サンプルシート作成ツール： Illumina Experimental Manager（IEM）の使用方法 －最新バージョンIEMv1.15のご紹介－

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1 サンプルシート作成ツール : Illumina Experimental Manager (IEM) の使用方法 - 最新バージョン v のご紹介 - 上利佳弘フィールドアプリケーションスーパーバイザー 25-Jul Illumina, Inc. All rights reserved. For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

2 Illumina Experiment Manager (IEM) とは? サンプルシートを作成するための Windows 用プログラム 各シーケンサーワークフローに対応したサンプルシートをウィザード形式で作成できる サンプルシートとは (MiSeq) MiSeq に指示を与えるラン設定ファイル (MiSeq 以外 ) Linux の bcl2fastq でイルミナシーケンサーの最終出力である bcl を FASTQ へ変換する際に必要となる設定ファイル 2

3 本日の Outline 事前準備 サンプルシート作成とランセットアップのワークフロー Index 選択のベストプラクティス 3

4 事前準備 IEMのダウンロードとインストール 4

5 IEM のダウンロード : イルミナウェブサイトで サポート をクリック 事前準備 2018 年 7 月のウェブサイト 5

6 IEM のダウンロード : Analysis をクリック 事前準備 2018 年 7 月のウェブサイト 6

7 IEM のダウンロード : Experiment Manager をクリック 事前準備 2018 年 7 月のウェブサイト 7

8 IEM のダウンロード : Illumina Experiment Manager v1.15 をクリック 事前準備 年 7 月のウェブサイト

9 事前準備 IEM のダウンロード : Illumina Experiment Manager v をクリック 年 7 月のウェブサイト

10 IEM のインストール : ダウンロードした Zip ファイルを解凍 IEM.Installer(62).msi を実行 事前準備 既に IEM をインストール済みの PC では あらかじめ旧バージョンをアンインストールしておく必要があります 10

11 事前準備 セキュリティ設定によって 警告が表示される場合 1 詳細情報を表示して 1 実行をクリック 11

12 事前準備事前準備 ; IEM でサンプルシートを作成する際に ライブラリーに関する情報を準備する - 使用したライブラリー調製キット - 各サンプルの Index やカスタムプライマー - シーケンスするサイクル数や Paired End/Single Read などの条件 標的領域のみをシーケンスするアプリケーションでは 位置情報を示すイルミナ独自のマニフェストファイルが必要になります (MiSeq 用サンプルシートの場合 ) ライブラリー調製前に IEM でサンプルシートを作成して 設定上の問題がないかをチェックしておくことをお勧めします 12

13 マニフェストファイルを指定する際の注意点 事前準備 マニフェストファイルが必要なアプリケーション * では サンプルシートは MiSeq 本体の IEM で作成することを推奨 *TruSight Panel 製品, TruSeq Amplicon, TruSeq Exome, TruSeq Targeted RNA Expression, TruSeq Bovine など マニフェストファイル (TruSeq Amplicon の例 ) 13

14 IEM の起動と 初期設定の確認 事前準備 14

15 IEM の各ファイルのデフォルト保存先 (MiSeq) 事前準備 15

16 サンプルシート作成とランセットアップのワークフロー 16 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

17 IEM の起動 サンプルシート作成 17

18 Instrument Selection サンプルシート作成 18

19 MiSeq Reporter で二次解析する場合のカテゴリーとアプリケーションの選択 サンプルシート作成 Category の選択 Application の選択 19

20 アプリケーション一覧 20 Targeted Resequencing Small Genome Sequencing RNA Sequencing Other * は情報解析は実施されず FASTQ のみ出力 サンプルシート作成 TruSight Tumor 15 TruSeq Bovine TruSeq Amplicon PCR Amplicon Metagenomics 16S rrna Enrichment Clone Checking* Amplicon - DS, TST 26 Resequencing Plasmids* Assembly Targeted RNA Small RNA RNA-Seq* TruSight HLA Library QC FASTQ Only* ChIP-Seq*

21 Application の選択 ; Resequencing の例 サンプルシート作成 21

22 Workflow Parameters の設定 サンプルシート作成 Run Setting Workflow Specific Setting 22

23 Run Setting 詳細 試薬カードリッジのバーコードを入力 ( サンプルシート名となる ランセットアップ時に MCS が自動的にサンプルシートを検出する ) または ラン前にファイル名を修正する サンプルシート作成 使用したライブラリー調製キットを選択 使用したインデックスアダプターを選択 インデックスの数を選択 インデックスリードのサイクル数はインデックスキットごとに決まっている 実験名 実施者名 説明事項 実施日 Paired End / Single Read シーケンスリードのサイクル数 * 必須項目 23

