Journal Club Journal Club Mediator Probe PCR: A Novel Approach for Detection of Real-Time PCR Based on Label-Free Primary Probes and S

Size: px

Start display at page:

Download "Journal Club Journal Club Mediator Probe PCR: A Novel Approach for Detection of Real-Time PCR Based on Label-Free Primary Probes and S"

ゆいとあんさい
4 years ago
Views:

Mediator Probe PCR: A Novel Approach for Detection of Real-Time PCR Based on Label-Free Primary Probes and Standardized Secondary Universal Fluorogenic Reporters Bernd Faltin 1, Simon Wadle 1, Günter

Centre for Biological Signaling Studies, University of Freiburg, 79100 Freiburg, Germany, 3 HSG-IMIT, Freiburg, Germany.

1 Mediator Probe PCR: A Novel Approach for Detection of Real-Time PCR Based on Label-Free Primary Probes and Standardized Secondary Universal Fluorogenic Reporters Bernd Faltin 1, Simon Wadle 1, Günter Roth 1, Roland Zengerle 1, 2, 3 and Felix von Stetten 1, 3,* 1 Laboratory for MEMS Applications, Department of Microsystems Engineering IMTEK, University of Freiburg, Freiburg, Germany, 2 BIOSS Centre for Biological Signaling Studies, University of Freiburg, Freiburg, Germany, 3 HSG-IMIT, Freiburg, Germany. * Address correspondence to this author at: Georges-Koehler-Allee 103, Department of Microsystems Engineering, IMTEK, University of Freiburg, Freiburg, Germany. Fax ; vstetten@imtek.de. ジャーナルクラブメディエータープローブ PCR: ラベルフリープライマリープローブと標準化されたセカンダリーユニバーサル蛍光レポーターを基盤としたリアルタイム PCR 検出の新しいアプローチ要旨研究背景大多数の確立されたモニタリング PCR 増幅技術は個々のターゲット特異的蛍光プローブで構成されている無数の異なったターゲット解析においてこれらのプローブの合成はアッセイの開発全体のコストに関わっているシークエンスに依存したユニバーサル検出技術はこの欠点を克服しているが非特異的増幅産物を検出しがちである我々はこれらの問題を解決したメディエータープローブによる PCR 法を開発した方法ターゲット特異的領域と標準化されたメディエータータグを含んでいるラベルフリーシークエンス特異的プライマリープローブ ( メディエータープローブ ) の1セットはポリメラーゼ 5 ヌクレアーゼ活性によってそのターゲットシークエンスをアニーリングの際に開裂させるメディエーターの放出は補完する蛍光レポータープローブの開裂によってシグナル発生を引き起こす結果ヒトのパピロマウイルス 18(HPV18) 黄色ブドウ球菌大腸菌ホモサピエンス DNA 希釈シリーズのリアルタイム PCR 増幅は新規メディエータープローブ (r2 = ) か最新鋭の加水分解プローブ ( タグマンプローブ )(r2 = ) のどちらかによって検出されるときに非常に優れた直線性を示した HPV18DNA の増幅に関して検出限界はメディエータープローブと加水分解プローブで解析されると 10μL の反応液に対して各々 78.3 と 85.1 コピーであった HPV18 ターゲット DNA の二本鎖増幅と内部標準はメディエータープローブ PCR (r2 = 0.998) か加水分解 PCR(r2 = 0.988) のどちらかで定量化されるときターゲットコピー数の逆算に影響を与えなかった結論メディエータープローブ PCR は加水分解 PCR と同等の性能を持ちユニバーサル蛍光レポーターの使用によってコストを削減させることになった本文核酸増幅のモニタリングは患者検体中に持ち込まれる病原体の遺伝子型の識別と精確な定量を可能にした臨床 1

