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せとかうるしはた
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1 公開平成 19 年 1 月 6 日 ( 土 ) 糖鎖エンジニアリングプロジェクト事後評価資料研究開発項目 2 糖鎖糖鎖複合体合成技術の開発西村紳一郎 ( 産業技術総合研究所創薬シーズ探索研究ラボ ) 研究項目と担当機関事業原簿 P57 研究開発項目 2 糖鎖糖鎖複合体合成技術の開発研究項目 1. 糖鎖糖鎖複合体合成技術の開発 1.1 糖鎖自動合成装置設計開発糖鎖自動合成装置の設計試作反応生成物の精製装置の開発迅速モニタリング手法の開発共糖鎖自動合成装置におる反応モニタリング技術の開発再糖鎖自動合成装置に関わるモニタリング技術開発 : 水晶発振子マイクロバランス法再 - 結合型蛋白質糖鎖の合成磁性ビーズを用いた固定化糖転移酵素の開発 1.2 糖転移酵素開発供給系の開発可溶型糖転移酵素群の供給系の開発酵母菌体固定化糖転移酵素の供給系の開発糖ヌクレオチド供給系および糖ペプチド合成系の構築共シアル酸転移酵素群の耐熱型酵素の開発 1.3 プライマーの開発オリゴ糖用プライマー開発糖ペプチド用プライマー開発共機能性リンカーを有するプライマーの設計と合成 1.4 統合研究ヌクレオチドを基準とした糖転移反応簡易モニタリングシステムの開発糖鎖自動合成装置とペプチド自動合成装置によるハイスループット糖ペプチド合成システムの構築担当機関産総研 ( 西村グループ ) 産総研 ( 西村グループ ) 北大 ( 共研 ) 東工大 ( 再委託 ) 東海大 ( 再委託 ) 産総研産総研 ( 地神グループ ) お茶大 / 東海大 ( 共研 ) 産総研 ( 西村グループ ) 東海大 ( 共研 ) 産総研 ( 西村グループ ) 1

2 事業原簿 P57 開発項目 1-2 糖転移酵素開発における研究成果の要約 54 種のヒト糖転移酵素を酵母細胞壁の固定化酵素として発現 41 種で酵素活性を確認 23 酵素は糖鎖合成に利用可能な活性を示した糖転移酵素発現量の増加酵素活性の強化に関与する諸因子の発見培地 p の調整 PIR アンカーの選択 PIR1<PIR4 PIR3 PIR アンカーの組合せ PIR1+PIR3<PIR1 PIR3 分子シャペロンの導入 S-S 結合の掛け替え促進による酵素タンパク質生産量の増加酵母型糖鎖の除去糖転移酵素群エントリー候補発現活性確認クローン FucT SiaT ppgalact GalT, GalAcT GnT 合計酵母で発現させた 41 種類のヒト糖転移酵素で活性を確認 75% 以上の成功率で活性発現に成功研究開発の具体的内容達成目標事業原簿 P57 研究開発の具体的内容天然型の糖鎖構造を持った糖鎖あるいは糖タンパク質糖ペプチドを多種類研究開発項目 1 の解析に必要な量を合成しライブラリー化を可能とする方法論や自動合成システムの開発を行う (a) - 結合型糖鎖 - 結合型糖鎖合成の双方に供することが可能なシステムの開発を行う (b) 特定の構造を持った糖鎖及び糖鎖を付加した糖タンパク質糖ペプチドを合成可能にする達成目標 ( 平成 17 年度末 ) (1) (2) 主に天然型の糖タンパク質糖ペプチドを合成する手法を確立し構造解析用試料として利用できる 100 種類以上の糖タンパク質糖ペプチドを 10 マイクログラム純度 90% 以上の試料として提供する糖鎖自動合成装置システムにより特定の糖ペプチドを 2 週間で 10 ミリグラム純度 90% 以上で合成する 2

事業原簿 P57 装置類の一体化や専用インターフェイスの開発等により自動化装置を大幅に取り扱い易くした磁気ビーズ上の固定化酵素の他入手しやすい遊離酵素にも対応できる等応用範囲を広げた癌関連糖タンパク質マーカー糖ペプチドを 500 種類以上合成し基礎研究医薬品探索研究などでの有用性を証明している平成 17 年 9 月に完成した Golgi TM 第 5

