カラム内でのバンド拡がりの記述 (Van Deemter equation () ). multiple path ( 多流路拡散 ). molecular diffusion ( 分子拡散 ). slow mass transfer ( 遅い物質移動 ) 9 J.J. Van Deemter HE

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1 -HPLC カラム - 真の性能の利用のために. 分離を支配する要素バンド拡がり van Deemter 式カラム外効果. 逆相クロマトグラフィー溶質と固定相の相互作用固定相の調製法と保持特性シラノールと金属不純物の効果.HPLC の高性能化微粒子充填剤モノリスカラムピークキャパシティ D-HPLC 理論段数 H = s / L 理論段高 A, B, C 項最適 u s ext 分散 分散相互作用 a(ch ) 値二次的保持効果 UPLC: N / t ( 流路 / 骨格 ) サイズ比真の分離性能? 高いピークキャパシティ RPLC. 分離を支配する要素 R S = ( N / ) [(α-) /α] [ k / (k + )] () 分離度理論段数選択性保持 k = (tr-t) / t () (k : 保持係数 固定相の保持能力 移動相の溶出力 ) α = k / k () (α: 選択性, 分離係数 官能基の効果 ) N = L / s = (t R /t W ) =.(t R /t W/ ) バンド拡がり ( を支配する要素 ) の理解 ( 分散の可成性 ) L / N = H = s / L=s ( 移動相 )+ s ( 分子拡散 )+ s ( 固定相 ) 理論段高 = H = C E d p + C D /u + C S d p u (N: 理論段数,L: カラム長,H: 理論段高 - u: 移動相線速度,d p : 粒子径, D m : 拡散係数 s : 溶質バンドのガウス分布の分散 ) クロマトグラフィーは 固定相と ΔP=φηu L / d 移動相との間の溶質の分配係数 p () (ΔP: カラム送液圧力 d RPLC p : 粒子径 ) における差を 移動速度の差に 置き換えて分離を行う手法である t t R t R t W/ t W h/ h HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 用語. カラム (Column). 充填剤 (Packing material) particles. 固定相 (Stationary phase). 移動相 (Mobile phase) solvent. 保持 保持係数 (Retention factor = k) (t or t M ; Column dead time or hold up time, t R ; Retention time). 分離系数 (Separation factor = α) selectivity. 分離度 (Resolution = R S ) 理論段数 (Number of theoretical plates = N) 分配平衡の回数 9. 理論段高 (Height equivalent of theoretical plates = H) 段相当カラム長. ピークキャパシティ (Peak capacity = n C ) 分離可能ピーク数. 分離インピーダンス (Separation impedance = E) 時間あたり 圧力あたり N. 理論段数 /plate time (maximum N at minimum t /N) Poppe Plot HPLC 分離 - HPLC カラムの分離性能. 理論段数 /(maximum N at minimum RPLC t /N ) Kinetic plot analysis RPLC 課題 課題 HPLC における分離を支配する要素は何か カラムの性能 (H= 単位カラム長あたりの溶質バンドの拡がり = ガウス分布の分散 ) は何に依存するか? 課題 H を決める要素 : A 項,B 項,C 項とは? 課題 カラムの性能を最大限に利用するために必要なことは? 課題 カラムの真の理論段数 ( 性能 ) とは?

2 カラム内でのバンド拡がりの記述 (Van Deemter equation () ). multiple path ( 多流路拡散 ). molecular diffusion ( 分子拡散 ). slow mass transfer ( 遅い物質移動 ) 9 J.J. Van Deemter HETP の移動相流速に対する依存性を記述 Multiple path ( 多流路拡散 ) A 項 N = L /s = t R /t W () H=s / L = L / N = h d p () H = C E d p + C D /u + C S d p u () t t R t R t W/ h h/ カラム内の ( 直径方向の ) 異なる点で 移動相の流速が異なる 粒子の大きさ 形状 充填状態 空隙の大きさなどに依存する バンド拡がりに対する効果 (A 項 ) は 次のように表される 流速に依存しない = A + B/u + Cu t W RPLC RPLC Molecular diffusion ( 分子拡散 ) 移動相溶媒中 固定相上での分子拡散 : カラム軸方向の成分が H( バンド拡がり ) に寄与する H d = g D m / n D m : 拡散係数 γ:obstruction factor n : (reduced) velocity H = s / L, s = D m t R (t R = L/u solute ) バンド拡がりに対する効果 (B 項 ) は 流速に反比例する 分子量の大きな溶質について バンド拡がり ( 効果 ) が小さい 粒子の大きさ 形状 充填状態などにそれほど依存しない Kinetics of the mass transfer ( 物質移動の速さ 遅さ ) 充填剤の中と外 固定相の中と外の移動 ならびに 吸着と脱着の効果を含む mm 充填剤の nm の細孔を考えるとサイズは / 細孔内の流速は無視できるほど小さい 分子は拡散によって移動する 吸着 脱着の速度 ( 遅いこと ) は 通常 無視できる d p 粒子径 D m 拡散係数 () w 粒子の細孔径分布 形状 粒子径分布により決まる係数 v ( 換算 ) 線速度 バンド拡がり (H) は 流速に比例 高速溶出で効果が大きい C: 固定相中の物質移動 RPLC RPLC