2 診断分野における必須のツールである (1,2) 様々な増幅技術において挿入染料(3) と変性オリゴヌクレオチドのような蛍光分子は最少量の核酸の検出を可能にする挿入染料はコスト効率が高いけれどもそれらは非特異的副産物を検出し偽陽性の結果を導くかもしれない (5) それにひきかえ蛍光オリゴヌクレオチドはシークエンス特異性に長所を持つがより高い合成コストに短所も持っているそれ故に低コストでシークエンス特異性と結合する増幅のリアルタイム検出のための万能な方法が必要とされる現在までに多くのそのようなシークエンス依存的ユニバーサル検出技術が提案されている (6-14) 一般的にこれらの方法は様々な異なったアッセイにとって唯一 1 つの蛍光プローブで柔軟なアッセイデザインを認めているこれらのシークエンス依存的ユニバーサル検出技術のアプリケーションはシークエンス特異的蛍光プローブの使用よりもコスト効率が高いけれどもこれらの技術はまだ大きな欠点に悩まされている相互性のプライマーを使用することで (6-12) プライマーの二量体と同様の非特異的増幅産物がまだ検出されるさらに温度の増減によるサーモサイクリングプロフィールの修正は低下した分析感度もしくはミスプライミングと副反応によって引き起こされる非特異的副産物の増加を引き起こすかもしれない (7) 分析特性はプローブを基盤としたシステムの使用によって上昇させることができるが (14) 好ましくないシングルプレックス反応の制限は臨床的な診断で必要とされるマルチプレックスの要求と対立する (16) 上記に記述された要求を満たすために我々はメディエータープローブ PCR と呼ばれる新規の技術を開発した材料と方法メディエータープローブ (MP)-PCR の原理を図 1 に示すターゲット DNA の PCR 増幅は通常のオリゴヌクレオチドプライマーとサーマスアクアチクスポリメラーゼで成し遂げられるシークエンス特異的リアルタイム検出は二官能性オリゴヌクレオチドターゲットシークエンスと相互作用して開裂される MP によって実現されその後セカンドオリゴヌクレオチド蛍光ユニバーサルレポーター (UR) の活性化を開始する開裂と活性化はポリメラーゼによって触媒されている必要とされるオリゴヌクレオチド二官能性 MP はターゲットと相互補完的であるプローブとして指定される 3 領域を持ち一方メディエーターとして指定された 5 領域は一般的にどんな予期されるターゲットシークエンスとも補完性がないデザイン化したシークエンスタグである UR は自己完結型ターゲット非依存的シグナリングオリゴヌクレオチドとして作用するそれは U 字型セカンダリー構造を示しステムの反対側により接近してフルオロファとクエンチャーがあるこの配列は付属部分の間で効果的な蛍光共鳴エネルギー移動を可能にする (17) その対になっていない 3 ステムはメディエーターのシークエンスと補完的であるメディエーターハイブリダイゼーション域が存在する Table 1. List of oligonucleotide sequences.a Target Description Sequence (5 3 ) Modification 5 3 nt Length, Reference CCG CAG * A * A * G Universal reporter 01 b,c ATG AGA TC(dT-FAM) GCG GTG TTG GTC DABCYL C 6 NH 2 67 This work 2

3 GTA GAG CCC AGA ACG ATT TTT TTT TTT TTT TTT TTT T CCG CAG * A * A * G Universal reporter 02 b,c ATG AGA TC(dT-Cy5) BHQ-2 C 6 NH 2 67 This work GCG GTG TTC ACT GAC CGA ACT GGA GCA TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT T E. coli K12 peptidoglycan-associated lipoprotein (pal gene), GenBank accession no. X05123 Forward primer GGC AAT TGC GGC ATG TTC TTC C Reverse primer TGT TGC ATT TGC AGA CGA GCC T 22 ATG CGA ACG GCG Hydrolysis probe GCA ACG GCA ACA 6-FAM BHQ-1 27 TGT AAA TCG TTC TGG GCT CTA CGC GAA CGG CGG CAA CGG PH 44 This work Mediator probed CAA CAT GT S. aureus exfoliative toxin B, GenBank accession no. AP Forward primer AGA TGC ACG TAC TGC TGA AAT GAG AAT AAA GTA CGG Reverse primer ATC AAC AGC TAA 26 AC Hydrolysis probe CCG CCT ACT CCT GGA CCA GG 6-FAM BBQ 20 AAA TCG TTC TGG GCT CTA CGG TAT TCA CAG TGG TAA PH 48 This work Mediator probed AGG CGG ACA ACA HPV18, GenBank accession no. NC_ Forward primer GCT GGC AGC TCT AGA TTA TTA ACT G 25 GenoID Reverse primer GGT CAG GTA ACT GCA CCC TAA 21 Hydrolysis probe GGT TCC TGC AGG TGG TGG CA 6-FAM BHQ

