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1 第 11 回ひびき薬剤耐性菌シンポジウム 2014 年 5 月 18 日ランチョンセミナー 2 細菌検査の流れ 検体採取 1 日後 (2 日後 ) 3 日後 (2 日後 ) 同定 検体提出当日 細菌検査室における同定の Golden Standard について 純粋分離 感受性測定 グラム染色鏡検 村谷哲郎 白血球数グラム染色所見 分離培養菌量一部の菌種名 菌種名 薬剤感受性 培養は少なくとも2 日間観察するので 2 日後に発育した菌については1 日遅れる 偏性嫌気性菌などさらに発育の遅い菌ではさらに時間がかかる グラム陽性球菌とグラム陰性桿菌の構造 塗抹染色 各種酵素 ( 糖分解 活性酸素分解 有機物分解など ) 30S 50S 外膜細胞壁細胞膜リボソーム DNA 30S 50S プレビカラーグラムグラム染色自動染色機 鞭毛 せん毛 莢膜 抗原性 : 細胞壁表層構造 外膜表層構造 ( 逆受け身ラテックス凝集反応 ) 運動性 : 鞭毛の有無生化学的性状試験特異的 DNA 配列保有の有無 16S rrna の DNA 塩基配列の決定 蛍光顕微鏡 グラム染色鏡検 (x1000) C D これは!(400 倍動画 ) A B G H E F A:MRSA, B: E. faecalis, C: E. coli, D: S. marcescens, E: P. aeruginosa, F: C. koseri, G: Candida sp., H: P. aeruginosa

2 髄液直接 Cryptococcus neoformans 各種培養器 コロニーから 一般細菌の培養 基本培地 1. 5% 羊血液寒天培地 2. チョコレート寒天培地 3. ドリガルスキー改良培地特殊培地 ( 検体種別 目的菌により適宜使用 ) エッグヨーク寒天培地 ( 黄色ブドウ球菌 ) VRE 選択培地 (VRE) TCBS 寒天培地 ( 便 : ビブリオ ) SS 寒天培地 ( 便 : 赤痢 サルモネラ ) ソルビトール加マッコンキー寒天培地 ( 便 :O157) サイアマーチン寒天培地 ( 淋菌 髄膜炎菌 ) CCDA 寒天培地 ( カンピロバクター ) サブロー寒天培地 ( 真菌 ) クロモアガー カンジダ ( 酵母様真菌 ) 臨床検体の培養結果 次培養結果 Campylobacter spp. 同定 : 培養はCampylobacter 選択培地 (CCDA 培地 : 関東化学 ) を用い 発育を認めたもののうち 疑わしいコロニー ( ラフ状で光沢を有する ) について オキダーゼ試験を行い陽性であったコロニーを鏡検すれば Campylobacter sp. まではわかるはず 選択培地 CCDA 上での発育 (Charcoal cefoperazone deoxycholate agar) グラム染色像 血液培養で 5 日目で陽性となったら Helicobacter cinaedi を疑い 検査を進める

