NEBNext Direct Target Enrichment Technology 次世代シーケンサー用遺伝子パネル be INSPIRED drive DISCOVERY stay GENUINE

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1 NEBNext Direct Target Enrichment Technology 次世代シーケンサー用遺伝子パネル be INSPIRED drive DISCOVERY stay GENUINE

2 NEBNext Direct エクソーム パネル NEBNext Direct ワークフロー ターゲット領域の濃縮と NGS ライブラリー調製 ターゲット遺伝子 ゲノム DNA 断片化 変性 & プローブ ハイブリダイゼーション ビオチンプローブ ビオチンプローブは DNA トップ鎖とボトム鎖の両方のターゲット領域にハイブリダイズ ( 図はトップ鎖のみ表示 ) 末端の平滑化 オフターゲット配列を除去 Streptavidin bead da テーリング A アダプター ライゲーション A T adaptor 末端平滑化 A T プローブを起点に へ DNA を合成 UMI アダプター ライゲーション UMI adaptor A T 分子バーコード (Unique Molecular Identifier) の付加により正確な発現解析と定量が可能 アダプター開環 A T ループを切断してアダプターを開環 PCR 増幅 A T イルミナ シーケンサー用ライブラリー サンプル インデックス (PCR 中に付加 ) 2

3 NEBNext Direct エクソーム パネル NEBNext Direct: ターゲット領域を濃縮して ライブラリー調製を行う遺伝子パネル NEBNext Direct はゲノム中のターゲット領域を濃縮してライブラリー調製を行い ディープシーケンスを行うための遺伝子パネルです New England Biolabs と Directed Genomics 社が共同して開発した ターゲット領域に特異的にハイブリダイズするプローブを用いた濃縮 方法により 低頻度変異の検出が可能となりました 本手法はマルチプレックス PCR を用いた濃縮方法よりも広いターゲット領域の濃 縮と 高いカバレッジを示すライブラリー調製が可能であり ターゲット濃縮からライブラリー調製まで 1 日以内で完了します 特長 エンリッチメント試薬 ライブラリー調製試薬 インデックスプライマーが付属 ニッキング酵素により DNA 断片化 高価な断片化機器は不要 独自のプローブによりターゲットの全領域をカバー オフターゲット領域の除去により 高いオンターゲット率を実現 UMI 付加により PCR duplicate を除去 高解像度の解析が可能 最少 1 ng の DNA より高品質のライブラリーを調製 FFPE DNA や ctdna サンプルにも対応 On-Beads ワークフローのため オートメーションに最適 3 種類のパネルを提供 Cancer HotSpot Panel BRCA1/BRCA2 Panel Custom Ready Panel NEBNext Direct は他の濃縮方法よりもターゲット領域を均一にカバー Bases > 25% Mean Coverage (%) NEBNext Direct 37 kb Cancer HotSpot Panel Hybridization-Based PCR-Based Alternative 37 kb Competitor Custom Panel A 37 kb Competitor Custom Panel B 23 kb Oncology Panel 51.1 kb Solid Tumor Panel 2 kb Cancer Research Panel (Selector Probe) 35 kb Cancer Panel (Extension Ligation) NEBNext Direct Cancer HotSpot Panel(NEB #E) と各社がん遺伝子パネルを用いて調製したライブラリーを Illumina MiSeq でシーケンスしたところ 他社パネルと比較して NEBNext Direct パネルがより高い Coverage Uniformity を示した シーケンス リードを各ターゲット領域にマッピング 領域毎のカバレッジを求め 平均カバレッジ (Mean Coverage) の 25% 以上でカバーされている領域を Y 軸に示した インプット DNA として 24 HapMap サンプルの混合物 DNA 量として各社推奨量を用いた 濃縮およびライブラリー調製は各社推奨プロトコールに従った ( N = 2) 3