4 AAA TCG TTC TGG GCT CTA CGG TTC CTG CAG GTG GTG PH 39 This work Mediator probed GCA H. sapiens ACTB, GenBank accession no. AC_ /HGNC:132 Forward primer TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A Reverse primer CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G 25 ATG CCC TCC CCC Hydrolysis probe 01 ATG CCA TCC TGC 6-FAM DDQ-1 26 GT ATG CCC TCC CCC Hydrolysis probe 02 ATG CCA TCC TGC Cy5 DDQ-2 26 GT AAA TCG TTC TGG GCT CTA CGC CCT CCC CCA TGC CAT PH 47 This work Mediator probe 01d CCT GCG T ATG CTC CAG TTC GGT CAG TGC CCT CCC CCA TGC CAT PH 47 This work Mediator probe 02d CCT GCG T 反応スキーム MP PCR の経過中ターゲット増幅と検出が協奏反応中に同時に起こる変性ステップにおいて DNA 鋳型 (Fig. 1A) は一本鎖に分かれる (Fig. 1B) アニーリング温度に冷却中プライマーと MP がターゲット DNA にハイブリダイズする MPの 5 領域 ( 例えばメディエーター部分 ) はターゲットにハイブリダイズしないことは特筆すべきことでこの場所は結果としてフラップ構造になる (Fig. 1C) プライマー伸長において MP の 5 フラップはポリメラーゼのヌクレアーゼ領域を通り抜け開裂される (18 21) 遊離したフラグメントはメディエーターとして参照され 3 -OH を示す MP( 例えばプローブ部分 ) の 3 領域は新生核酸鎖の伸長中に消化する各々のターゲット分子の複製で 1 メディエーターがバルク溶液に放出される (Fig. 1D) 続いて活性化されたメディエーターが UR に拡散しメディエーターハイブリダイゼーション領域によって捕獲される (Fig. 1E) ポリメラーゼはメディエーターの 3 末端を伸長し (Fig. 1F) 結果として蛍光発光するシグナル発生のための 2 つの経路が提案されるポリメラーゼの 5 ヌクレアーゼ活性のために UR の 5 末端は分解されクエンチャー部分が切断される (Fig. 1G) いくつかのケースにおいてポリメラーゼはステムデュプレックスを不安定化し 5 末端の消化なしでヘアピン構造を展開する (Fig. 1H) 両方の経路は最終的に impeded FRET によってフルオロファの発光を導き蛍光放射が各々連続的な増幅サイクルで蓄積する両方の経路は並行して起こるなぜならば Taq ポリメラーゼは異なったレベルのエキソヌクレアーゼ活性 (22) を持つことが知られており 5 末端の部分的な消化だけでヘアピン構造を解離するかもしれない (23) 4

5 その反応スキームは構造的に連続侵襲的シグナル増幅反応 [SISAR, Invader Squared (13)] と関連しているけれども MP PCR はターゲット増幅から恩恵を受けターゲット検体の分析的高感度検出を可能にするさらに SISAR はもっぱら核酸分解活性を基盤とし一方 MP PCR のシグナル発生は Taq ポリメラーゼのポリメリゼーションと核酸分解活性の両方を必要とする SISAR と対照的に未開裂の MP とその UR のハイブリダイゼーションは伸長も構造特異的開裂も認めず非特異的シグナル発生を防ぐまたミスプライムされた増幅産物は検出されないなぜならば MP はこれらのコンストラクトにハイブリダイズされないからであるこれは偽陽性の結果を回避する MP PCR は異なったフルオロファを持った 2 UR によってヂュプレックス PCR を検出する能力を持つこの観点において MP PCR は最先端の技術に匹敵する (24 26) サンプル材料全構造ヒトパピロマウイルス 18(HPV18) ゲノムを含む pbr322 プラスミドは GenoID (Budapest, Hungary) によって提供された黄色ブドウ球菌 DNA サンプルは Genomic Research Laboratory (Prof. Jacques Schrenzel, Geneva, Switzerland) から入手しゲノム遺伝子座剥離性トキシン B が含まれていた (GenBank accession number AP003088) ゲノム遺伝子座ペプチドグリカンに関連したリポ蛋白を含む大腸菌 K12 DH5αZ1 DNA (27) はマグネットビーズをベースにした DNA 単離キット (AJ Innuscreen) を用いて単離されたヒトゲノム DNA は QIAamp DNA Blood ミニキットを用いて全血から単離されたデュプレックス PCR 反応ではコマーシャルベースの有用なヒト DNA (Roche Diagnostics) が使用された DNA サンプルは 0.2 Tris-EDTA 緩衝液で希釈された我々は反応チューブへのターゲット DNA の非特異的吸収を防ぐために 10 ng/μl サケ精子 DNA をその希釈緩衝液に添加したオリゴヌクレオチドこの研究で使用されたオリゴヌクレオチドは表 1 にリストするプライマーと加水分解プローブは先行研究に従ってオーダーされるか MP PCR の実現可能性を示す目的でこの研究で設計されるかであった HPV18 増幅におけるオリゴヌクレオチドは GenoID (Budapest, Hungary) の厚意で提供されたすべての修正オリゴヌクレオチドは HPLC によって精製されたメディエータープローブの設計 MP 設計は 2 段階であるプローブ (3 領域 ) とメディエーター (5 領域 ) 領域は各々それらの 5 と 3 末端で 1 ヌクレオチドによって重複するそれ故にそのプローブの 5 末端ヌクレオチドはそのメディエーターの 3 末端ヌクレオチドと一致していなければならない我々のアッセイにおいてグアノシンヌクレオチドは必要としそのメディエーターのシークエンスに基づいているプローブ領域は加水分解プローブの設計 ( レングス :25-30nt T m primer よりも高いプローブ溶解温度 (T m probe ) 5 10 C)(31) で推奨されたガイドラインに従って設計された妥当な場合品質管理された加水分解プローブのシークエンスが使用されるであろうそのメディエーターは標的にホモロジーを示さないように仕組まれたシークエンスストレッチであった ( 長さ : nt, T m mediator はおおよそ T m primer 同じであった ) ( この論文のオンライン版に添付する補足データを表 1 に示す ) MP の伸長を防ぐために 3 末端をリン酸基でブロックされた UR 設計 UR オリゴヌクレオチド (Table 1) はコンピューターで設計されて不対 1 本鎖 3 ステムを持ったヘアピン型構造を取得す 5