3 ( カラム 充填剤粒子径 溶媒粘度 溶質拡散係数により 最適流速 ) 論段高移動相の流速理(H, バンド拡がり ) の線速度 (u, 流速 ) 依存性分子拡散支配物質移動支配項理論段高 C 項 A 項BH = s / L, H = A + B/u + Cu, (H = Au / + B/u + Cu) H = / [( / C e d p ) + (D m / C m d p u)] + C d D m / u + C sm d p u / D m RPLC 9 Plate height, H, mm UV Detector Time カラム外でのピーク拡がり ( カラム外効果 ) t カラム外効果 Column カラム外の影響を含むピーク カラム上でのピーク拡がり Injector Conditions Mobile phase : CH OH / H O = / (V/V) Solutes : C H C nh n+, (n = -) in Mobile phase Linear Velocity : mm/s RPLC Detection : nm Retention factor, k Temperature : tr PUMP Mobile Phase H obsd =(s ext +s col )/L : 粒子充填型カラム (Mightysil) : モノリス型カラム (Chromolith), : モノリス型キャピラリーカラム (MSH-Ⅱ) : カラム外効果を含むカラム性能 : カラム外効果を差し引いたカラム性能 まとめ カラム性能 ( 理論段数, 溶質バンド幅 ) N = L /s = t R /t W () H=s / L = L / N = h d p () HPLC カラムの分離性能 課題 カラムの性能を最大限に利用するために必要なことは? 課題 カラムの真の理論段数 ( 性能 ) とは? カラムの内部構造の影響 ( 流速依存性 ) H = C E d p + C D /u + C S d p u () multiple path molecular diffusion slow mass transfer カラム圧力 A B C DP = f h u L / d p (u = L / t ) () K = uhl / DP () 真の性能と実際のバンド幅との差 = カラム外効果 H total = H col + H inj + H det + H ext 最適 u あり RPLC 解答 目的 溶質とのマッチング カラム外効果の低減 移動相の選択 流速の選択 (H = A + B/u + C の最適値を与える u ) 分散を最小に 解答 得られたピークの分散 (s ) から カラム外効果による分散を差し引いて得られた 真のカラムによる分散を用いて算出した (L /s ) ( 小さなカラムを用いる場合 カラム外体積を最小に ) RPLC

4 Reversed-phase LC ( 逆相クロマトグラフィー ) Packing materials for RPLC column X Si OH X Si O Si R O + X Si R O X Si OH X Si OH O O C column, CH OH-H O mobile phase silica Silane reagent X:Cl, OR, CH Stationary phase Packing material Schematic illustration of RARP packing materials. 図. 逆相クロマトグラフィーの分離パターン. アルカンとアルコールの溶出 Schematic illustration of Spherical silica Porous structure Surface area: m /g Silica surface (OH: silanol) Chemical modification Packing material RPLC 炭素数が増加すると 一定の割合で保持 (k) が増加する 移動相の水含有量が大きいと 個の (CH) 基による保持の増加率が大きい α(ch) 大 RPLC 溶質分子 ( アルキルカルボン酸 ) の炭素数と逆相クロマトグラフィーにおける保持との関係 DG = -RT ln K 炭素数の増加とともに アルキル化合物の log k は直線的に増加する DDG = -RT ln(k /k ) DDG = -RT ln a(ch) a(ch ): 疎水性 log α(ch)= 一定,( 移動相から固定相への移動にともなうエネルギー変化 ) 液 - 液分配系 ( アルカン- 水, アルコール- 水分配系 ) と同様 疎水性 RPLC Mightysil -% CHOH(.%HCOOH) グラジエント (c) Mightysil % CHOH (.%HCOOH),,,,,,,,,,,,,,, 9, 9,,,,,,, 9, 9,,,,,,,, 9, 9,, (e) Mightysil % CHOH (.%HCOOH),,,,, 図 逆相クロマトグラフィー分離条件の設定.(a,b) ベンゼン誘導体のグラジエント溶出,CHOH % %( 分 ), Mightysil C (. mmx cm), Capcelpak C (. mmx cm),(c-e) イソクラティック溶出 (-% CHOH), Mightysil C,(c) %,(d) %,(e) %. RPLC, 9,, 9,,,,, Capcell Pak SG() -% CHOH(.%HCOOH) グラジエント, (d) Mightysil % CHOH (.%HCOOH),,,,,,,,,,,,, 9, 9, 9 9,,,,,,,,, 9, 9 有機溶媒 % を小さくして分離 疎水性効果 の調節

