I.D. 0 cm が一つとなることから元の三つのメインピークはそれぞれのカラムに充塡した UP-SW000が高い分離能を Lys 残基数の異なる荷電変異体であることが分かります示します図 2に抗体を G000SWXL(2 本 ) 及びアスパラギン (Asn) 残基の脱アミド化とアスパラギン酸 UP-SW000(1 本 ) で分離したクロマトグラムを (Asp) 残基の異性化は頻繁に生じますモノクローナル抗体示します薬物候補のスクリーニングなど短時間測定が必要のL 鎖 Asn0 の脱アミド化体 (Asp0) 及び H 鎖 Asp102 な場合は UP-SW000 の15 cmカラムが適しておの異性化体 (isoasp102) をCIEC で分離した例を図 8 及びり 5 分以内での分離が可能で ( 図 ) 粒子径 1.7μm の市図 9に示しますインタクト抗体を CIEC で測定した結果販 SECカラム ( 下段クロマトグラム ) より優れた分離が得ら Asp0 及びisoAsp102 の分離は不十分でしたが ( 図 8) 各れています凝集体の分析は抗体医薬品の安全性を確保すピークを分取しパパイン消化し得られたFc 及びFabをる上で非常に重要です既存のSECカラムでは三量体以上 CIEC で測定した結果 Asp0 及び isoasp102 が良好に分の凝集体を分離することは困難でしたが UltraSW 離されました ( 図 9) 最近では二重特異性抗体(Bispecific Aggregate は排除限界分子量が G000SWXLに比 antibody, diabody) の分析にも応用されていますべ高く凝集体の分離に適したカラムですたんぱく質などの高分子物質をSECで測定する場合流速を下げることで分離が向上することが一般に知られています疎水クロマトグラフィー UltraSW Aggregate を用いて低流速 (0.2 ml/min) で測定することによりモノクローナル抗体の凝集体を五量体まで分抗体の代表的な不均一性の一つに Fc 領域のメチオニン残離することが可能でした ( 図 4) 次世代抗体医薬品の一つと基 (Met) の酸化が挙げられます抗体のパパイン消化物を疎して抗体薬物複合体 (Antibody-drug conjugate; ADC) の開水クロマトグラフィー (HIC) で測定することにより Met 酸化発が盛んになっていますが ADCは抗体に疎水性の高い低の分析が可能です Butyl-NPRを用いた測定例を図分子薬物が複数結合しているためりん酸塩緩衝液などの 10 に示します一般的な移動相では回収率の低下ピークのテーリングが抗体凝集体は単量体に比べ疎水性が高いことが知られて発生することが有りますその場合移動相に有機溶媒やいますこの疎水性の差を利用し疎水クロマトグラフィーアルギニンを添加することにより改善が可能です ( 図 5) (HIC) により抗体単量体と凝集体を分離することが可能です硫酸アンモニウムを溶離液として用いた場合はほとんど分離しませんが塩化ナトリウムを用いたことで抗体単量体と凝集体 ( 二量体以上 ) が良好に分離されました ( 図 11) イオン交換クロマトグラフィー ADCは抗体分子に低分子薬物が複数個複数個所に化学抗体精製品は分子量的にはほぼ同一でも荷電変異体結合しているため不均一性が生じます低分子薬物は抗体 ( チャージアイソフォーム : 脱アミド体末端アミノ酸変異 ) に比べ疎水性が高いためこの不均一性はHICで分析するや糖鎖構造の異なる分子種 ( グリコフォーム ) から成ってことが可能です HIC を用いて低分子薬物の結合数が異なるおりこれら荷電状態の異なる成分を分離するためにはイオ ADC を分離したクロマトグラムを図 12 に示します親水性相互作用クロマトグラフィー親水性相互作用クロマトグラフィー (HILIC) は親水性の高い化合物を保持分離することが可能な分離モードで親水性低分子核酸糖類などの分離に利用されます Amide-80 や NH2-100が抗体に結合している糖鎖の構造不均一性の分析に使用されていますヒト IgG 由来の2-AB 化 N 型糖鎖を Amide-80 2μm で測定した例を図 1 に示します逆相クロマトグラフィー逆相クロマトグラフィーは MSとの組み合わせで一般的にペプチドマッピングに利用されますまた分解物やフラグメント (Fa b F c H 鎖 L 鎖など ) の分析フラグメントの変異体の分析に利用されます図 14 にマウスモノクローナル抗体の還元体を Protein C4-00 で分離した例を示します表 1. 