3 TCBS 上のコロニー鑑別 WYOα 培地 Legionella pneumophila BCYE 培地 ph6.9 Yeast Extract Charcoal Lcystein HCl 可溶性ピロリン酸鉄 ACES α ケトグルタル酸カリウム寒天 10 g 2 g 0.4 g 0.25 g 10 g 1 g 15 g 青緑色の大きい集落 ( 直径 2mm 強 ):Vibrio parahaemolyticus 青緑色の小さい集落 ( 直径約 1mm ):Vibrio mimicus 黄色の大きいムコイド集落 :Vibrio alginolyticus 黄色の小さい集落 :Vibrio cholerae 右図 :Vibrio fluvialis 13 BCYE (Buffered Charcoal Yeast Extract) 寒天培地に抗菌剤を添加した培地が WYOα (WadowskyYeeOkuda αketoglutaric acid) 寒天培地 ph6.7 Glycine Vancomycin PolymixinB Amphotericin B 3 g 5 mg 10,000 units 80 mg 菌種の同定 分類学の変遷生化学性状による分類 16S rdna の配列による分類 1995 年以降この変更により 大幅に菌名が変更されている VITEK2:64 ウェル / カード 細菌の同定 ( 生化学性状試験 ) 生化学性状による同定 ( 各種酵素 器官保有の有無 ) trna 試験管法 (LIM, TSIなど ) 30S subunit VITEK2, WalkAway 自動機器 16S rrna BD Crystal 用手法 50S subunit 23S rrna 5S rrna RapID ( 偏性嫌気性菌用 ) 用手法 免疫反応 ( 抗体との反応性 ) 特異的遺伝子による同定 Probetec (SDA 法 ) 淋菌 クラミジア mrna RNA protein TaqManPCR 結核菌群 Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare 16S リボソームRNAのDNA 塩基配列を決定 難しくはないが コストと時間がかかるため 研究としてのみ実施 タンパク質のレーザー照射電離パターンの解析 1996 年 Claydon MALDITOF MS 2,000 Da~20,000Daのタンパク質の電離パターンを解析この領域にリボソーム由来タンパク質が50~70% を占める API:20 ウェル / キット BBL クリスタル :30 ウェル / キット IDテスト HN:20ウェル / キット各種酵素保有等の有無により同定する 糖 ( 乳糖 白糖 マルトース トレハロース等 ) アミノ酸類 ( オルニチン リジン ヒスチジン等 ) 有機酸 ( 乳酸 コハク酸 クエン酸等 ) 有機物 ( 尿素 ジクロロアミノフェノール等 ) 感受性 ( ノボビオシン コリスチン オプトヒン バシトラシン 塩化ナトリウム等 ) 分類のための方法とその解釈範囲 解析方法 GC 含量生化学性状パターン解析 MALDITOF MS 特異的遺伝子を標的とした核酸増幅法 16S rdna の塩基配列の相同性 血清型 ファージ型 MLST (Multilocus sequence typing) 遺伝子多型パターン解析 (PFGE) 結果の解釈属名推定菌種同定菌種同定菌種決定菌種決定 株の種類の分類クローンのグループ化クローンの同一性 微生物同定における MALDI TOFMS の位置付け MALDI TOFMS を用いた菌種同定法は MS 2,000 Da~20,000Da (1Da kg) のタンパク質の電離パターンを既知の菌種のパターンと比較して 菌種を決定する方法である この領域で検出されるフラグメントは リボソーム由来タンパク質が 50~ 70% を占めるので 同定に適していると考えられる 現在の菌種同定の Golden Standard は 16S リボソーム RNA の DNA 塩基配列を Sequence し 登録されている塩基配列と比較する方法である MALDI TOFMSの場合 リボソーム由来タンパク質のフラグメントが半分以上を占める領域を解析しているだけであり 他のタンパク質のフラグメントも多数存在しているので Golden Standardにはなり得ない 株により リボソームタンパク質以外に由来するフラグメントは多様と考えられるので データベース構築も塩基配列と違って 難しいと考えられる 国により多少違うことも考えられ 日本の株でのデータベース構築も重要な作業と考える