4 NEBNext Direct がん遺伝子パネル NEBNext Direct Cancer HotSpot Panel NEBNext Direct Cancer HotSpot Panel は がんに関連する 遺伝子の 1 か所のホットスポット領域を濃縮してライブラリー調製するた めの遺伝子パネルです ターゲット領域の総サイズは 37 kb であり COSMIC( がんの体細胞変異のデータベース ) に集積された 18, 以上の変異が含まれています 特長 独自のプローブにより 遺伝子 1 領域を高効率かつ均一でカバー 1 ng 1 µg の DNA よりライブラリー調製 分解が進んだ FFPE DNA や ctdna サンプルにも対応 NEBNext Direct Cancer HotSpot Panel のターゲット遺伝子 ABL1 EGFR GNAQ KRAS PTPN11 AKT1 ERBB2 GNAS MET RB1 ALK ERBB4 HNF1A MLH1 RET APC EZH2 HRAS MPL SMAD4 ATM FBXW7 IDH1 NOTCH1 SMARCB1 BRAF FGFR1 IDH2 NPM1 SMO CDH1 FGFR2 JAK2 NRAS SRC CDKN2A FGFR3 JAK3 PDGFRA STK11 CSF1R FLT3 KDR PIK3CA TP53 CTNNB1 GNA11 KIT PTEN VHL セルフリー DNA や FFPE DNA にも対応 GC 含量によらず各領域を均一にカバー Percent Reads Mapped to Targets Normalized Coverage Fresh frozen DNA Cell free DNA FFPE DNA DNA Source ( ng) Target GC ng の各 DNA サンプルから調製したライブラリーをシーケンス リードをターゲット領域にマッピングしたところ すべてのサンプルにおいて高いマッピング率が示された ng の DNA サンプルから調製したライブラリーをシーケンス リードをターゲット領域にマッピングして GC 含量毎のカバレッジを Y 軸に示したところ GC 含量によらずに均一であることが示された オーダーインフォメーション 製品名製品番号容量希望小売価格 NEBNext Direct Cancer HotSpot Panel * 各サイズに応じたインデックス プライマーが付属 ES:8 種類 EL:24 種類 EX:96 種類 ES 8 rxns 224, EL 24 rxns 656, EX 96 rxns 1,4, 4

5 NEBNext Direct BRCA1/BRCA2 パネル NEBNext Direct BRCA1/BRCA2 Panel NEBNext Direct BRCA1/BRCA2 Panel は BRCA1/BRCA2 遺伝子の全エクソン領域を対象とした遺伝子パネルです 高い coverage uniformity により 生殖細胞と体細胞の低頻度変異の検出を可能とします 特長 BRCA1/BRCA2 遺伝子の全エクソン領域 (%) を濃縮 1 ng 1 µg の DNA よりライブラリー調製 生殖細胞と体細胞の低頻度変異の検出が可能 分解が進んだ FFPE DNA や ctdna サンプルにも対応 様々なインプット量から高効率で BRCA1/BRCA2 遺伝子を濃縮可能 Percent of Reads (%) Aligned Reads mapped to targets 1 ng ng 1 µg 生殖細胞と体細胞の変異解析が可能 Mean De-duplicated Target Coverage Depth 1, ng 2 ng ng ng 25 ng 1 ng Millions of Reads インプット量の異なるヒトゲノム DNA(1 ng ng 1 µg) から濃縮とライブラリー調製を行い シーケンスリードを全ゲノムにアライメントもしくは BRCA1/BRCA2 遺伝子にマッピングしたところ 高効率で BRCA1/BRCA2 遺伝子が濃縮されていることが示された イルミナ MiSeq にて 2 75 bp のシーケンスを行った PCR duplicate は UMI でフィルターをした アライメントは BWA-MEM で行った インプット量の異なるヒトゲノム DNA から濃縮とライブラリー調製を行い シーケンスリード数に対する平均深度をプロットした イルミナ MiSeq にて 2 75 bp のシーケンスを行った PCR duplicate は UMI でフィルター アライメントは BWA-MEM で行った オーダーインフォメーション 製品名製品番号容量希望小売価格 NEBNext Direct BRCA1/BRCA2 Panel * 各サイズに応じたインデックス プライマーが付属 E6627S:8 種類 E6627L:24 種類 E6627X:96 種類 E6627S 8 rxns 12,4 E6627L 24 rxns 288, E6627X 96 rxns 1,, 5