6 る二次構造予測は RNA ホールドを使って成し遂げられ Tm 決定は VisOMP (Visual Oligonucleotide Modeling Program) で計算された (33) 二次構造分析において未ダングリングエンドエネルギー DNA セッティング 60 はデフォルトセッティングと対照的にアドバンスホールディングオプションで適用されたそのステム (GC 含量 71%) の Tm は 71.4 で各サーモサイクル内で 60 に冷却段階中にリホールディングさせるホールドされた構造は各ステム鎖内で近接した FRET 対を供給する 5 末端クエンチャーと内部フルオロファから成る FRET 対 (Table 1) は潜在的に高い消光効果を獲得するために選択されている 3 不対ステム (45 nt) はメディエーターハイブリダイゼーション部を含んでメディエーターシークエンスに逆相補的であった UR の伸長を防ぐために 3 末端は 1 つのアミノ基でブロックされたデュプレックス PCR 研究においてセカンド UR は修正されたメディエーターハイブリダイゼーション部と FRET 対を除いて同一シークエンスで設計された (Table 1) 蛍光消光の効率妥当なフルオロファ染料とクエンチャー部分の選択は高い消光効率と分析的に微量の核酸を感知できる検出を基本とした (34) 各 2 重ラベルした加水分解プローブと UR 分子の消光効率 (E q ) を決定するために蛍光発光は DNAase I 処理の有り無しで獲得された ( オンライン補足図 1 参照 ) E q は以下のように定義される I undigested は未消化サンプルの蛍光発光で I digested は DNase I で処理されたサンプルの蛍光発光である MP PCR と加水分解プローブ PCR アッセイ MP PCR 反応は 1 PCR 緩衝液 (GenoID, Budapest, Hungary) 0.1 U/μL HotStarTaq+ ポリメラーゼ (Qiagen) 200 μ mol/l デオキシリボヌクレオチド (Qiagen) 300 nmol/l UR (synthesis by IBA) 300 nmol/l ターゲット特異的プライマー対 200 nmol/l MP (synthesis by biomers.net) からなった加水分解プローブ PCR 反応は MP が加水分解プローブ (200 nmol/l; synthesis by biomers.net) に置き換えられた以外は同量のリストに挙げられた試薬からなり UR は添加されなかった可能なら DNA 鋳型が添加され同量の脱イオン水によって NTC に平衡化された反応量は 10 μl であったすべてのリアルタイム PCR 反応は以下のようなユニバーサルサーモサイクルを持つ Corbett Rotor-Gene 6000 (Corbett Research Pty., now Qiagen GmbH) で行われた ;95 5 分間の開始ポリメラーゼ活性化秒間の変性の 45 サイクル他に提示されていないならば秒間での結合されたアニーリングと伸長ステップ蛍光シグナルは各伸長ステップの最後に獲得されたデータ解析は Rotor-Gene 6000 software (version ) で行われた Table 2. Overview of calculated copy numbers.a Target Input copy number, n Mediator probe PCR Output, SD % CV n Hydrolysis probe PCR Output, SD % CV n a