4 質量分析法 Mass Spectrometry 真空中で試料をイオン化すると 静電力によって試料は装置内を飛行する 飛行しているイオンを電気的 磁気的な作用等により質量電荷比に応じて分離し その後それぞれを検出することで 質量電荷比を横軸 検出強度を縦軸とするマススペクトルを得ることができる マススペクトル (Mass Spectrum, MS) とは 質量分析の結果得られる 横軸に質量 / 電荷 (m/z 値 ) 縦軸に検出強度をとったスペクトルである 既知物質の同定や新規物質の構造決定に用いられる 単離が必要なので 各種分析機と直結させても使用可 LC/MS, GC/MS, CE/MS イオン化の方法 EI (Electron Ionization, 電子イオン化 ) 法 CI (Chemical Ionization, 化学イオン化 ) 法 FD (Field Desorption, 電界脱離 ) 法 FAB (Fast Atom Bombardment, 高速原子衝突 ) 法 MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption, マトリックス支援レーザー脱離イオン化 ) 法 ESI (ElectroSpray Ionization エレクトロスプレーイオン化 ) 法 APCI(Atomospheric Pressure Chemical Ionization 大気圧化学イオン化 ) 法など田中耕一氏はソフトレーザー脱離イオン化法の開発者としてノーベル賞を受賞した 192 cm AXIMA バイテック MS MALDI TOF MS を原理として微生物同定装置 microflex MALDI バイオタイパー 110 cm 1. 少ない菌量で (10 5 コ ) 全処理が簡便 2. 精製されたタンパクでなくてもイオン化効率は低下は少ない 3. 1 価のイオン生成が主体なので 解析が容易 得られたマススペクトルパターンとライブラリーで一致するものを探し 同定する シスメックス ビオメリューブルカー 日本 BD シーメンス 栄研化学(4 社併売 T. ) Muratani 再測定結果 VITEKMSでは分けることが出来ない菌種とその対処法 菌名 Enterobacter cloacae Enterobacter asburiae 信頼値信頼性レベル 質量分析では同じパターンとなってしまうので 菌種名を決定出来ないものがある 生化学性状追加試験を実施すれば鑑別可能な菌種がある なるべくその場で結果が出る方法を選択インドール ( 綿棒に菌体をとり 直接コバック試薬を滴下 ) 運動性試験 ( 生標本を観察 有 無だけでなく 動き方も含めて確認 ) コロニー性状 ( 溶血 色 集落の作り方 ) 乳糖分解 ( ドリガルスキーを確認 ) オキシダーゼ PYR ラッテクス凝集試験時間がかかるが実施している方法 VITEK2 BBL クリスタル糖分解試験 (OF 培地 ) VP 試験 VITEKMS で鑑別出来ない組み合わせ Achromobacter xylosoxidans/denitirificans Acinetobacter baumannii complex (baumannii, calcoaceticus, nosocomialis, pitii) Aeromonas hydrophila/caviae Bacillus cereus/thuringiensis/mycoides Bacillus subtilis/amyloliquefaciens Bifidobacterium spp. (5 菌種 ) Brevibacillus spp. (7 菌種 ) Corynebacterium amycolatum/xerosis Escherichia coli/shigella spp. Lacobacillus casei/paracasei Micrococcus luteus/lylae Paenibacillus spp. (8 菌種 ) Proteus vulgaris/penneri Salmonella group (Salmonella Typhi, Salmnella Paratyphi A, Salmonella Gallinarum, Salmonella enterica ssp. arizonae/diarizonae は鑑別可 ) その他 subspecies を鑑別出来ない菌種あり 同定キット 2 つ使ったらコストと時間の無駄 自動機器やキットの結果を鵜呑みにしてはいけない! コンタミネーション 菌株の取り違い 入力の間違い 機器の限界 機器の不良 安易にキットに頼らず正確に同定 コストと時間をかけずに同定するためには 迅速試験カタラーゼ オキシダーゼ インドール 運動性 抗原抗体反応 コロニーの色特徴的なコロニー 試験管培地の活用糖分解 VP 選択剤の活用オプトヒン バシトラシン ノボビオシン 亜テルル酸バンコマイシン アズトレオナム ゲンタマイシン コリスチン

5 Escherichia coli/shigella spp. 乳糖 BTB 寒天培地 Achromobacter の菌種決定 青変 インドール 黄変 Achromobacter denitrificans Achromobacter xylosoxidans 陰性 生標本で運動性鏡検 陽性 E. coli OF 培地 (10%Glucose) vira PCR vira EIEC or Shigella spp. 赤痢菌免疫血清 E. coli Aeromonas hydrophila/caviae Aeromonas hydrophila/caviae 99.9 Streptococcus 溶血素 (hemolysin) による分類 α 溶血 : 緑色を帯びた不完全溶血帯を生ずる α 溶連菌 緑連菌 ビリダンスグループ連鎖球菌 oral streptococci などと呼ばれる 過酸化物により 赤血球が障害され鉄イオンが酸化され緑色を呈色する? α 溶血 : 溶血帯が狭い不完全溶血だが緑変をほとんど認めないものを指す 溶血素に類似するが活性が弱い溶血素を産生する菌などに見られる 通常 溶血に分類される 溶血 : コロニー周囲に透明帯を生ずる完全溶血 溶血帯は広く その内部ではほとんどの赤血球が溶血によって消失する (= 完全溶血 ) 細胞膜に孔を生じるなどの機能を持つ 細胞傷害性の強い溶血素を産生する細菌で見られる 溶連菌 溶連菌と呼ばれる γ 溶血 : 溶血素を持たず溶血が起こらない場合 非溶血性溶連菌 抗原性による分類 (Lancefield の分類 ) A, B, C, F, G,, V (D: Enterococci) VP で鑑別 Streptococcus agalactiae 以外は VITEKMSラテックスの結果で菌種名を決定 菌種とLancefieldの分類まで報告 溶連菌 Streptococcus dysgalactiae ssp. dysgalactiae Streptococcus pyogenes Streptococcus dysgalactiae ssp. equisimilis ラテックス A なら PYR 実施 pyogenes, ー equisimilis G またはーなら equisimilis C なら ssp. dysgalactiae or equisimilis 必要に応じて VITEK2 などで決定 Streptococcus のコロニー性状 (A) S. pyogenes (B) S. agalactiae (C) S. dysgalactiae subsp. equisimilis (Lancefield group G) (D) S. anginosus, S. dysgalactiae subsp. equisimilis (E), (F) S. pneumoniae MCM 10 th ed.