5 Log k 移動相溶媒の効果 Φ (Fraction B solvent) S= (MW=) S= (MW=) S= (MW=,) k= k= 移動相の CHOH % の増加により ( 直線的に ) 保持 (log k) が減少する 保持の減少の度合い ( 直線の傾き ) は 溶質の分子量に依存する 適当な時間 (k 範囲 ) で 分離が得られる条件を設定する RPLC 図. カルボン酸の溶出と移動相 ph の効果 移動相溶媒の効果 (ph) イオンの保持は小さい 高性能のために,pH 制御が必要 中性化合物の保持は ph に依存しない RPLC 逆相 HPLC における疎水性以外の効果 移動相溶媒の効果 酸 (π 酸 ) の保持が大きい 塩基性 O との相互作用が保持を増大 固定相中の THF 分子との相互作用 THF 自身が疎水性をもつ 逆相 HPLC における固定相の効果 Polar interactions, Contribution of stationary phase 親水性溶質に対する固定相の効果 C vs C 塩基性 :O: 図. 移動相有機溶媒 (THF) による選択性 (CHOH との差 ) 逆相クロマトグラフィーにおける有機溶媒による選択性の変化. カラム :Hypersil C (. mmx cm). 流速 ml/min. RPLC 9 C 固定相は C と比較して 親水性基の保持に不利でない 低反応率の C も同様 RPLC

6 NO NO NO CH NO 逆相 HPLC における固定相の効果 CH () () () () () CH 逆相 HPLC における固定相の効果 F Cl Br F Cl Br I I F Ph-X の保持 Cl Br F Cl Br I I Br F I Br F Cl I Cl C % CHOH PYE 9% CHOH NPE % CHOH NO F CH F H CH (CH) CH Si CH CH Si CH H dif CF (CF) dicf dich (CH) CH dicf CF dif (CH) dich (CF) CF F dif H dich (CF) dicf 図. 逆相クロマトグラフィー固定相の構造による選択性の発現. カラム :. mm mm, 移動相, CHOH/ 水, Cosmosil C: /, Cosmosil PYE: 9/, Cosmosil NPE: /. 流速 :. ml/min, 温度 :, 検出 : UV nm. 固定相の官能基の効果. 電子ドナー (PYE) とπ 酸との相互作用. 双極子 - 双極子 (Ar-NO RPLC ) 相互作用 PBB Br: 大きな原子 C F C 9 F: 小さな原子図 9. 固定相のもたらす選択性 分散相互作用の効果 RPLC logk logk log P vs log k (PBB) log P log P vs log k (NEOS) log P vs log k (C) log P logk alkylbenzene X-benzene di F-benzene di di alkylbenzene X-benzene. di F-benzene di Cl-benzene di Br-benzene. xylene anisoles CF-benzenes -. Cl-benzene Br-benzene xylene anisoles CF-benzenes Correlation between Log k and log P, (RPLC Retention and Hydrohobic property ) log P log k と相関 疎水性 log P 図. 逆相クロマトグラフィーにおける保持とlogP との相関 RPLC 逆相 HPLC における固定相の効果 log k と屈折率 FR 系固定相逆の相関 logk logk. -.. Retention (log k ) vs. Refractive Index (n) nd vs log k..... nd nd vs log k (NEOS) nd logk (PBB) alkylbenzene X-benzene di F-benzene di Cl-benzene di Br-benzene xylene anisoles CF-benzenes alkylbenzene X-benzene. di F-benzene di Cl-benzene nd vs log k (C) xylene anisoles -. CF-benzenes... nd 図. 逆相クロマトグラフィーにおける保持と溶質の屈折率との相関 RPLC

7 逆相 HPLC における固定相の効果 a = (n r ) / (n r + ) + - n: refractive index 屈折率 - + a: polarizability 分極率 The Lorentz Lorentz formula: The polarizability property of 大きな分極率 = 強い分散相互作用 a ( stationary 瞬間双極子 phase - 誘起双極子相互作用 or a solute. ) 大きな原子 High polarizability: ( 大きな ゆるい電子軌道 Strong dispersion )vs. 小さな原子 interactions. ( 小さな電子軌道 ) I,Br,S, π (Instantaneous 電子 dipole-induced F,O,H dipole interactions). 芳香族グループ同位体効果を大きくする FR 系で 同位体効果が小さい RPLC RPLC 逆相 HPLC における固定相の効果 表. 保持に対する重水素同位体効果 kh/kd (%IE per D) Compound C PBB FC Naphthalene... Anthracene... Octane Dodecanol a(ch)..9. a(ch) a(ch)=k(amylbenzene)/k(butylbenzene) a(ch)=k(naphthalene)/k(benzene) Mobile phase: % methanol 芳香族グループが同位体効果を大きくする PBB(Br ) が最大のH/D 識別を与える FR 系で 同位体効果が小さい 逆相 HPLC において 溶質と固定相との分散相互作用は大きな効果をもつ RPLC 逆相 HPLC における固定相の効果 Graphite Carbon Packing Material Selectivity based on highly polarizable, planar structure of graphite 図.Carbon 充填剤の立体選択性 vs. PYE and C 分散相互作用の大きさは距離の 乗に反比例する 立体効果が大きい RPLC