24 Workflow-Specific Settings の比較 Resequencing Enrichment サンプルシート作成 24

25 Workflow-specific Setting: Resequencing サンプルシート作成 Illumina Experiment Manager Software Guide より カスタムプライマーを使用するときチェック ( 現在 イルミナのライブラリー調製キットをご使用の場合はチェック不要 ) (On にした場合 MiSeq Reagent Kit の Port18-20 にプライマーを分注する必要がある ) Illumina の Somatic Valiant Caller を使用する ( 体細胞変異を検出したい場合にチェック ) PCR 重複のリードにフラグを立て Variant call から除外する 25

26 Workflow-specific Setting サンプルシート作成 Illumina Experiment Manager Software Guide より リードを逆相補鎖に変換する (Nextera Mate Pair Kit のとき On) Insertion, Deletion の部位に再度アライメントを行って Insertion, Deletion の検出感度を上げる 変異解析のクオリティの閾値デフォルトでは 30 出力される VCF ファイルにフラグが立つ 26

27 Workflow-specific Setting サンプルシート作成 Illumina Experiment Manager Software Guide より Read1, Read2 それぞれについて アダプター配列が読まれてきた際にアダプターから下流をトリミングする ( 推奨は On) 27

28 Workflow-specific Setting 1 サンプルシート作成 Illumina Experiment Manager Software Guide より Setting Applications Description BWA-Backtrack Custom Primer for Read1 Custom Primer for index Custom Primer for Read2 Use Somatic Variant Caller Enrichment, Library QC, PCR Amplicon, Small Genome Resequencing Truseq Amplicon 以外 TruSeq Amplicon, PCR Amplicon, Enrichment, Resequencing 以前のバージョンの BWA aligner v0.6.1 を使用する BWA-MEM v0.7.9a を使用している MiSeq Reporter v2.6 以降用 カスタムプライマーを使用する場合に選択する ( 現在 イルミナのライブラリー調製キットをご使用の場合は選択することはありません ) (MiSeq Reagent Kit の Port18-20 にプライマーを分注する必要があります ) Illumina の Somatic Valiant Caller を使用する ( 体細胞変異を検出したい場合にチェック ) 28

29 Workflow-specific Setting 2 サンプルシート作成 Setting Applications Description Indel Realignment GATK Flag PCR Duplicates Variant Quality Filter Use Adapter Trimming Use Adapter Trimming Read2 Run Picard HsMetric Resequencing, Enrichment TruSeq Amplicon 以外 TruSeq Amplicon, PCR Amplicon, Resequencing, Enrichment TruSeq Amplicon 以外 TruSeq Amplicon 以外 Enrichment Insertion, Deletion の部位に再度アライメントを行って Insertion, Deletion の検出感度を上げる PCR 重複のリードにフラグを立て Variant call から除外する 変異解析のクオリティの閾値デフォルトでは 30 出力される VCF ファイルにフラグが立つ Read1 でアダプター配列が読まれてきた際にアダプター配列をトリミングする Read2 でアダプター配列が読まれてきた際にそのアダプタ配列をトリミングする On-target Rate や Coverage Uniformity といった濃縮に関連したレポートを Picard hybrid selection で出力する 29

30 Workflow-specific Setting 3 サンプルシート作成 Setting Applications Description Reverse Complement Resequecing, Library QC, FASTQ Only, ChIP-Seq Nextera Mate Pair ライブラリのリードを逆相補鎖に変換する K-mer size Assembly アッセンブリに使用する K-mer サイズを設定する Genome Small RNA Small RNA の際に下記のリファレンスへのパスを設定する Contaminants (Human RNA Contaminants) RNA (Human RNA) mirna (Human RNA Mature) Export to gvgf Genus-level Classification PCR Amplicon, TruSeq Amplicon, Enrichment Metagenomics gvcf を出力する デフォルトでは種レベルでの分類を試みる チェックすると属レベルでの分類となる 詳しくは MiSeq Sample Sheet Quick Reference Guide をご参照ください 30

31 Sample Selection 1 サンプルシート作成 31

32 Sample Selection 1 サンプルシート作成 32 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

33 Sample Selection 1 サンプルシート作成 Sample ID Index 情報 33

34 Sample Selection 2 サンプルシート作成 34

35 Sample Selection 3 サンプルシート作成 入力完了 : Valid Finish 終了 35

36 補足 :MiSeq Reporter の Reference Genome の場所 MiSeq Reporter に Reference Genome を追加するには IEM の Setting で指定した Genome フォルダ以下の 次の階層に FASTA ファイルを置きます 1 階層目のフォルダ名が IEM のドロップダウンリストに表示される 例 :.. Genomes Saccharomyces_cerevisiae_NCBI_build3.1 NCBI build3.1 Sequence WholeGenomeFASTA genome.fa 36