7 E. coli pal S. aureus ExfB H. sapiens ACTB Coamplification HPV18 L

8 H. sapiens ACTB b C q : 33.0 ±0.5 C q : 31.8 ±0.4 統計分析 HPV18 検出における検出限界は様々な DNA 濃度 (10 4, 10 3, , 10 2, , 10 1, 10 0, and 10 1 コピー / 反応 ) と NTC を 10 回反復増幅することによって決定された DNA 濃度毎のポジティブ増幅のフラクションが測定された SPSS(Statistical Package for Social Sciences, version 19; IBM) を使ったプロビット解析は 95% 確率でポジティブ増幅を得た反応毎のコピー数を予測させた (35) 結果蛍光消光効率すべての蛍光分子の蛍光発光は未消化プローブと比較して崩壊を増加した特異的加水分解プローブの観測された E q 値は 54.5% (3.1%) [Cy5/2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone 2 (DDQ-2)] から 92.7% (0.5%) [FAM/di-tert-butylhydroquinone 1 (BHQ-1)] の範囲であった UR の消光効率は 83.7% (1.4%) (Cy5/BHQ-2) and 90.9% (0.4%) (FAM/Dabcyl) であった ( オンライン補足図 1 参照 ) これらの結果は報告されている最適条件下で観測された FAM/Dabcyl (80% 91%) FAM/BHQ-1 (88% 93%) Cy5/BHQ-2 (91% 96%) の E q 値と一致している (34) メディエータープローブ PCR と加水分解プローブ PCR モデルアッセイ系にて MP PCR の性能は加水分解プローブ PCR と比較された初めに反応効率 LOD アッセイ間変動アッセイ内変動デュプレックス能力が解析されたこれらの実験において様々な濃度の HPV18 DNA ( 他に記載がなければ 10 2, 10 3, 10 4, 10 5, 10 6 コピー / 反応 ) は両方の技術を同時に使用することで増幅された次に異なったターゲットが両方の技術を同時に使用することで増幅された検出限界 LOD は DNA 濃度が 95% の確立で陽性と判断したときに決定されたプロビット解析は MP PCR において 78.3 コピー / 反応 (95% 信頼区間 : コピー / 反応 ) 加水分解プローブ PCR おいて 85.1 コピー / 反応 (95% 信頼区間 : コピー / 反応 ) の分析的感度を算出した (Fig. 2A) アッセイ内不正確さ 5 つの濃度の HPV18 DNA 希釈系列 (10 2, 10 3, 10 4, 10 5, 10 6 コピー / 反応 ) は 8 複製で増幅された MP PCR の r 2 値は加水分解プローブ PCR の r 2 値はと極めて良い直線性を示した (Fig. 2B) 反応あたりコピーの増幅での CV% は 55.1% 9.9% (MP PCR) 38.3% 10.7% ( 加水分解プローブ PCR) であった精度は +21.6% から 8.1% (MP PCR) +19.4% から 9.8% ( 加水分解プローブ PCR) の範囲であった詳細はオンライン補足表 2 に表記されているアッセイ間不正確さ反応混合物の 5 つに調整されたバッチは 5 つの濃度の HPV18 DNA 希釈系列 (10 2, 10 3, 10 4, 10 5, 10 6 コピー / 反応 ) の増幅で使用された各濃度は 3 倍増幅された増幅の直線性は MP PCR (r 2 = 0.940) と加水分解プローブ PCR(r 2 = 8

9 0.954) で示された (Fig. 2C) コピー / 反応のアッセイ間不正確さは 25.0% から 8.7% (MP PCR) 34.7% から 12.7% ( 加水分解プローブ PCR) の範囲であった精度はコピー / 反応あたり +3.4% から 7.0% (MP PCR) 2.0% から 12.4% ( 加水分解プローブ PCR) の範囲であった詳細はオンライン補足表 3 に表記されている 2 倍増幅あるモデルアッセイにおいてプラスミド (10 2, 10 3, 10 4, 10 5,10 6 開始コピー ) を含んでいる HPV18DNA フラグメントは 300 コピーのヒトゲノムとともに共増幅された個々の反応は 3 倍で行われた HPV18 の加水分解プローブは FAM/BHQ-1 でラベルされアクチンベータ (ACTB) 5 のプローブは Cy5/DDQ-2 でラベルされた UR のデュプレックス PCR において UR01 は FAM/Dabcyl でラベルされ UR02 は Cy5/BHQ-2 対を保有している Fig. 2D は MP PCR(r 2 = 0.998) と加水分解プローブ PCR(r 2 = 0.988) において異なった DNA 濃度以上で HPV18 増幅の直線性を示している ACTB の逆算は有効ではなかったなぜならば 1 つの濃度だけ 2 倍アッセイで増幅されたからであるしかしながら定量化サイクル (C q ) 値は MP PCR と加水分解プローブ PCR の両方におけるレッドチャンネルにおいて 0.02 までの閾値を設定することで得られた共増幅された ACTB と HPV18 DNA サンプルの平均 C q 値は MP PCR が 33.0(0.5) 加水分解プローブ PCR が 31.8(0.4) であった異なったターゲットに対する MP PCR と加水分解プローブ PCR の応用 MP PCR の普遍的な性質は 4 つの臨床的に関連のあるターゲットでの使用によって明らかにされたちなみに加水分解プローブ PCR は並行して各ターゲットに対して行われたインプットと逆算されたアウトプットコピー数の直線性は各ターゲットと増幅技術に対して決定された (Fig. 3) ヒトパピロマウイルス-18 L1(HPV18 L1) 遺伝子 (MP PCR r 2 = 0.999/ 加水分解プローブ PCR r 2 = 0.975) 黄色ブドウ球菌剥離性トキシン B 遺伝子 (S. aureus ExfB)(0.991/0.988) 大腸菌ペプチドグリカン関連リポ蛋白 (E. coli pal) 遺伝子 (0.996/0.988) ヒトβアクチン遺伝子(0.991/0.993) の一連の希釈系列の検出に対する結果は MP PCR とすでに確立された加水分解プローブ PCR の間に高い同等性を示した (Table 2). 図 1. MP PCR の略図 9