8 逆相 HPLC 固定相の調製法と保持特性 表. 逆相クロマトグラフィー系において 溶質の保持をもたらす相互作用 疎水性相互作用 -- 分子体積 表面積移動相中水の構造性 水素結合の切断双極子 - 双極子相互作用 ( 官能基の水素結合 ) 移動相中溶媒和分散力 ( 瞬間双極子 - 誘起双極子相互作用 ) 固定相立体効果 ( 立体的相補性 ) 固定相電子供与体 - 受容体相互作用固定相官能基イオン-イオン相互作用シラノール? O CH -Si-O-Si-C-C-C-C-C- CH O CH -Si-OH+CHSiCl Si-OH モノメリック固定相 CH O CH -Si-O-Si-C-C-C-C-C- O CH -Si-OH O OH -Si-O-Si-C-C-C-C-C- O O Cl -Si-O-Si-C-C-C-C-C- -Si-OH+CHSiCl O OHポリメリック固定相 Cl (ii)h O -Si-O O Si-C-C-C-C-C- -Si-OOH 図. 化学結合型シリカゲル充填剤の調製 図.C 充填剤の調製法と保持特性 RPLC 9 RPLC ODS 化 細孔径小表面積大 反応率 -C%-α(CH) 値 - 疎水性 RPLC( CH OH - H O) 順相 ( アルカン溶媒 ) k AB α(ch ) α(c/p) α(ch ) 細孔径大表面積小 C% α(ch ) 図. 反応率 (C%) と疎水性 (α(ch )),α(ch ) と保持能力 (k) との関係 反応率 C% α(ch ) 値 疎水性 反応率 固定相の量 疎水性保持能力 ( 表面積 ) C H (CH ) n H RPLC 図. 反応率 (α(ch ) と水素結合性 (α(caffeine/phenol)), α(c/p) と順相における保持 (k) との関係 反応率シラノール量水素結合保持能力二次シリル化シラノール量水素結合保持能力 RPLC

9 O CH -Si-O-Si-C-C-C-C-C- CH O CH -Si-OH+CHSiCl Si-OH モノメリック固定相 CH O CH -Si-O-Si-C-C-C-C-C- O CH -Si-OH O OH -Si-O-Si-C-C-C-C-C- O O Cl -Si-O-Si-C-C-C-C-C- -Si-OH+CHSiCl O OHポリメリック固定相 Cl (ii)h O -Si-O O Si-C-C-C-C-C- -Si-OOH 図. 化学結合型シリカゲル充填剤の調製 図. 化学結合型シリカゲル充填剤の調製 ポリメリック固定相には アルキル鎖の密度の高い部分が存在しうる RPLC k 親水性基選択性 α(ch ) PhCH PhH PhCOOCH PhCOCH α(t/o) I 図. 反応率 (α(ch ) と保持 (k) との関係, α(ch) と立体選択性 (α(t/o)) との関係 立体選択性 α(ch ) ポリメリック III III / H H 反応率 疎水性 - 親水性選択性 立体選択性 ポリメリック -モノメリック 立体選択性反応率 Triphenylene / o-terphenyl RPLC I モノメリック シラノール効果 アミン 水素結合 金属シラノール シリカ酸処理 +C +C + 二次シリル化 Al, Fe, Ti, Zr OH Si O H O O Si O Si H Metal impurity Isolated silanol Hydrogen bonded silanols 無処理 +C + 二次シリル化 A High purity silica B Conventional silica O OH OH シリカ酸処理 +C O OH TB TP PhOH CF BA PA NAPA 無処理 +C 図. 固定相の調製法とシラノール効果の発現 () theobromine, () theophylline, () phenol, () caffeine, () PA, () NAPA, and () benzyl alcohol. % methanol for solutes -, and % buffered methanol ph. and (c) ph. for solutes -. Mobile phase: % Methanol/.M phosphate buffer (ph ) Sample:. Purpurin,. Quinizarin,. Amylbenzene 図 9. 金属不純物の効果 - キレート化合物 高純度シリカゲルの使用とエンドキャップによる二次的保持効果の抑制高純度シリカゲルの使用による二次的保持効果の抑制 RPLC RPLC 9

10 エンドキャップによる二次的保持効果の抑制 Imipramine amitriptyline N N Si(CH) TMSI endcapping Commercial products 市販カラムの特性 HMDS endcapping Fig. Separation of basic compounds (ll) Mobile phase: % methanol in mm PBS (ph.). Flow rate: ml/min. Temperature: ºC. Detection wavelength: nm. Concentrations (mg/ml) in % methanol / water: uracil., imipramine. and amitriptyline.. Injection volumes are and μl respectively. J. Chromatogr. A,, - (). RPLC RPLC 逆相クロマトグラフィーカラム保持特性の評価. アルキル基の量 ( シリカ表面積とアルキル基密度 ) アルキルベンゼンの保持 α(ch). アルキル基間の距離 (monomeric or polymeric) Monomeric Polymeric Si-O-Si-CH Si-O-Si-CH 狭い空間 O CH O O 平面的化合物保持 Si-O-H Si-O-Si-CH α(ch), α(triphenylene / ortho-terphenyl). シラノール効果 ( 残存する SiOH 水素結合性化合物のテーリング ) α(caffeine / phenol). シラノール効果 ( 解離した SiOH, 残留金属 アミンのテーリング ) α(alkylamine / phenol) at ph <, at ph >. 金属不純物の効果 ( 金属 キレート剤のテーリング ) α(purpurin / amylbenzene) HPLC の課題. 親水性物質に対する分離能力. カラムの高性能化 ( 真の性能?). 分析の高速化. 高ピークキャパシティ. 官能基のもたらす識別能力 ( 電子供与体 - 受容体, 双極子性, 分散力の大小, 立体的識別 ) 適切な相互作用 立体効果 高性能分離 ( 化学的な分離能力の理解 ) 二次的保持効果の抑制 RPLC 9 RPLC