抗体医薬品の HPLC 分析に用いられる主な分離モードと特長アフィニティークロマトグラフィーアフィニティークロマトグラフィーは主として生体高分子同士或いは低分子物質との親和性により分離する方法です抗体と親和性があるたんぱく質としては Protein A Protein G Protein Lが知られており各たんぱく質をリガンドとした充塡剤カラムが抗体の分離に利用されています Protein A-5PWはアルカリ耐久性があり抗体吸着量が高い組換えProtein Aを固定化した分析カラムで抗体の定量範囲が広く耐久性が高いことが特長ですまた 1 分以内での抗体の短時間測定が可能です図 15にCHO 細胞培養液上清中の抗体を Protein A-5PW で分離した例を示しますフェニルボロン酸はアルカリ条件下で1,2-cis-ジオールと共有結合することが知られていますこの作用を利用しフェニルボロン酸をリガンドとしたカラムを用いて糖たんぱく質を分離することが可能です図 16 に Boronate-5PW を用いて糖化抗体を分離した例を示します分離モード分離原理特長用途カラム UP-SW000 サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) 分子の大きさ SuperSW mab 抗体の単量体と凝集体 ( 二量体多量体など ) UltraSW Aggregate の分離または抗体の低分子分解物との分 G000SWXL 離カラムを 2 本直列接続して分析する場合も SuperSW000 ある G2000SWXL SuperSW2000 イオン交換クロマトグラフィー (IEC) * 疎水クロマトグラフィー (HIC) 分子のイオン性分子の表面疎水性親水性相互作用クロマトグラフィー (HILIC) 分子の親水性逆相クロマトグラフィー (RPC) アフィニティークロマトグラフィー (AFC) * 同様な目的でキャピラリー電気泳動を用いる場合もある分子の疎水性生物学的親和性抗体の荷電の違いによる異性体 ( チャージアイソマー ) の分離非多孔性充塡剤を用いて高分離で短時間の分析が可能抗体の立体構造における表面疎水性に基いた分離 IEC で分離できない構造異性体の分離に適している CM-STAT SP-STAT Q-STAT Butyl-NPR Phenyl-5PW 抗体結合糖鎖の構造解析に適している Amide-80 NH2-100 高分離能ペプチドマッピングフラグメントの分析に適している Protein C4-00 培養液中の抗体の定量糖化抗体の分離定量 Protein A-5PW Boronate-5PW 10 11

7 A min B min C A) B) 量体凝集体凝集体量体 G000SWXL (5 m 78 mm I 0 m 2) 4 UP-SW000 (2 m 46 mm I 0 m) min カラム凝集体二量体二量体量体 min 図 1. 抗体医薬品の分離 A) G000SWXL 2 B) UP-SW000 二量体単量体単量体単量体カラムサイズ (mm I ml) 分解物大 R R R (pea 12) (pea 2) (pea 4) R( 三量体 / 二量体 )= 0.96 R( 二量体 / 単量体 )= 2.2 R( 三量体 / 二量体 )= 1.2 R( 二量体 / 単量体 )=.11 R( 三量体 / 二量体 )= 1.40 R( 二量体 / 単量体 )= カラム : A; G000SWXL(5 μm, 7.8 mm I.D. 0 cm 2) B; UP-SW000(2 μm, 4.6 mm I.D. 0 cm) 溶離液 : 100 mmol/l りん酸ナトリウム緩衝液 (ph 6.7) mmol/l 硫酸ナトリウム % NaN 流速 :A; 1.0 ml/min, B; 0.5 ml/min 出 : UV(280 nm) 試料 : マウス-ヒトキメラIgG 1. 