6 NEBNext Direct カスタムパネル NEBNext Direct Custom Ready Panel NEBNext Direct Custom Ready Panel は約 8 遺伝子 * より必要な遺伝子のみを選択できるカスタム エクソーム パネルです 選択した遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブによりターゲット領域を濃縮してライブラリー調製をすることが可能です また個々のカスタムパネルは NEB でライブラリー調製とシーケンスによる性能評価を行い 成績書と共にお届けするため 信頼性の高いパネルをご 利用いただけます * 218 年 12 月時点での遺伝子数 特長 様々なサイズのパネルで優れた性能を発揮 約 8 遺伝子より必要な遺伝子を選択してカスタムパネルをデザイン 1 ng 1 µg の DNA よりライブラリー調製 分解が進んだ FFPE DNA や ctdna サンプルにも対応 カスタムパネルは個別に NEB で性能評価 信頼性の高いパネルを提供 様々な DNA インプット量とパネルサイズでも高感度で変異検出 1 gene (3 kb) 1 gene (3 kb) 25 gene ( kb) gene (1 kb) gene (2 kb) Percent (%) gene (3 kb) 1 gene (3 kb) % Aligned 25 gene ( kb) gene (1 kb) % Selected gene (2 kb) > 25% of Mean Coverage Percent of 2% Variants Called 様々なサイズのパネル ( 遺伝子 ) のデータを比較した結果 パネルのサイズに関わらず優れた性能を発揮することが示された ng の DNA を使用してライブラリー調製を行い イルミナ ペアエンドシーケンス (1 bp 2) で解析した 1 25 ng ng ng DNA Input 2 ng ng 様々な DNA インプット量とパネルサイズのデータを比較した結果 すべてにおいて高感度で変異検出ができることが示された 24 種類の HapMap サンプルを 2% の variant allele frequency(vaf) になるように混合 各量の DNA インプットを使用してターゲット エンリッチメントとライブラリー調製を行った イルミナ ペアエンドシーケンス ( 1 bp 2) の後 Muttect and Vardict variant calling algorithms で変異解析した オーダーインフォメーション 合計サイズ E6631S (8 rxn) 希望小売価格 E6631L (24 rxn) E6631X (96 rxn) 25 kb 122, 354, 1,179, 26 kb 133, 388, 1,292, 51 kb 162, 473, 1,572, 2 kb 191, 557, 1,853, 2 2 kb 22, 641, 2,134, 2 kb 261, 7, 2,527, kb 1 Mb 2, 844, 2,8, Mb 319, 928, 3,89, * 各サイズに応じたインデックス プライマーが付属 E6631S:8 種類 E6631L:24 種類 E6631X:96 種類 6

7 NEBNext Direct カスタムパネル カスタムパネルお申込みの流れ 弊社ウェブサイトのお申込みページより必要な遺伝子をご選択 弊社からの見積書および Bed File をご確認いただいた後に ご注文い ただく流れとなります お申込みの詳細は弊社ウェブサイトに掲載されていますので 合わせてご参照ください ご不明な点がござい ましたら弊社テクニカルサポートまでお気軽にお尋ねください Step 1 ウェブサイトのお申込みページ ( お見積り依頼フォーム )* よりお申込みください お問合せ お申込み Page 1: 約 8 遺伝子から必要な遺伝子を選択 Page 2: キットサイズ ( 8, 24, 96 反応 ) とキット数量を入力 Page 3: ご連絡先情報を入力 Step 2 * 選択リストにご希望の遺伝子がない場合には 弊社テクニカルサポートまでお問合せください フォームからお申込みいただいた後 以下内容が記載されたメールが届きます 確認メール お受け取り 受付番号 ターゲット遺伝子総サイズ パネル名 ターゲット遺伝子リスト Step 3 お見積り Bed File ご確認 ご注文 お申込みいただいたカスタムパネルのお見積りおよび Bed File を弊社よりお送りします Step 4 お見積りの内容で販売店にご注文ください Step 5 製造および パネル評価 カスタムパネルの製造を行います 製造したパネルはライ ブラリー調製とシーケンスによる性能評価を行います Step 6 納品 販売店より納品となります ( ご注文後 2 3 週間 ) カスタムパネルの性能評価の結果も提出 性能評価された 信頼性の高いパネルをお届けします 7

8 Flexible precision. New England Biolabs, NEB and NEBNEXT are registered trademarks of New England Biolabs, Inc. NEBNEXT DIRECT is a trademark of New England Biolabs, Inc. DIRECTED GENOMICS is a trademark of Directed Genomics, LLC. NEBNext Direct 遺伝子パネルは研究用限定です 診断には使用できません ニュー イングランド バイオラボ ジャパン株式会社 東京都墨田区江東橋 倉持ビル第 2 カスタマーサービス TEL: FAX: テクニカルサポート TEL: FAX: tech.jp@neb.com ウェブサイト :