11 HILIC (HydropHILIC Interaction Liquid Chromatography) 極性 ( 親水性 ) 固定相,CHCN-HO 移動相 Anchor modified N O H < カラム内重合修飾法の利点 >. 様々な種類の固定相を容易に調製できる. 極性固定相を容易に調製できる上 充填による性能の低下がない. 固定相量の調節が可能 Si Acrylic acid (AA) O NH Acrylamide (AAm) O polymerization PAA PAAm 図.HILIC 型固定相の調製. モノリスシリカ表面の親水性基による修飾. OH RPLC T-C-TMSI_-%ACN.FA-min-kgf Q-Tof micro(ya) -Sep- :: T-C_PEPTIDES+VGSE+EH+DSDPR_ TOF MS ES+ Mobile phase: -%ACN (.%HCOOH). TIC.9e t g = min + Temperature: Ambient Detection: ESI(V pos)-tof ペプチドの分離 Solute: peptides : γ-eh, : DSDPR, : VGSE. : bradykinin fra-, : Arg-vassopresin, : Bradykinin, % : LHRH, : Oxytosin, 9: Met-enkephalin, :.. Bombesin, : Substance P, : Leu-enkephalin 9.. Volume: nl ID_AAHILIC_PEPTIDEST+EH+DSDPR+VGSQ_ % Column: MS-T- C (. cm) Column: MS-T-PAA (9 cm) Mobile phase: 9-%ACN (.%HCOOH) t g = min Temperature:Ambient Detection: ESI(V pos)-tof Solute:peptides Volume: nl TOF MS ES+ TIC.9e Time 図. 親水性相互作用クロマトグラフィー (HILIC) とRPLC との溶出順比較 RPLC 9.9. 逆相水 AN HILIC AN 水. C,-% AN (.% formic acid) Figure (d) (c) %ACNpH._kgf Q-Tof micro(ya) -Nov- :: PAA_SUCTRERAFFI_ TOF MS ES-. TIC..e Column: MS-T-PAA (. cm).. % %ACN/ mm NH. OAc ph. Mobile phase: see the figure. Temperature: C Detection:ESI(V neg)-tof PAA_SUCTRERAFFI_9 TOF MS ES-.. TIC. Solute:carbohydrates (each mg/ml).e. Volume: nl %.. PAA_SUCTRERAFFI_ % PAA_SUCTRERAFFI_. SDS %. %ACN/ mm NH OAc ph sucrose. %ACN/ mm NH OAc ph. trehalose %ACN/ mm NH OAc ph.... raffinose TOF MS ES- TIC.e TOF MS ES- TIC.e Time 図 -(d). MS-T-PAA-HILIC-ESI/MS によるラベルフリー糖の分離 RPLC PAA, 9-% AN (.% FA) ESI TOF MS base peak chromatogram of phosphorylase B tryptic digest. Detection: ESI TOF MS ( kv negative). Sample concentration: nmol/ml. Injection volume: nl. C-monolithic silica capillary column, mm x µm i.d. Mobile phase: -% acetonitrile (.% formic acid) in min linear gradient; poly(acrylic acid) monolithic silica capillary column, 9 mm x µm i.d. Mobile phase: 9-% acetonitrile (.% formic acid) in min linear gradient. Reproduced from ref. [9] with permission of Elsevier. C とPAA: 高ピークキャパシティ ( / min), 直交する選択性 D-HPLC? C(Rt) phosphorylase B tryptic digest Series RPLC AA(Rt)

12 H(um) mvolt PAAm-HILIC の性能 : -u,dp-u H プロット T-PAAm u(mm/sec) &ACN/mM NHOAc(pH.) 9 RPLC ZIC-HILIC 最適条件下 H = 以下 um高速領域でも高性能 逆相 HPLC で保持のない溶質の分離を達成 Conditions : Mobile phase : 9:=Acetonitrile : mm AmmoniumAcetate(pH.) Sample : solvent, Thymine, Uracil, Adenine, Uridine, Adenosine, Cytosine, Guanine,9 Cytidine, Guanosine log(t /N) 真のカラム性能 - ZIC-HILIC um -. MS-T-PAAm MS-T-PAA t = s t = s HILIC 粒子充填カラム vs. モノリス型シリカカラム (Poppe plot) N vs. (t /N) plate time t = s t = s log N 図 -. Plate number と Plate time のプロット (HILIC カラム ) Maximum pressure P = Pa 透過率 K = uhle/ P モノリスのポロシティー e=.9 粒子カラムのポロシティー e=.として計算 ZIC-HILIC: K=. - (m ) Solute: cytosine Mobile phase: %ACN/ buffer MS-T-PAAm: K=. - (m ) Solute: guanosine Mobile phase: %ACN/ mm NH OAc ph. MS-T-PAA: K=. - (m ) Solute: adenosine Mobile phase: 9%ACN/(.%HCOOH) RPLC 粒子充填カラムとモノリス型シリカカラムの性能比較 微粒子充填カラムの性能 (UPLC) Separation Impedance, E Packed column( ), Silica rod column ( ), MS-H()Ⅰ ( ), MS-H() Ⅱ ( ), MS-H() Ⅲ ( ), MS-H()Ⅳ ( ) Conditions: Mobile phase: % acetonitrile. Solute: hexylbenzene Temperature: ambient, Detection: nm Separation impedance : 真のカラム性能 = 時間あたり 圧力あたり理論段数 DPt æ DP öæ t öæ ö H E = = ç ç ç = hn è N øè N øèh ø K P:Pressure drop, t :Column dead time, η:viscosity of mobile phase, N:Number of theoretical Linear Velocity, u, mm/s plates, H:Plate height, K:permeability 分離時間の情報が明らかでない UPLC 高速分離 : ドーピングテスト 図 - セパレーションインピーダンスと線速度のプロット RPLC RPLC

