チオールを特異的に酸化し 発色する 山形大学理工学研究科バイオ化学工学専攻准教授今野博行
金属酸化物クラスターアニオン ポリオキソメタレート Polyoxometalate (POM) 金属元素に酸素が6個配位した MO6を基本骨格とする金属酸化物 1 nm クラスターアニオン MO6 (octahedron) ( PxMyOz )n 構造 構成元素 対カチオン等を 制御することで 様々な機能性を 付与できる可能性 酸触媒 ナノマテリアル 酸化剤 フォトクロミック材料 医薬品 (癌 HIV アルツハイマー病) Putaj, P., et al., Coordination Chemistry Reviews 2011, 255 (15-16), 1642-1685
本研究の背景 2013 年 POM の細胞膜破壊作用を並河らが発見 * POM の抗菌活性試験を行った結果 グラム陽性菌のブドウ球菌に対し MIC ( 最小阻害濃度 ) = 100 μg/ml の抗菌活性 ブドウ球菌培養液が青色に呈色 After 3 h 0 25 50 75 100 150 200 Concentration of α-k 6 [P 2 W 18 O 62 ] nh 2 O (μg/ml) * Nabika, H., et al., RSC Adv. 2013, 3, 21271-21274
本研究の背景 ブドウ球菌表面上で酸化還元反応が進行したと仮定 Red. [P 2 W 18 O 62 ] 6- [P 2 W 18 O 62 ] 7- Ox. チオール含有アミノ酸である cysteine 水溶液に POM を添加したところ 青色に呈色 POM L-cysteine この呈色反応は速やかに進行し 極めて視覚的であるにも関わらず 先行研究はほとんど行われていない
本研究の目的 1 POM の cysteine 検出能の検討 2 ジスルフィド結合形成反応への展開
本実験で使用したPOM Keggin type POM1. POM2. POM3. POM4. POM5. メタタングステン酸アンモニウム (NH4)6[H2W12O40] nh2o ケイタングステン酸 H4[SiW12O40] nh2o リンタングステン酸 H3[PW12O40] nh2o リンモリブデン酸 H3[PMo12O40] nh2o リンモリブデン酸アンモニウム (NH4)3[PMo12O40] nh2o Dawson type POM6. リンタングステン酸カリウム α-k6[p2w18o62] nh2o POM7. 1欠損リンタングステン酸カリウム α-k10[p2w17o61] nh2o POM8. 3欠損リンタングステン酸ナトリウム α-na12[p2w15o56] nh2o Keggin type Dawson type Blue octahedrons : W or Mo Red dots : O [PW12O40]3- [P2W18O62]6-
POM の作製法 85% H 3 PO 4 KCl Na 2 WO 4 H 2 O reflux 100, 8h Na + P 2 W 18 O 62 6-1) recrystallization 100, H 2 O 2) cooling 5, 1 day XRD pattern of POM6 washing K 6 [P 2 W 18 O 62 ] 10H 2 O
Absorbance POM を用いた cysteine の検出 (1) POM1 8 を用いた cysteine の検出 After 24 h POM1 Mixture of 10 mg/ml L-cysteine (500 µl) and 10 mg/ml POM1-8 (100 µl) 3 2 1 POM2 POM3 POM4 POM5 POM6 POM7 POM8 After 24 h, 700 nm 0 POM1 POM2 POM3 POM4 POM5 POM6 POM7 POM8 Fig. 1. Absorbance of L-cysteine and POM1-8 mixture Cysteine に対して H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O (POM4) が最も高い反応性
POM を用いた cysteine の検出 (2) H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O (POM4) を用いた cysteine の検出 After 10 min Gly Ala Val Leu Ile Phe Cys Ser Pro Met Asn Gln Thr Tyr Trp Asp Glu His Arg Lys Mixture of 10 mg/ml L-amino acid (100 µl) and 10 mg/ml H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O (20 µl) H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O は cysteine のみを選択的に検出
(thousandths) 0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 POM を用いたジスルフィド結合の形成 4.084 4.076 4.068 4.060 abundance 3.941 3.930 3.385 3.323 3.315 3.293 3.285 3.244 3.129 3.113 3.100 3.082 3.038 3.026 3.007 2.995 2.953 2.945 2.923 2.915-52.15u 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 2 [PMo 12 O 40 ] 3- [PMo 12 O 40 ] 4-4.2 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3.0 2.9 2.8 X : parts per Million : Proton 1 チオールの酸化に伴うジスルフィド結合の形成 2 酸化還元状態の変化に伴う POM の呈色反応 4.2 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3.0 2.9 2.8 Fig. 2. 1 H-NMR spectra of L-cysteine and POM mixture (3 days) X : parts per Million : Proton
Absorbance POM を用いた cysteine の検出範囲 After 2 h 100 mm 10 mm 1 mm 100 μm 10 μm 1 μm control Mixture of L-cysteine (500 µl) and 20 mm H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O (500 µl) 2 After 2 h, 700 nm 1.5 1 0.5 0 Detection limit 100 mm* 10 mm* 1 mm 100 μm 10 μm 1 μm Control Final concentration of L-cysteine Fig. 3. Transition of absorbance by concentration of L-cysteine