6 Streptococcus の血液寒天培地上の発育 溶血 S. pyogenes GAS (α ) 溶血 CAMP test S. agalactiae GBS α 溶血 Optochin test S. pneumoniae Viridans group S. pyogenes S. agalactiae S. dysgalactiae ssp. dysgalactiae S. dysgalactiae ssp. equisimilis S. equi ssp. equi S. equi ssp. zooepidemicus S. canis S. anginosus group S. porcinus Viridans group Streptococcus 属の性状 Lancefield A B C A, C, G, L C C G A, C, G, F, none E, P, U, V, none Colony Small Hemolysis (α ) CAMP PYR いずれの菌種も非溶血株が存在する fpresence of the enzyme pyrrolidonyl aminopeptidase. gcamp factor reaction (cohemolysis in the presence of the Staphylococcus aureus betahemolysin) hvogesproskauer test (formation of acetoin from glucose fermentation). (α ) α,, γ (α ) α, γ VP 追加試験により菌名を決定するもの Bacillus cereus/thuringiensis/mycoides Colony 性状で B. cereus/thuringiensis または B. mycoides で報告 Enterobacter cloacae/asburiae 生標本で運動性確認 わかりにくければ VP 実施 ( なら E. cloacae) 培養温度とコロニー性状 B. mycoides B. licheniformis B. megaterium 22 Streptococcus dysgalactiae ssp dysgalactiae/equisimilis ラテックス C 群 Streptococcus dysgalactiae で報告 必要に応じて VITEK2 で同定その他 ( 主に G 群 ) Streptococcus dysgalactiae ssp equisimilis Corynebacterium amycolatum/xerosis 通常このまま報告 Morganella morganii ssp morganii/sibonii Trehalose:Morganella morganii ssp sibonii Treholose:Morganella morganii ssp morganii 37 鞭毛染色 ( レイフソン ) と運動性確認 (400 倍鏡検動画 ) Pseudomonas aeruginosa (400 倍動画 ) レイフソン染色試薬は自家製とし タンニン酸の濃度を 80% とするとうまくいくらしい ( レイフソン大久保変法 )

7 追加試験により菌名を決定している菌種 Achromobacter xylosoxidans/denitrificans Glucose Aeromonas hydrophila/caviae VP 本来同定できるが よく複数菌名が表示される菌種とその対処法 まず 再度レーザー照射を行い再判定を行う それでも決定できない時は Raoultella ornithinolytica/planticola/terrigena PCR (lactamase 領域 ) で決定 Chryseobacterium indologenes/gleum 溶血 なら C. indologenes A. denitirificans A. xylosoxidans Micrococcus luteus/lylae コロニー白色黄色 Trehalose M. lylae M. luteus A. caviae A. hydrophila Proteus vulgaris/penneri インドール P. penneri P. vulgaris Globicatella saguinis/sulfidifaciens PYR なら G. saguinis Citrobacter braakii/freundii/gillenii/murliniae/rodentium/sedlakii/werkmenii/youngae Citrobacter freundii complex, これ以外の菌種も入ったら Citrobacter sp. Pseudomonas fluorescens/veronii 生標本観察直進のみであれば P. veronii Burkholderia cepacia/vietnamiensis VITEK2 へ Corynebacterium pseudodiphtheriticum/propinquum Corynebacterium sp. Streptococcus salivarius ssp salivarius/streptococcus vestibularis 溶血 なら Streptococcus vestibularis 菌名が複数表示された場合でも 追加試験を実施せずそのまま報告するもの Acinetobacter baumannii/calcoaceticus/nosocomialis/pittii A. baumannii complex Bacillus subtilis/amyloliquefaciens このまま Campylobacter jejuni ssp jejuni/doylei Campylobacter jejuni Kerstersia gyiorum 特定の施設の喀痰から 頻繁に同定不能菌が検出された VITEKMS では 明確なパターンが示されるが 同定不能となる VITEK2 やその他のキットでも同定不能 複数株について 16SrDNA 約 1,500bps を解析したところ Kerstersia gyiorum と同定 NFGNR, コロニー性状を確認し VITEKMS 同定不能かつ特徴的 3 peak を認めた場合 本菌名で報告することとしている Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae/ozaenae/rhinoscleromatis K. pneumoniae Streptococcus constellatus ssp constellatus/pharyngis S. constellatus Streptococcus mitis/oralis このまま ただし 血液や髄液由来株の場合は VITEK2, BBL クリスタルなどを追加する場合もある 細菌検査室における同定の Golden Standard は? どこまで菌種名を報告するか 属名までではだめか 基準はない 少なくとも下記の 3 つが一致することを確認する必要がある グラム染色 コロニー性状 自動機器 ( 質量分析 生化学性状 ) または同定キット Ex. グラム陽性球菌 自動機器 : 肺炎球菌 オプトヒン感受性しかし コロニー性状は肺炎球菌とは思えない 肺炎球菌特異的酵素 LytA の PCR 実施 陰性グラム陽性球菌 ( 同定不能 ) で報告 我々は その他の菌種も含め 難しいケース ( 主に自動機器の結果とコロニー性状が一致しない場合 ) は PCR に頼っているが どこの施設でも実施できるわけではない 何を Golden standard とするかはそれぞれの施設で決めておく必要がある PCR も論文になっているからと言って 必ずしも特異的とは限らない Primer 配列を吟味する必要あり ある論文に記載されている Campylobacter jejuni の配列は偽陰性多発 ジフテリアの国内届出患者数 感染症予防法二類感染症 1999 年 1 例報告があるが以降国内では報告なし Corynebacterium diphtheriae 99.9% と同定されても 安易に報告はできない これまで 2 例経験 同定および毒素のための primer set を作成し PCR まで確認した後 報告