10 図 2. MP PCR と加水分解プローブ PCR の比較評価図 3. MP PCR と加水分解プローブ PCR による異なったターゲットの増幅 10

11 考察われわれのアッセイの際立った特徴は増幅と蛍光検出の分離を行い標準化された UR オリゴヌクレオチドの使用を可能にしたことであるメディエーターと UR のシークエンスはコンピューター内で設計され BLAST サーチに従ってどんなターゲットに対しても同一ではないことを示した ( オンライン補足表 1 参照 ) UR はヘアピン型二次構造を採用することで効率的な FRET クエンチングのための最適な条件を提供する [>90% (FAM/Dabcyl), >80% (Cy5/BHQ-2)] われわれは以下のように UR01 を再設計した : 5 -CACGCG*A*A*GATGAGATCGCG(dT-Cy5)GTGTTGGTCGTAGAGCCCAGAACGA-3, 5 が BHQ-2 3 が C3 スペイサーアスタリクスはホスホチオエイトを示す新しい UR01 は改善した消光効率を持つ [ 平均 ( 標準偏差 ), 98.87% (0.46%)] より良い開始クエンチングは感度が増加し MP PCR の結果を改善するヘアピン構造内のフルオロファとクエンチャーの近接は結果として高感度で一定の消光効率となる開始バックグランドシグナルの非常に強い抑制はどんな PCR アッセイにおいても分析的に精度が高いターゲット検出にとって望ましいことであるわれわれの成果と対照的に FAM でラベルされた最新鋭の加水分解プローブは様々な消光効率を蛍光ドナーとアクセプターの間の様々な消光部分と FRET 距離を逸脱することで 60% から 93% の範囲で現れる Cy5/DDQ-2 でラベルされた加水分解プローブは 55% という低い E q 値を示した HPV18DNA の増幅は新規の MP PCR と核酸分析のゴールデンスタンダードである加水分解プローブ PCR と比較するモデルアッセイとして選択された両技術の LOD はプロビット解析で決定され両方法は同等であった (MP PCR: 78.3 加水分解プローブ PCR:85.1 コピー / 反応 ) アッセイ内とアッセイ間の不正確さは数桁以上の信頼できる定量化を示すことで反応あたり 10 2 から 10 6 コピー内であった (MP PCR 25.0% 8.7%, 55.1% 9.9%; 加水分解プローブ PCR 34.7% 12.7%, 38.3% 10.7%) 50 から 60 の異なった PCR アッセイでの伸長時間を短縮することは定量化の妥当性に影響を与えない ( オンライン補足データの図 1 参照 ) これらの成果は MP PCR が最近のリアルタイムサーモサイクラーで成し遂げられる迅速サイクリングプロトコールに適していることを示している異なったメディエーターハイブリダイゼーションシークエンスと FRET 修正による 2 つの UR が設計されたこれらのレポーターは日常的な診断もしくはアッセイ開発においてコスト削減の高い可能性と結びついていくつかのターゲット遺伝子の 2 重の検知をするべきであろう様々な量の HPV18DNA( ターゲット ) と内部コントロールの一定のコピー数 (ACTB) の共増幅がうまく証明されたそのアッセイは異なったラベル化した加水分解プローブで成し遂げられたターゲット遺伝子増幅は 5 桁以上の直線性であり ( 両方法とも r 2 = 0.998) さらに高い濃度は内部コントロールのモニタリングに影響を与えなかったさらに新規の MP PCR の広い用途を証明するために 4 つのターゲットが MP PCR か最新鋭の加水分解プローブ PCR アッセイのどちらかで増幅された HPV18 黄色ブドウ球菌大腸菌ホモサピエンスのターゲット遺伝子が選択された逆計算された出力コピー数は入力コピー数と高い一致を示した (MP PCR r 2 = ; 加水分解プローブ PCR r 2 = ) これらのターゲットの増幅はマルチプルアッセイを通じた新規の蛍光 UR のレイアウトのみでモニターされ一方で個々のコストが大きく 2 倍に修正された加水分解プローブはターゲット毎に使用されなければならなかったすべての分析プロトコール中の同じ蛍光 UR の使用はすべての反応ウエル中の一定の最初のバックグラウンド蛍光発光を導くこの特徴は様々な消光効果をもつ加水分解プローブで典型的にみられる際の生じるシグナルの過小過大評価なしに同じ実行内での異なったターゲットの蛍光モニタリングを認める分析されたすべてのターゲットにおいて 11