37 サンプルシートの例 サンプルシート作成 37

38 注意事項 サンプルシート作成 禁則文字は使用しない? ( ) [ ] / = + < > : ; " ', * ^ &. とスペースやタブ 全角文字は使用しない 日本語 OS の場合には注意 セルの値が で囲まれていないか Excel や OpenOffice ではなく notepad などで確認 XXXXXX.csv を右クリック > プログラムから開く > notepad 38

39 MiSeq でのランの準備 ランの準備 サンプルシートを MiSeq 以外で作成した場合には MiSeq 上のデフォルト保存先にコピーして使用する D: Illlumina MiSeq Control Software SampleSheet サンプルシートのファイル名が試薬バーコードになっているか確認する マニフェストファイルが必要な場合 MiSeq 本体上のサンプルシートで指定した場所にファイルがあるか確認する 39

40 インデックス選択のベストプラクティス 40 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

41 ベストプラクティス ベストプラクティス Low Plex Pooling 際の注意点について - レーンあたりに使用するサンプルの数が少ない場合 Index リードのカラーバランスを考慮し Index の選択に注意する必要がある Unique Dual Index(UD index) の使用について - UD index は NovaSeq や HiSeq3000/4000 などのパターンフローセルを採用している装置で発生しやすい Index hopping の影響を回避できる ( 使用を推奨 ) - UD Index は最新版の IEM で選択可能 41

42 ベストプラクティス Low Plex Pooling 際のIndex 選択の注意点 42 4 色蛍光検出のシーケンサーの場合 - MiSeq および HiSeq シリーズでは ATGC の塩基がそれぞれ異なる蛍光でラベルされており 蛍光の励起には以下のレーザーが使用されます A/C 塩基 赤色レーザー G/T 塩基 緑色レーザー - Index リードの各サイクルに A/C 塩基および G/T 塩基がどちらも出現することが望ましい カラーバランスが良好なIndexの組み合わせの例 Good! Bad! i7 index N701 TAAGGCGA N701 N702 CGTACTAG N704 N705 GGACTCCT N705 cycles cycles カラーバランスに偏りのある Index の組み合わせの例 i7 index TAAGGCGA TCCTGAGC GGACTCCT X X XX

43 Low Plex Pooling 際の Index 選択の注意点 ベストプラクティス 2 色蛍光検出のシーケンサーの場合 - NovaSeq NextSeq および MiniSeq は 2 色の蛍光のみで 塩基の検出を行う ;C は赤 T は緑 A は赤と緑両方の蛍光ラベルを持ち G は蛍光ラベルされていない - 2 色蛍光検出のシーケンサーにおけるそれぞれの蛍光の励起には下記のレーザーが用いられる A/C 塩基 赤色レーザー A/T 塩基 緑色レーザー 43

44 Low Plex Pooling 際の Index 選択の注意点 ベストプラクティス 2 色蛍光検出のシーケンサーの Index 選択の注意点 - Index リードの各サイクルで A/C 塩基および A/T 塩基が両方出現することが望ましい - 全ての Index リードの先頭 2 塩基が G で始まっていると クラスターの検出に失敗し データの出力が行われない カラーバランスの良好な Index の組み合わせの例 シーケンスは可能だがカラーバランスに偏りのある Index の組み合わせの例 Good! Bad! Bad! i7 index i7 index D705 ATTCAGAA N704 TCCTGAGC N705 D704 GAATTCGT N707 CTCTCTAC N718 D712 AGCGATAG N718 GGAGCTAC XX X cycles cycles cycles すべての Index の先頭 2 塩基が G で始まっており データが出力されない例 i7 index GGACTCCT GGAGCTAC XX X

45 ベストプラクティス Low Plex Pooling 際のIndex 選択の注意点 Low Plex Sample Pooling を行う際の Index の組み合わせの推奨例などの詳細な情報は Technote をご参照ください - Index Adapter Pooling Guide 2 色蛍光検出シーケンサーの Index pooling についての詳細情報 - Bulletin: Library pooling guidelines for the NextSeq and MiniSeq systems 45