POM を用いた保護 cysteine の検出 After 24 h Fmoc-Cys-OH Boc-Cys-OH Z-Cys-OH H-Cys-OBn H-Cys-OMe Mixture of 10 mg/ml protected cysteines (1 ml, DMSO) and 10 mg/ml H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O (200 µl) 保護基の立体障害が POM との反応性に大きく影響する
mv mv 1 6.12 1 5.72 2 9.8 POM を用いた glutathione の検出 GSH H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O H 2 O, r.t., 24 h After 10 min GSH GSSG GSSG 287 187 389 t R = 5.72 t R = 9.80 289 189 Addition of H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O (1.8 mg) to 10 mm glutathione aqueous solution (1 ml) 87-13 4 9 Time (min) 89-11 4 9 Time (min) Fig. 4. HPLC profile of glutathione and POM mixture
Absorbance POM を用いた pentapeptide の検出 Table 1. Reaction of pentapeptides with POM entry sequence with POM 3 After 24 h, 700 nm 2 1 Ac-Ser-Cys-Ala-Phe-Ile-NH 2 2 Ac-Ser-Gly-Ala-Cys-Ile-NH 2 3 Ac-Ser-Phe-Cys-Phe-Ile-NH 2 4 Ac-Ser-Gly-Cys-Gly-Ile-NH 2 1 0 13 42 53 64 Cys Fig. 5. Absorbance of pentapeptides and POM mixture Mixture of 10 mg/ml pentapeptides (800 µl) and 10 mg/ml H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O (200 µl) ペプチドのアミノ酸配列により POM との反応性は大きく異なる
Oxytocin の合成 (1) H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O DMSO, r.t., 24 h Oxytocin
mv 2 14.74 1 13.39 mv 5 13.56 6 13.98 Oxytocin の合成 (2) Oxytocin linear peptide 950 t R = 13.98 [M+H] + = 1009.4436 450-50 Oxytocin 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 Time (min) 950 t R = 13.39 [M+H] + = 1007.2919 450-50 12 13 14 15 Time (min) Fig. 6. HPLC profile of oxytocin and POM mixture Fig. 7. ESI-MS of oxytocin
Bactenecin の合成 (1) H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O 0.1M HCl aq./dmso (1:2) r.t., 24 h Bactenecin
mv 3 10.34 4 11.47 2 10.12 3 10.38 Bactenecin linear peptide 4 10.59 5 11.48 mv Bactenecin の合成 (2) 170 t R = 10.38 120 70 20 10 10.5 11 11.5 12 Time (min) [M+H] + = 1485.7446 Bactenecin 170 t R = 11.47 [M+H] + = 1483.6105 120 70 20 10 10.5 11 11.5 12 Time (min) Fig. 8. HPLC profile of Bactenecin and POM mixture Fig. 9. ESI-MS of Bactenecin
POM の cysteine 検出能 結論 Keggin 型 Polyoxometalate の H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O が cysteine と選択的に反応し 青色に呈色 POM の cysteine 検出能は保護基の有無やペプチドのアミノ酸配列により大きく変化 ジスルフィド結合形成反応への展開 POM を用いたチオールの酸化によるジスルフィド結合性環状ペプチドの生成を確認
従来技術とその問題点 グルタチン システイン ホモシステインなどに代表とされる生体チオールは 生体酸化還元ホメオスタシスを維持し 代謝を司る重要物質の一つである 酸化ストレスや疾患への関与が示唆されている特定のチオールを検出する手法として分光学的な方法が用いられる エルマンズ試薬 (DTNB 法 ) DTNB (λ max = 325 nm) 難水溶性チオール以外の攻撃を受けやすい 5-Mercapto-2-nitro benzoic acid (λ max = 412 nm) Mixed disulfide On/off シグナル比が低い洗浄 単離を必要とする
新技術の特徴 従来技術との比較 エルマンズ試薬 POM 水溶性低い高い 有機溶媒溶解性高い低い 安定性 様々な求核攻撃を受ける加水分解を受けやすい チオール特異的 >ph9 で分解する 後処理洗浄 単離が必要必要としない 価格 5,200 円 /1 g ( 同仁化学 ) 7,600 円 /100 g ( 東京化成 )
想定される用途 本技術の特徴はその手軽さにある 市販の高額な試薬と比較して感度 ( シグナル比 ) が十分でないため その効果的な用途を模索中である 生体内検査試薬のみならず 水質検査など環境測定分野への応用も視野に入れて検討している チオールの架橋反応を基盤にしているので バイオコンジュゲート ( 蛋白質と蛍光分子等 ) 試薬としての用途を想定している
実用化に向けた課題 現在 アミノ酸 ペプチドについて集中して検討している さらに蛋白質中のチオールの検出 蛋白質のバイオコンジュゲート試薬としての可能性を追求する 今後 他の生体分子 ( 核酸 糖鎖 脂質など ) チオール系低分子への検討が必要である POM の構造改変による感度の向上にも取り組み必要がある
企業への期待 本方法論を適用可能フィールドの提供 講演者は大学 創薬研究 有機合成などの狭い世界しか知らないため 本技術が真に活躍できる場所がどこにあるかはっきりと見定めができていない
本研究に関する知的財産権 発明の名称 : チオール検出剤及びチオール検出方法 出願番号 : 2017-042821 出願人 : 国立大学法人山形大学 発明者 : 今野博行 並河英紀 鵜浦啓
産学連携の経歴 2006 年 2007 年地域イノベーション創出事業 重点地域研究開発プログラムシーズ発掘試験に採択 2011 年 -2012 年第 2 回 A-STEP FS 探索タイプに採択 2017 年 -2018 年地域産学バリュープログラムに採択 : セルスペクト社と共同研究
お問い合わせ先 山形大学国際事業化センター知的財産部門事務担当馬場 TEL 0238-26-3024 FAX 0238-26-3633 Mail yu-chizai@jm.kj.yamagata-u.ac.jp