12 各々のターゲット毎の一貫性のある試薬濃度とユニバーサル 2 ステップサーモサイクリングプロトコールが採用されることで簡単なアッセイデザインと使いやすさとなる MP PCR は事実上どんなターゲット DNA のリアルタイム検出に使うことができるシングル UR レイアウトのみを必要とするそれ故にこのレポーターは一般的に使用されている加水分解プローブのような個別のシークエンス特異的蛍光プローブで可能にするよりもより大きなバッチでユニット毎でより低価格で合成されるべきであるその一方 MP PCR では実際のシークエンス特異的 MP はラベルフリーでラベルされたプローブよりも低価格で合成できる特に小バッチサイズが必要とされる場合でコストの見積りは個々の地方でのディスカウントに依存している 1 つの例として国際的サプライヤーのコスト評価は 2 重ラベルされた加水分解プローブあたり MP あたり $55 UR あたり $600( 同一の合成スケールでのカタログ価格 ) を公開した結果として 8 個の加水分解プローブの 1 セットは $1960 かかった 1UR と 8MP の 1 セットは約 $1400 であったこの計算はすべての反応で必要とされるより高い注文数量の UR を考慮している私たちは MP PCR がユニバーサルシークエンス特異的核酸検出にとって非常に優れた位置を得ており非特異的増幅産物の検出変更されたサーモサイクリング条件もしくは専用試薬のような既存のユニバーサル核酸試験方法の落とし穴を克服していると信じている MP PCR は将来的には分子診断の用途を持つかもしれない例えば対立遺伝子特異的な MP と結合した 2UR の 1 セットは高い柔軟な変異検出スクリーニングもしくは塩基変異多型の広範囲タイピングに関連しているかもしれない MP のコンセプトは手頃な費用で一定の検出条件下で柔軟なアッセイデザインの範囲を広げることが可能なことである ( 翻訳者 ; 小治健太郎 ) Acknowledgments The authors acknowledge Jacques Schrenzel and Patrice Francois, GBRL Geneva, for providing S. aureus DNA samples. We also thank Csaba Jeney, GenoID, Budapest, for providing PCR buffer, HPV18 DNA samples, and corresponding oligonucleotide sequences. Stefanie Reinbold and Lucas Dreesen are gratefully acknowledged for technical assistance and Mark Karle is thanked for E. coli cultivation and DNA isolation. Footnotes 4 Nonstandard abbreviations: MP, mediator probe; UR, universal reporter; FRET, fluorescence resonance energy transfer; SISAR, serial invasive signal amplification reaction; HPV18, human papillomavirus 18; Tm, melting temperature; Eq, efficiency of quenching; LOD, limit of detection; DDQ, 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone; BHQ, di-tert-butylhydroquinone; Cq, cycle of quantification. 5 Genes: ACTB, actin, beta; HPV18 L1, human papilloma virus-18 L1; S. aureus ExfB, Staphylococcus aureus exfoliative toxin B; E. coli pal, 12

13 Escherichia coli peptidoglycan-associated lipoprotein. (see editorial on page 1505) Author Contributions: All authors confirmed they have contributed to the intellectual content of this paper and have met the following 3 requirements: (a) significant contributions to the conception and design, acquisition of data, or analysis and interpretation of data; (b) drafting or revising the article for intellectual content; and (c) final approval of the published article. Authors' Disclosures or Potential Conflicts of Interest: Upon manuscript submission, all authors completed the author disclosure form. Disclosures and/or potential conflicts of interest: Employment or Leadership: None declared. Consultant or Advisory Role: None declared. Stock Ownership: None declared. Honoraria: None declared. Research Funding: EU FP7 project AutoCast (no ) to consortium partner University Freiburg. Expert Testimony: None declared. Patents: B. Faltin, DE ; S. Wadle, DE ; G. Roth, DE ; F. von Stetten, DE Role of Sponsor: No sponsor was declared. Received for publication April 24, Accepted for publication July 27, The American Association for Clinical Chemistry References 1. Kaltenboeck B, Wang CM. Adv in real-time PCR: Application to clinical laboratory diagnostics. Adv Clin Chem 2005;40: Mackay IM, Arden KE, Nitsche A. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res 2002;30: Gudnason H, Dufva M, Bang DD, Wolff A. Comparison of multiple DNA dyes for real-time PCR: effects of dye concentration and sequence composition on DNA amplification and melting temperature. Nucl Acid Res 2007; Juskowiak B. Nucleic acid-based fluorescent probes and their analytical potential. Anal Bioanal Chem 2011;399: Ririe KM, Rasmussen RP, Wittwer CT. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Anal Biochem 1997;245: Li XM, Huang Y, Guan Y, Zhao MP, Li YZ. Universal molecular beacon-based tracer system for real-time polymerase chain reaction. Anal Chem 2006;78: Moser MJ, Marshall DJ, Grenier JK, Kieffer CD, Killeen AA, Ptacin JL, et al. Exploiting the enzymatic recognition of an unnatural base pair to develop a universal genetic analysis system. Clin Chem 2003;49: Nuovo GJ, Hohman RJ, Nardone GA, Nazarenko IA. In situ amplification using universal energy transfer-labeled primers. J Histochem Cytochem 1999;47: Rickert AM, Lehrach H, Sperling S. Multiplexed real-time PCR using universal reporters. Clin Chem 2004;50: Whitcombe D, Brownie J, Gillard HL, McKechnie D, Theaker J, Newton CR, Little S. A homogeneous fluorescence 13