三量体 2. 二量体. 単量体 4. フラグメント UP-SW000 1 本でG000SWXL 2 本連結より高い分離能が半分の時間で得られます図 2.G000SWXL(2 本連結 ) と UP-SW000(1 本 ) の分離能の比較カラム : A. G000SWXL B. SuperSW mab HR C. UltraSW Aggregate カラムサイズ : 7.8 mm I.D. 0 cm 溶離液 : 0.2 mol/l りん酸ナトリウム緩衝液 (ph 6.7) 流 % NaN 速 : 0.8 ml/min 出 : UV(280 nm) 試料 : マウス - ヒトキメラ IgG 注入量 : 10 μl SuperSW mab HR は mab 二量体と単量体の分離に優れていますフラグメントの分離も可能です UltraSW Aggregate は mab 三量体と二量体の分離に優れています凝集体部分の分離帯が最も広いカラムです 10 mlmin 02 mlmin Tratuumab 量体 T-M1 A) 量体 min min カラム : UltraSW Aggregate (7.8 mm I.D. 0 cm) B) T-M1 溶離液 : 0.2 mol/l りん酸ナトリウム緩衝液 (ph 6.7) Tratuumab % NaN min 流速 : 0.2, 1.0 ml/min 出 : UV(280 nm) カラム : G000SWXL(7.8 mmi.d. 0 cm) 溶離液 : A;0.2 mol/lりん酸カリウム緩衝液 mol/l KCl (ph 6.95) 注入量 : 10 μl B;A/ イソプロパノール =85/15 試料 : ヒトモノクローナル抗体 5 g/l 流速 : 0.5 ml/min 出 : UV(280 nm) 図 4. 凝集体の分離試料 : Trastuzumab, T-DM1 *A. Wakankar, et al., mabs (2), , 2011 図 5.ADC のSEC による分離カラム : CM-STAT(4.6 mm I.D. 10 cm) 溶離液 : A;20 mmol/l MES 緩衝液 (ph 6.0) B;20 mmol/l MES 緩衝液 mol/l NaCl(pH 6.0) グラジエント : 10 % B 0 % B 15 分リニア流速 : 1.0 ml/min e 出 : UV(280 nm) d 試料 : モノクローナル抗体医薬品 a,b,c,d,e 注入量 : 20 μl(0.5 g/l) ( 本データは相模中央研究所柿谷博士の御厚意によります ) b a min 図 6. イオン交換クロマトグラフィーによるモノクローナル抗体医薬品の分離 ( 塩濃度グラジエント ) A) B) 4 UHPLC 用 SECカラム (17 m 46 mm I 15 m) min カラム A) UP-SW000 B)UHPLC 用 SECカラム UP-SW000 (2 m 46 mm I 15 m) R(pea 12) R(pea 2) カラム : A; UP-SW000(2 μm, 4.6 mm I.D. 15 cm) B; 市販 UHPLC 用 SEC カラム (1.7 μm, 4.6 mm I.D. 15 cm) 溶離液 : 100 mmol/l りん酸ナトリウム緩衝液 (ph 6.7) mmol/l 硫酸ナトリウム % NaN 流速 :0.5 ml/min 出 : UV( 280 nm), マイクロセル注入量 : 5 μl, Rheodyne Model 8125 試料 : マウス-ヒトキメラIgG 1. 三量体 2. 二量体. 単量体 4. フラグメントモノクローナル抗体の三量体 / 二量体 / 単量体の分離能が高く単量体 / フラグメントの分離が良好です K KK min カラム : CM-STAT(4.6 mm I.D. 10 cm) 溶離液 : A;20 mmol/l MES 緩衝液 (ph 6.0) B;20 mmol/l MES 緩衝液 mol/l NaCl (ph 6.0) グラジエント : 10 % B 0 % B 15 分リニア流速 : 1.0 ml/min 出 : UV(280 nm) 注入量 : 20 μl 試料濃度 : 0.5 g/l 試料 : モノクローナル抗体医薬品 ( 上図 ; カルボキシペプチダーゼB 処理品下図 ; 未処理品 ) 図. モノクローナル抗体の分離 ( 市販カラムとの比較 ) 図 7. モノクローナル抗体の IEC による分離 (H 鎖 C 末 Lys 残基の欠失変異体分析 ) 12 1