13 AU µv His NH Arg Ser Gly Asp Glu Thr Ala Pro Tyr Cys-Cys Val Met Lys Ile Leu Phe 分 - (c) カラム :ACQUITY UPLC BEH C. 移動相 (.x. ml/min, グラジエント cm,., 移動相 B mm) 含有量 %(min), (.).(.) (.) (.) (9.) (9.) (.).A:.% 酢酸 /.%DBA,,B:% ph. CHCN. 温度 :. 検出 :UV nm. 試料 :Acc-tag Qアミノ酸.( データ提供 : 日本ウオーターズ ) カラム : ZORBAX -C SB mmx (. cm, μm).. 移動相 : ml/min (9, グラジエント bar), 移動相 B 含有量 %(min) (.) (.),A;. リン酸 /% % CHCN,B; CHCN. 検出 : UV. 試料 : 茶飲料 nm 倍希釈, 注入 : µl. 溶質. Gallic Gallocatechin acid,,.. Epigallocatechin, Catechin.,. Caffeine, Epicatechin, Epigallocatechin.. gallate, Gallocatechin. gallate, Epicatechin 9. gallate,. Catechin gallate.( データ提供 : 横河アナリティカルシステムズ )(c) カラム :-PressPak X CS (. mm µm). 移動相 x : 流速 cm, : ml/min,. グラジエント, 移動相 B 含有量 %( 分 ): -(.) - (.9) -(.).A:.M NaHPO /CHCN,B:.M (9/) NaHPO/CHCN (ph.). 温度 : ºC. (/) 検出 : UV (ph. 試料 :.) nm Isoniazid (), () RPLC 9 Pyrazinamide, Rifampin ().( データ提供 : 日本分光 ). 9 min. UPLC 高速分離 : アミノ酸 カテキンなど高速グラジエント 図. 微粒子充填カラムによる超高性能化. log(t/n ) 粒子充填カラムの真の性能 Kinetic plot analysis mm. mm mm mm mm 粒子径有効な理論段数の範囲 ( 一定圧力下での計算値 ) 粒子充填型カラムの性能限界.. 図.Kinetic plot Log(t /N ) analysis. against log(n) for the columns evaluated. The curves for particle-packedc olumns were obtained by assuming the following parameters: η=. Pa s, Φ=, Dm =. -9 m /s, and Knox equation, h=.ν / +/ν+.ν. Maximum pressure: MPa. The particle diameters for the particle packed columns were.,,, and mm. The symbols are long monolithic silica capillary columns prepared by several experimenters. RPLC log N t /N vs. N μm μm μm μm.μm Particle-packed vs. monolithic (c) (d) 図. モノリス型シリカの走査型電子顕微鏡写真. 試験管中調製モノリス型シリカ. (b-d) キャピラリー中でテトラメトキシシランとメチルトリメトキシシラン混合物から調製したハイブリッド型モノリス型シリカカラム. mmi.d., (c) mmi.d., (d) mmi.d.. RPLC Small skeleton Large through-pore Co-continuous structure Anal. Chem.,, 9-, 99. High efficiency (N = L / H = L / h dp) High permeability ( ΔP = φηl / t d p ) Mechanical stability RPLC

14 ,,9,,,,,,,,9,9,,, 9,99 9,,,,,,,,,,9,, 9,9, 9,,, 9,,,,,, 9 9,99 9,,,,,,,,,9,,,,,,,,,, 9, 9,,,,,,, 9,,9 9,,,9,,,,,,,,,,,, 9,,,,9,,. ThroughporeSize(m).. A E H mm eq. DP. mm eq. H D G F B C. mm eq. DP. mm eq. H 粒子充填型カラム..... Figure. Figure 図. モノリス型シリカカラムの流路径と骨格径 A. MSR- MSR- MSC- MSC- MSC- I Particulate Skeleton m) Size ( Plots of through-pore size against skeleton size for monolithic silica columns. RPLC ml/ min - bar ml/ min - bar ml/ min - bar ml/ min - 9 bar 9 ml/ min - bar 図. モノリス型シリカカラムによる高速化. カラム :Chromolith RP e,. 移動相 mm :CHCN/.% x cm, トリフルオロ酢酸 (TFA)=/ v/v ); ( 流速 :-9 ml/min. 検出 ; UV.. atenolol nm RPLC, pindolol., metoprolol., celiprolol., bisoprolol.. Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance,, 9,9 9,9,, 9, 9,,9,,,, 9,, Monolithic column C. x mm Monolithic column C. x mm Monolithic column C. x 9 mm (c) abundance.... abundance.... abundance.... min min min 図. キャピラリー HPLC によるグラジエント分離. 試料 : シロイヌナズナ葉のメタノール抽出物. カラム : モノリス型シリカC キャピラリーカラム mmid, cm, 移動相 :(A) cm, mm. 酢酸アンモニウム (c) 9 (ph cm.,(b).) CHCN. グラジエント, 移動相 B 含有量 %( 分 ): () () (), () () (), (c) () () (). 線速度 :. s, mm/ s,. (c) mm/.. 検出 :ESI mm/s -MS. RPLC 分離の改善によるイオンサプレッションの抑制, 高感度 MS 検出 RPLC