46 Unique Dual Index(UD index) の使用について Unique Dual Index(UD index) は i7 側 i5 側の Index 配列に重複がない i5 Index Dual Index ライブラリーの構造 i7 Index ベストプラクティス <4 サンプル Pooling の例 > 従来型 Index(CD index) Sample i7 index i5 index 1 TCGCCTTA TAGATCGC 2 TCGCCTTA CTCTCTAT 3 CTAGTACG TAGATCGC 4 CTAGTACG CTCTCTAT Index1 と Index2 の組み合わせで サンプルを区別 片側の Index はサンプル間で重複している場合がある UD index sample i7 index i5 index 1 CCGCGGTT AGCGCTAG 2 TTATAACC GATATCGA 3 GGACTTGG CGCAGACG 4 AAGTCCAA TATGAGTA Index1, Index2 どちらもサンプル間で重複がない UD Index を使用することによって パターンフローセルを使用する装置で生じる Index hopping の問題を回避できます 46

47 Index hopping とは ベストプラクティス 複数ライブラリーをプーリングし シーケンスをした際にライブラリー間で Index の組み換えが起こり Demultiplexing 後のライブラリーに 別のライブラリー由来のリードが含まれてしまう現象 47

48 Index hopping とは ベストプラクティス HiSeqX HiSeq3000/4000 NovaSeq などのパターンフローセルを採用した装置で低頻度ながら発生する MiSeq や HiSeq シリーズなど従来型フローセルの装置で発生する頻度はごく僅か その他 Index hopping の詳細については White Paper をご参照ください 48

49 ベストプラクティス UD index の使用で Index hopping の影響を回避 UD Index を使用したランでは Index hopping を生じたリードは Demultiplexing によって Undermined Read( どのライブラリーにも使用していない Index の組み合わせ ) として振り分けられ 各ライブラリーのリードに コンタミネーションとして混ざることがない 49

50 UD index の製品情報 ベストプラクティス UD Index が選択可能なライブラリー調製キット (DNA) 型番 製品名 価格 / キット TruSeq DNA PCR-Free LT Library Prep Kit (24 Samples) 116, TruSeq DNA PCR-Free HT Library Prep Kit (96 Samples) 464, TruSeq DNA Nano LT Library Prep Kit (24 Samples) 116, TruSeq DNA Nano HT Library Prep Kit (96 Samples) 464, TruSeq DNA Library Prep for Enrichment (24 Samples)* 184, TruSeq DNA Library Prep for Enrichment (96 Samples)* 612,000 *IDT 株式会社のエクソーム濃縮パネル ブロッキングオリゴおよび濃縮試薬と合わせてご利用ください 上記 DNA/Exome キットと組み合わせ可能な UD Index 型番製品名価格 / キット IDT for Illumina TruSeq DNA UD Indexes (24 Indexes, 96 Samples) 118, IDT for Illumina TruSeq DNA UD Indexes (96 Indexes, 96 Samples) 118, 価格は 2018 年 7 月 25 日現在の価格です

51 UD index の製品情報 ベストプラクティス UD Index が選択可能なライブラリー調製キット (RNA) 型番 製品名 価格 / キット TruSeq Stranded mrna Library Prep (48 Samples) 397, TruSeq Straned mrna Library Prep (96 Samples) 794, TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Human/Mouse/Rat (48 Samples) 989, TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Human/Mouse/Rat (96 Samples) 1,790, TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Gold (48 Samples) 989, TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Gold (96 Samples) 1,790, TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Plant (48 Samples) 989, TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Plant (96 Samples) 1,790, TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Globin (48 Samples) 989, TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Globin (96 Samples) 1,790, TruSeq RNA Library Prep Enrichment (48 Samples)* 413,000 * TruSeq RNA Enrichment, Exome Panelとあわせてご利用ください 上記 RNA キットと組み合わせて使用可能な UD Index 型番 製品名 価格 / キット IDT for Illumina TruSeq RNA UD Indexes (24 Indexes, 96 Samples) 118, IDT for Illumina TruSeq RNA UD Indexes (96 Indexes, 96 Samples) 118, 価格は 2018 年 7 月 25 日現在の価格です

52 補足事項 52 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

53 Software Guide について Illumina Experiment Manager Software Guide _manager.html MiSeq Sample Sheet Quick Reference Guide ence_guide_ html MiSeq System User Guide html 53

54 ランの条件については 各調製キットのウェブページをご参照ください IEM Quick Reference Card も参考になります 54

55 サンプルシートの作成 Instrument Selection NextSeqの結果からFASTQファイルを作成 55

56 NextSeq の結果から FASTQ ファイルを作成する方法 サポートウェビナーシリーズ /11/14 NextSeq 500 から得られるデータの FASTQ 変換 イルミナサポートウェビナー ( 56

57 サポートウェビナーにご参加いただきありがとうございました 本日のセッション終了後のご質問は で承ります テクニカルサポート直通のフリーダイヤルもご利用ください (AM9 PM5)