8 喀痰からCorynebacterium diphtheriae が分離されたケース 97 才女性 8/ 特に症状なし 監視培養? VITEKMSにて Corynebacterium diphtheriae 99.9% となる 特異的 Primerを作成し PCRで確認 陽性毒素遺伝子に対しても特異的 Primerを作成 陰性 2014 年 5 月にも94 才女性から分離された 感染症予防法二類感染症検査方法 ( 病変 ( 感染 ) 部位からの採取材料 ) 1. 分離 同定による病原体の検出 かつ 分離菌におけるジフテリア毒素の確認 2.PCR 法による病原体の遺伝子の検出 (2014 年 5 月 12 日削除 ) ( ) 本感染症は Corynebacterium diphtheriaeによるものであるが Corynebacterium ulcerans 及びCorynebacterium pseudotuberculosisにおいてもジフテリア毒素を産生する株が確認されているので 分離 同定による病原体の検出 病原体の毒素遺伝子の検出の際に留意が必要である (2014 年 5 月 12 日削除 ) ( ) ジフテリア菌 (Corynebacterium diphtheriae) であっても ジフテリア毒素非産生性の菌は届出の対象ではない Corynebacterium ulcerans 及びCorynebacterium pseudotuberculosisについては ジフテリア毒素を産生する株があるものの それらは届出の対象ではない (2014 年 5 月 12 日新設 ) TINSDALE AGAR (Billings modification) プロテオースペプトン酵母エキス L システイン寒天 20.0 g 5.0 g 0.24 g 15.0 g サプリメント血清 100 ml 亜テルル酸カリウム 345 mg チオ硫酸ナトリウム 425 mg 1L C. diphtheriae biotype gravis 24 時間培養後 暗褐 C. diphtheriae biotype mitis 色ハローを伴う隆起し C. ulcerans 光沢のある小さな黒色コロニー C. diphtheriae biotype intermedius 36 時間培養後 ハ ジフテロイド C. pseudodiphtheriticum Haemophilus sp., Klebsiella sp. Neisseria sp., Staphylococcus sp. Streptococcus sp. Proteus sp 時間好気培養 炭酸ガス培養不可 ローを伴う淡褐色コロニーハローを伴わない暗褐色コロニー 培地の変色がない微小コロニー 特徴的な臭気と形状を持つ黒褐色コロニー

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No. 1 Ⅰ. 緒言現在我国は超高齢社会を迎え それに伴い 高齢者の健康増進に関しては歯科医療も今後より重要な役割を担うことになる その中でも 部分欠損歯列の修復に伴う口腔内のメンテナンスがより一層必要となってきている しかし 高齢期は身体機能全般の変調を伴うことが多いため 口腔内環境の悪化を招く 学位論文内容の要約 甲第 692 号論文提出者金野弘靖 論文題目 口腔レンサ球菌における環状ヌクレオチドの働きについて No. 1 Ⅰ. 緒言現在我国は超高齢社会を迎え それに伴い 高齢者の健康増進に関しては歯科医療も今後より重要な役割を担うことになる その中でも 部分欠損歯列の修復に伴う口腔内のメンテナンスがより一層必要となってきている しかし 高齢期は身体機能全般の変調を伴うことが多いため 口腔内環境の悪化を招くことに成り易い

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