8 Peak カラム : CM-STAT(4.6 mm I.D. 10 cm) 溶離液 : A;20 mmol/l MES 緩衝液 (ph 6.0) B;20 mmol/l MES 緩衝液 mol/l NaCl (ph 6.0) カラム : Butyl NPR(4.6 mm I.D..5 cm) 溶離液 : A;20 mmoi/lりん酸ナトリウム緩衝液 + mol/l NaCl(pH 7.0) B;20 mmoi/lりん酸ナトリウム緩衝液 (ph 7.0) isoasp グラジエント : 10 % B 25 % B 15 分リニアグラジエント : 0 %B 85 % B 10 分リニア Asp0 Peak 1 Peak 流速 : 1.0 ml/min 出 : UV (280 nm) 温度 :0 試料 : モノクローナル抗体 0.2 g/l, 20 μl 流速 : 1.0 ml/min 出 : 蛍光 (Ex. 280 nm; Em. 48 nm) 注入量 : 5 μg 図 11. モノクローナル抗体の凝集体フラグメントの HIC による分離 min -10 図 8. モノクローナル抗体の IEC による分析 (Asn 残基の脱アミド化 Asp 残基の異性体化変異体分析 ) カラム : SP-STAT (4.6 mm I.D. 10 cm) 溶離液 : A;20 mmol/l MES 緩衝液 (ph 6.0) B;20 mmol/l MES 緩衝液 mol/l NaCl (ph 6.0) グラジエント : 0 % B 25 % B 15 分リニア流速 : 1.0 ml/min 出 : UV (280 nm) 温度 : 0 試料 : 図 8クロマトグラムの各分画をパパイン消化し得られた分解物カラム : Butyl-NPR (4.6 mm I.D. 10 cm) 溶離液 : A;25 mmol/l りん酸ナトリウム緩衝液 (ph 7.0) mol/l 硫酸アンモニウム B;25 mmol/l りん酸ナトリウム緩衝液 (ph 7.0)/ イソプロパノール = 8 / 2 グラジエント : 0 %B 100 % B 20 分リニア流速 : 0.5 ml/min 出 : UV(280 nm) 注入量 : 10 μl 試料濃度 : Trastuzumab; 0.24 g/l ADC(Trastuzumab-vcMMAE); 2.2 g/l 図 12.Trastuzumab と ADC の HIC による分離図 9. モノクローナル抗体の IEC による分析 ( 図 8 の各ピークのフラグメント分析 ) 図 10. モノクローナル抗体の HIC による分析 (Met 残基酸化体分析 ) カラム : Butyl-NPR(4.6 mm I.D..5 cm) 溶離液 : A;20 mmol/l りん酸ナトリウム緩衝液 + 2 mol/l 硫酸アンモニウム (ph 7.0) B;20 mmol/l りん酸ナトリウム緩衝液 (ph 7.0) グラジエント : 25 % B 60 % B 10 分リニア流速 : 1.0 ml/min 出 : UV(214 nm) 温度 : 5 注入量 : 2 g/l 2 μl 試料 : モノクローナル抗体医薬品 * パパインで酵素消化後注入 * Fc ピークの数字 (0 1 2) はメチオン残基酸化体数図 1.2-AB 化糖鎖の LC-MS 分析カラム : Amide-80 2μm(2.0 mm I.D. 15 cm) 溶離液 : A;50 mmol/l ギ酸アンモニウム緩衝液 (ph 7.5) : B; アセトニトリルグラジエント : 75 %B(0 5 分 ) %B(5 0 分 ) 流速 : 0. ml/min 温度 :40 試料 : 2-AB 化 N 型糖鎖 ( ヒトIgG) (Ludger, cat.# CLIBN-IGG-01) ~80 pg( 80 % アセトニトリルで希釈 ) 出 :(A) 蛍光 Ex. 0 nm; Em. 420 nm (B)MS, ESI positive, SIM (Shimadzu LCMS-800) 14 15