15 Time ( min). ドメインの微小化 均一化 - 高速性能の向上,mm 粒子の圧力で mm の性能 mm mm MS()-G MS()-B (c) DP =. MPa u =. mm/s N = t = sec DP =. MPa u =. mm/s N = t = 9 sec. Time(min) 図. モノリス型シリカキャピラリーカラムから得られたSEM 写真とクロマトグラム.( 参考文献 9) 溶質 uracil 番目のピークおよびアルキルベンゼン (C H (CH ) n H, n=-). カラム : MS()-G and MS()-B. mm ID, cm. 移動相 : メタノール / 水 = / 温度 : o C. RPLC Plate height, H (mm) 粒子充填カラムとモノリス型シリカカラムの性能比較 Linear velocity, u (mm/s) 図. カラム性能 (H) の移動相線速度 (u) 依存性. 粒子充填カラム ( 粒子径 =,. mm 計算値 ). モノリス型シリカカラム ( 実験値 ). 移動相 :% CH OH. 溶質 :Hexylbenzene mm 粒子充填カラム d p packed Conventional monolith nd-g Monolith. mm d p packed 圧力の要素なし RPLC log (t /N ) 粒子充填カラムとモノリス型シリカカラム - カラムの真の性能.. mm 万段の実現. mm mm. mm.. log N N= 以上で粒子型カラムより高性能 図. モノリス型シリカ-C キャピラリーカラムの性能 Plots of the log(t /N) values against log(n) for the columns evaluated. The curves were obtained by assuming the following parameters: maximum pressure: MPa, η=. Pa s, φ=, D m =.x -9 m /s, and Knox equation h=.ν / +/ν+.ν. The particle diameters for the particle-packed columns were:. mm, mm, mm, and mm. The dashed lines indicate the required t values in seconds. A previous monolithic silica column, MS()-D was indicated by ( ). The other symbols are the same as in Figure for the columns. RPLC 9... Kinetic plot analysis mvolt N =. 万段の実現 N = 9.9 Figure. Separation of alkylbenzenes (C H C n H n+, n=-). Mobile phase: % CH CN. Column: three monolithic silica C columns connected in series, KM, 9KM, and KM, effective length cm (total length cm). DP =. MPa. u =. mm/s. Detection: nm. Temperature: o C. RPLC Sample: thiourea and alkylbenzenes. N =. 9 L = cm

16 万段の実現ピークキャパシティ < ピークキャパシティ ( クロマトグラフィーシステムの真の分離能力 ) n c = + [( N) / ] ln(t R / t ) Rs = となる分離可能最大ピーク数 mvolt.. L= cm t =.h, N =. N =. 9 N =. N =. (k=.) k = -9, t R = t (+k), N =,, の場合 n c = + [ / ] ln() = 通常の カラムの場合 cm :? RPLC Figure. Separation of polynuclear aromatic hydrocarbons. Mobile phase: % CHCN. Detection: nm. Temperature: ºC. Sample: -PAHs primary pollutants designated by EPA. Peak numbers; naphthalene, acenaphthylene, fluorene, acenaphthene, phenanthrene, anthracene, fluoranthene, pyrene, 9 chrysene, benzanthracene, benzofluoranthene, benzo(k)fluoranthene, benzopyrene, dibenz(a,h)anthracene, indeno(,,-cd)pyrene, and benzo(g,h,i)perylene. Column: monolithic silica C column KK, effective length cm. RPLC DP =. MPa. u =. mm/s. Conditions as in Figure. Peak capacity of gradient elution mm,.x mm. mm,.x mm 二次元 HPLC のピークキャパシティ : n c-d = n c n c = e M n c n c 真の分離能力? Method transfer for fast liquid chromatography in pharmaceutical analysis: Application to short columns packed with small particle. Part II: Gradient experiments European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, In Press, Corrected Proof, Available online July, Davy Guillarme, Dao T.T. Nguyen, Serge Rudaz and Jean-Luc Veuthey RPLC D. R. Stoll, X. Li, X. Wang, P. W. Carr, S. E.G. Porter, S. C. Rutan J. Chromatogr. A, Volume, - (). RPLC