14 assay for PCR amplicons: its application to real-time, single-tube genotyping. Clin Chem 1998;44: Yang LT, Liang WQ, Jiang LX, Li WQ, Cao W, Wilson ZA, Zhang DB. A novel universal real-time PCR system using the attached universal duplex probes for quantitative analysis of nucleic acids. BMC Mol Biol 2008; Zhang YL, Zhang DB, Li WQ, Chen JQ, Peng YF, Cao W. A novel real-time quantitative PCR method using attached universal template probe. Nucl Acid Res 2003; Hall JG, Eis PS, Law SM, Reynaldo LP, Prudent JR, Marshall DJ, et al. Sensitive detection of DNA polymorphisms by the serial invasive signal amplification reaction. Proc Nat Acad Sci USA 2000;97: Tani H, Miyata R, Ichikawa K, Morishita S, Kurata S, Nakamura K, et al. Universal quenching probe system: flexible, specific, and cost-effective real-time polymerase chain reaction method. Anal Chem 2009;81: Li XM, Huang Y, Song C, Zhao MP, Li YZ. Several concerns about the primer design in the universal molecular beacon real-time PCR assay and its application in HBV DNA detection. Anal Bioanal Chem 2007;388: Elnifro EM, Ashshi AM, Cooper RJ, Klapper PE. Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology. Clin Microbiol Rev 2000;13: Didenko VV. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. Biotechniques 2001;31: , 1118, Holland PM, Abramson RD, Watson R, Gelfand DH. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5 3 exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA 1991;88: Longley MJ, Bennett SE, Mosbaugh DW. Characterization of the 5 to 3 exonuclease associated with Thermus-Aquaticus DNA-Polymerase. Nucl Acid Res 1990;18: Lyamichev V, Brow MA, Dahlberg JE. Structure-specific endonucleolytic cleavage of nucleic acids by eubacterial DNA polymerases. Science 1993;260: Lyamichev VI, Brow MAD, Varvel VE, Dahlberg JE. Comparison of the 5 nuclease activities of Taq DNA polymerase and its isolated nuclease domain. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96: Kreuzer KA, Bohn A, Lass U, Peters UR, Schmidt CA. Influence of DNA polymerases on quantitative PCR results using TaqMan (TM) probe format in the LightCycler (TM) instrument. Mol Cell Probes 2000;14: Kutyavin IV. New approach to real-time nucleic acids detection: folding polymerase chain reaction amplicons into a secondary structure to improve cleavage of Forster resonance energy transfer probes in 5 -nuclease assays. Nucl Acid Res 2010; Koppel R, Zimmerli F, Breitenmoser A. Heptaplex real-time PCR for the identification and quantification of DNA from beef, pork, chicken, turkey, horse meat, sheep (mutton) and goat. Eur Food Res Technol 2009;230: Lee LG, Livak KJ, Mullah B, Graham RJ, Vinayak RS, Woudenberg TM. Seven-color, homogeneous detection of six PCR products. Biotechniques 1999;27: Richardson JA, Gerowska M, Shelbourne M, French D, Brown T. Six-colour HyBeacon probes for multiplex genetic analysis. Chembiochem 2010;11: Lutz R, Bujard H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I-1-I-2 regulatory elements. Nucl Acid Res 1997;25: Francois P, Harbarth S, Huyghe A, Renzi G, Bento M, Gervaix A, et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Geneva, Switzerland, Emerg Infect Dis 2008;14:

15 29. Karle M, Miwa J, Czilwik G, Auwärter V, Roth G, Zengerle R, von Stetten F. Continuous microfluidic DNA extraction using phase-transfer magnetophoresis. Lab Chip 2010;10: Tezak Z, Hoffman EP, Lutz JL, Fedczyna TO, Stephan D, Bremer EG, et al. Gene expression profiling in DQA1*0501(+) children with untreated dermatomyositis: a novel model of pathogenesis. J Immunol 2002;168: Lie YS, Petropoulos CJ. Advances in quantitative PCR technology: 5 nuclease assays. Curr Opin Biotechnol 1998;9: Gruber AR, Lorenz R, Bernhart SH, Neuboock R, Hofacker IL. The Vienna RNA websuite. Nucl Acid Res 2008;36:W SantaLucia J Jr.. Physical principles and visual-omp software for optimal PCR design. Meth Mol Biol 2007;402: Marras SAE, Kramer FR, Tyagi S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucl Acids Res 2002;30:e Smieja M, Mahony JB, Goldsmith CH, Chong S, Petrich A, Chernesky M. Replicate PCR testing and probit analysis for detection and quantitation of Chlamydia pneumoniae in clinical specimens. J Clin Microbiol 2001;39:

2

2 3 4 TTT TCT TAT TGT TTC TCC TAC TGC TTA TCA TAA TGA TTG TCG TAG TGG CTT CCT CAT CGT CTC CCC CAC CGC CTA CCA CAA CGA CTG CCG CAG CGG ATT ACT AAT AGT ATC ACC AAC AGC ATA ACA AAA AGA ATG ACG AAG AGG GTT