3 事業原簿 P57 装置類の一体化や専用インターフェイスの開発等により自動化装置を大幅に取り扱い易くした磁気ビーズ上の固定化酵素の他入手しやすい遊離酵素にも対応できる等応用範囲を広げた癌関連糖タンパク質マーカー糖ペプチドを 500 種類以上合成し基礎研究医薬品探索研究などでの有用性を証明している平成 17 年 9 月に完成した Golgi TM 第 5 回グリーンサステイナブルケミストリー賞経済産業大臣賞を受賞 (2006 年 3 月 ) 1 糖ペプチド高速合成の新戦略と主な検討課題プライマー分子の合成糖ペプチド固相合成 2 酵素による糖鎖伸長反応ブロッティング 3 3 水溶性プライマー糖ペプチドの切り出しと単離糖転移酵素による伸長 4 糖ペプチド切り出し 5 ターゲット糖ペプチド検討課題 1 ムチン型コアを有する固相合成用 Fmoc- 糖アミノ酸の大量合成法の確立 2 糖ペプチド中間体の効率的固相合成 ( 高価で反応性の低い糖アミノ酸のカップリング ) 3 糖ペプチド中間体の水溶性高分子プライマーへの担持 4 水溶性高分子上での糖鎖伸長反応 5 効率的な糖ペプチドの切り出し法の開発事業原簿 P57 3

different polymer platforms shuttle on the solid-support shuttle shuttle on the water

4 Strategy of the glycopeptide synthesis Two Dimensional Synthesis of Glycopeptides Multiple peptide synthesizer Ser/Thr or Asn derivative Glycopeptide Golgi TM Shuttling two different polymer platforms shuttle on the solid-support shuttle shuttle on the water soluble support Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, J. Am. Chem. Soc. 2005, 127,

5 TM Golgi の基本構造 ( 模式図 ) パソコン Trapp 電磁石 Sample rack Accessory rack 指令共洗 buffer UF module 電磁石 Detector (UV-visible) Detector (UV) AUT SAMPLER Injection rack Sample rack waste Accessory rack solvent Sample rack Accessory rack 糖ヌクレオチド primer 磁気ビーズ回収ビン AUT SAMPLER Injection rack AUT SAMPLER Injection rack 糖ペプチドプライマーの合成 Fmoc Phe-Glu(tBu)-Ala-is(Trt)-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp(tBu)-Thr-Arg(Pbf)- Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Phe-Glu-Ala-is-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg- 2 R R R R R R R R R R R R microwave assisted solid-phase glycopeptide synthesis partial sequence of MUC1 (11 amino acids) R R R = Ac R = 90% TFA aq. R a, Me R' m n R'= -(C 2 ) 6 -Polyacrylamide 2 2 Phe-Glu-Ala-is-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg- 2 RP-PLC Ac / a buffer (p ) blotting and Ultra filtration (UF) Glycopeptide Primer before blotting after blotting by-products 5

6 糖ペプチドプライマーの糖転移反応切り出し sugar elongation reactions R' R' R'= (C 2 ) 6 -Polyacrylamide C 2 C 2 Phe-Glu-Ala-is-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg- 2 C 2 Phe-Glu-Ala-is-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg- 2 UDP-Gal, CMP-AA β1,4-galactosyltransferases α2,3-()-sialytransferase α2,3-()-sialytransferase (+ UF) ucleotides and buffer glycopeptide release RP-PLC C 2 C 2 Crude product (non-plc purification) Purified product (PLC purification) C 2 Ala-is-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg- 2 BLase (+ UF) Polymer and enzymes MUC1 糖ペプチドの構造解析 [ 1, 1 ] TCSY 600 Mz C 2 C 2 Ala-is-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg- 2 C 2 [ 1, 13 C] SQC 600 Mz 1 -MR 600Mz 6

MUC1 is a tumor-associated mucin having various sialoglycans MUC1 glycoprotein: contains a tandem repeating structures bearing various glycan chains.