17 st-d Column nd-d Column nd-d PUMP st-d Detector Load Inject WASTE nd-d Column Loop A st-d Column WASTE st-d Detector nd-d PUMP Loop B Loop A Load, Loop B Inject Loop A Inject, Loop B Load mvolt Figure. Tubing connection at nd-d injector of simple D-HPLC in case (). Tubing connection of two six-port valves used as nd-d injector in case (). (c) Scheme of D-HPLC using two nd-d columns in case (). RPLC Fig. Chromatogram of tryptic digest of BSA with gradient elution on a cation exchange column. Column: MCI CQK-S, mm long,. mmid. Flow-rate: ml/min. Mobile phase: A, aqueous mmammonium formate solution buffered at ph =., and B, an aqueous mmammonium formate/ mmammonium chloride solution buffered at ph =.. Gradient from % A to % B in min. RPLC Comparison of UV chromatogram and total ion chromatogram(tic). UV RP (min) TIC Comparison of nd-d chromatograms of simple D-HPLC separation of a tryptic digest of BSA, case. Monolithic silica-c column (. mmid,. cm) as nd-d column. UV detection at nm. ESI-TOF-MS UV detection, 情報より total ion TIC chromatogram でのピークの同定が容易になる for a mass range -. See experimental RPLC section for the conditions. IE (min) 図. 次元 HPLC によるBSA トリプシン消化物の分離. 第一次元, カチオン交換分離. カラム :MCI CQK-S -mm ( mm,. mmi.d.), 移動相 (A) mm 蟻酸アンモニウム緩衝液 (ph =.), (B) mm 蟻酸アンモニウム緩衝液 / mm 塩化アンモニウム (ph =.), グラジエント溶出, B 含有量 ( 時間, 分 ): ( min), ポンプ流速 : ml/min, 第二次元, 逆相 HPLC 分離. カラム :monolithic silica-c Chromolith Flash ( mm,. mmi.d.), 移動相 (A).% 蟻酸水溶液, (B).% 蟻酸含有アセトニトリル, グラジエント溶出, B 含有量 ( 時間, 分 ):(. min) (. min) (. RPLCmin) ( 繰り返し ), ポンプ流速 :. ml/min, 第一次元分画時間 : min.

18 lo g k(%thf ) Chromolith A C (THF)-C (CH OH)D-HPLC tr(min) %MeOH(.%HCOOH)(tG min) ,,, 9,,, -. # # LFTFHADICTLPDTEK -. (i) (c) log k(%me OH) Chromo lith A tr(min) %THF (.%HCOOH)(tG min) # YICDNQNTISSK # 9 GLSDGEWQQVLNVWGK (d) (j) D-HPLCは 容易に可能 本の同じ種類のC カラムによる D-HPLC の例 time [min] time [min] 図. 逆相クロマトグラフィーにおける二次元分離. 移動相有機溶媒による選択性の発現. - 水中の THFlogk 値のCHOH - 水中のlogk 値に対するプロット, 二次元クロマトグラム.st -D, カラム : Chromolith C (. mm 移動相 x : cm), % THF (.% ~ HCOOH) min). 流速 :. ml/min, (検出図. ポリマーモノリスカラムによるペプチドの二次元分離 ( 参考文献 XX) 移動相 phによる選択性の発現. UV.nd -D, nmカラム : Chromolith C (. 移動相 mm :% x cm), % CHOH (.%HCOOH) ~ (st -D. カラム : mm x モノリス cm,, 移動相グラジエント PSDVB -% CHCN / 分, mmol /L triethylamine+ mmol /L min), 流速 :9. ml/min. 検出 :UV 温度 nm,. 第一次元分画 溶質 s. : 図 と同じ. 酢酸, ph 流速., : ml/min, 温度 : 検出 C, : 陰イオンモードESI -MS. -D. nd カラム : mmx モノリス cm, 移動 PSDVB RPLC 9 相グラジエント-% CHCN /min. mmol /L. TFA, RPLC 流速 ph., nl/min, 温度 検出 C, : 陽イオンモードESI -MS. 第一次元から分画 (No. -9) 各 ml 注入. H. Oberacher Toll,, H. R. Swart, Chromatogr C. G.. A, Huber, 9, J ().. signal intensity. - [counts] # # # # # # # # # 9 # # time [min] # # # # TVMENFVAFVDK (e) (f) (g) (h) n D-exp 9 monolith L=. cm t W = s t Rmax (s) 9 u (mm/s) n D-exp t Rmax (s) monolith L= cm t W = s (c) 9 u (mm/s) n D-exp t Rmax (s) monolith L=. cm t W = s u (mm/s) HPLC の高性能化 高速分離カラム 高理論段数分離カラム 二次的保持効果のない逆相カラム 親水性物質の精密分離用カラム (HILIC) (d) n D-exp 9 t Rmax (s) monolith L=. cm t W = s D-HPLC のピークキャパシティ Figure 9 (f) n D-exp u (mm/s) 9 (e) n D-exp u (mm/s) t Rmax (s) (g) 9 monolith monolith L= cm L= cm t W = s RPLC u (mm/s) t W = s u (mm/s) t Rmax (s) monolith L= cm t W = s n D-exp nd-d カラム : モノリスシリカ C 9 t Rmax (s) キャピラリー HPLC 多次元分離操作 高速 微流量グラジエント操作可能な機器の開発 高度な HPLC 機器 高性能カラム hyphenation 高ピークキャパシティ 真のカラムの分離能力 クロマトグラフィーに関する基礎的な理解 RPLC