9 図 14. モノクローナル抗体還元体の RPC による分離図 15. ポリクローナル IgG の分離図 16. 糖化抗体の AFC による分離カラム : Protein C4-00 (4.6 mm I.D. 15 cm) 溶離液 : A;H 2 O/ アセトニトリル /TFA = 90/10/0.05 (v/v/v) B;H 2 O/ アセトニトリル /TFA = 20/80/0.05 (v/v/v) グラジエント : 0 %B 100 %B 45 分リニア流速 : 1.0 ml/min 出 : UV(215 nm) 温度 : 50 注入量 : 100 μl 試料 : mab-1, mab-2( ジチオスレイトールで還元 ) カラム : Protein A-5PW(4.6 mm I.D..5 cm) 溶離液 : A;20 mmol/l りん酸ナトリウム緩衝液 (ph 7.4) : B;20 mmol/l りん酸ナトリウム緩衝液 (ph 2.5) 溶離液切替 : 分溶離液 A 流分溶離液 B 分溶離液 A( 再平衡化 ) ( ポンプとインジェクタとの間にスタティックミキサ ( 容量 10 μl) を装着 ) 速 : 2.0 ml/min 出 : UV(280 nm) 温度 : 25 注入量 : 20 μl 試料 : (Ⅰ)0.5 g/l ポリクローナル IgG( 溶離液 A に溶解 ) (Ⅱ)0.5 g/l ポリクローナル IgG を含む CHO 細胞培養液上清 CHO 細胞培養液上清中の I gg が短時間で分離可能です ( 分析時間 2 分 ) カラム : Boronate-5PW(7.5 mmi.d. 7.5 cm) 溶離液 : A; 50 mmol/l EPPS, 10 mmol/l Tris, 200 mmol/l NaCl, 0.05 % NaN : B; 溶離液 A+500 mmol/l ソルビトールグラジエント : 0 % B(0 20 分 ) % B(20 25 分 ) 出 : UV(280 nm) 温度 : 40 試料 : ヒトモノクローナル抗体 *B. Zhang, et al., Anal. Chem. 2008, 80, 製品一覧 ( 品質管理分析用カラム ) サイズ排除クロマトグラフィーイオン交換クロマトグラフィー疎水クロマトグラフィー 16 17

10 順相クロマトグラフィー逆相クロマトグラフィーアフィニティークロマトグラフィー 18 19

サイズ排除クロマトグラフィー SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY New TSKgel UP-SW3000 高性能水系 SEC カラム特長主な対象物質技術資料微粒子充塡剤 2μm のためたんぱく質抗体酵素などの生体高分子の迅速分析 15 cm カラム高

サイズ排除クロマトグラフィー SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY New TSKgel UP-SW3000 高性能水系 SEC カラム特長主な対象物質技術資料微粒子充塡剤 2μm のためたんぱく質抗体酵素などの生体高分子の迅速分析 15 cm カラム高 New TSKgel UP-SW000 高性能水系 SEC カラム特長主な対象物質技術資料微粒子充塡剤 μm のためたんぱく質抗体酵素などの生体高分子の迅速分析 cm カラム高分離分析 0 cm が可能です充塡剤の表面特性は既存の TSKgel SW タイプと同様です細孔特性細孔容積較正曲線の傾きなどは TSKgel G000SWXL と同様で抗体 IgG