7 MUC1 is a tumor-associated mucin having various sialoglycans MUC1 glycoprotein: contains a tandem repeating structures bearing various glycan chains. Core protein: a unique tandem repeating peptide with 20 amino acid residues is-gly-val-thr-ser-ala-pro-asp-thr-arg-pro-ala-pro-gly-ser-thr-ala-pro-pro-ala Carbohydrates: various -glycans at Thr and Ser residues ormal Mucin Tumor-Associated Mucin ormal carbohydrate epitope? Aberrant carbohydrate epitope? Sugar residue Extracellar amino acid residues Intracellar Structural changes in carbohydrates of MUC1 are considered to be essential for antigenicity in individual tumor disease. Development of MUC1 related cancer vaccines Reference : Reviewed by : Mary L. Disis ( University of Washington) MUC1 VACCIES as Emerging Therapeutic ptions for Cancer Patient (2005) Drug Company Stages Vaccine Tumor Type Theratope Biomira Merck Phase III Glycoprotein Breast,colorectal PAVAC-VF Therion Biologics Phase III Protein Pancreas MVA-MUC1-IL2 Transgene Phase II Protein SCLC,prostate,renal Canvaxin CancerVax Phase III Whole cell Melanoma L-BLP25 Biomira-Merck Phase II glycopeptide Lung, prostate (Phase III) (25 amino acids) 7

8 AcAcAc拮抗阻害率 ( % ) 乳癌細胞由来の抗 MUC1 抗体のエピトープ構造を解明 (Clone:VU-3C6 from Exalpha Biologicals, Inc) AA (Core2 SiaX2) 20 AA (non-sugar) 拮抗阻害化合物濃度 (ng/ml) Sugar Sugar achaingallactoseglcasialicacid=gac=g=c=linkage Position = G-V-T-S-A-P-D-T-R-P-A-P-G-T-S-A-P-P-A 1 x Core3 P-P-A--G-V-T-S-A-P-D-T-R-P-A-P-G-T-S-A 5 x Core2 (highly sialylated) P-P-A--G-V-T-S-A-P-D-T-R-P-A-P-G-T-S-A produced using breast tumor cells anti-muc1mab 2 CCore 2cAC2Core 3 Core peptide C2cA 幅広い産業利用大きな波及効果製造対象利用分野市場糖鎖製造糖ペプチド製造タンパク質糖鎖改変糖鎖修飾生化学研究新素材開発糖ペプチド医薬品開発糖タンパク質医薬品開発抗生物質等医薬品開発 1 糖鎖合成受託 2 合成装置試薬 3 ウイルス病原菌分離吸着用基材 4 再生医療用基材 5 診断医薬品探索用チップなど ( 数千億円 / 年 ) 医薬品市場 ( 数兆円 / 年 ) 8

全体のまとめ 1 複雑な構造の糖ペプチド合成に対する基本的汎用的な戦略を確立した本手法により最高でラクトサミンが4 回リピートした12 糖を持つ - 結合型糖ペプチドを初めとして構造が明確で生物学的に重要な糖ペプチドのライブラリ構築を達成した 2 結合型糖鎖と結合型糖鎖が混在した糖ペプチドの合成に成功した 3 30 糖を持つ MUC1 糖ペプチド ( 分子量 8451)

9 全体のまとめ 1 複雑な構造の糖ペプチド合成に対する基本的汎用的な戦略を確立した本手法により最高でラクトサミンが4 回リピートした12 糖を持つ - 結合型糖ペプチドを初めとして構造が明確で生物学的に重要な糖ペプチドのライブラリ構築を達成した 2 結合型糖鎖と結合型糖鎖が混在した糖ペプチドの合成に成功した 3 30 糖を持つ MUC1 糖ペプチド ( 分子量 8451) の高分解能 MR による構造解析を完了した 4 新型糖鎖自動合成装置 Golgi TM で新たな糖ペプチドプライマーを使用し試運転を行い実用化に向けて条件検討を行った core2 構造を含む糖ペプチドプライマーに対して磁気ビーズ固定化酵素を使用して糖鎖を伸長し5 糖構造を持つ糖ペプチドを並列自動合成した 5 糖ペプチドライブラリには 500 種類以上の化合物を登録 (2006 年 3 月 ) 9

新技術説明会　様式例

新技術説明会　様式例 1 機能性糖鎖の簡便な調製技術 : 医薬品検査薬機能性化粧品基剤などへの展開産業技術総合研究所北海道センター生物プロセス研究部門主任研究員清水弘樹研究背景近年糖鎖は核酸やタンパク質に続く第三の生命情報分子として注目されているまたウイルスや細菌の感染及び細菌毒素の体内への侵入の多くは宿主細胞が持つ糖鎖への接着によって開始されることが知られており感染症研究予防治療対策に病原体と糖鎖間の相互作用解析が重要と考えられている