ex1: TopHat キイロショウジョウバエ Drosophila melanogaster の RNA-seq を行った ライブラリは 2 種類 それぞれ single end( イン

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1 ex1: TopHat キイロショウジョウバエ Drosophila melanogaster の RNA-seq を行った ライブラリは 2 種類 それぞれ single end( インサートの片側だけ読む ) で 75bp シークエンスした 10 万リード得られた これらのリードを D. melanogaster のゲノムにマッピングしたい TopHat を用いて splice-aware なマッピングを行う Data Input reads (~/data/ex/ 以下にある ) C1_10k_Read1.fq C2_10k_Read1.fq Reference D. mel genome and annotation (Ensembl BDGP5.25) をiGenomes ( [ からダウンロードする ftp://igenome:g3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/drosophila_melanogaster /Ensembl/BDGP5.25/Drosophila_melanogaster_Ensembl_BDGP5.25.tar.gz [ftp://igenome:g3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/drosophila_melanogaster/ensembl /BDGP5.25/Drosophila_melanogaster_Ensembl_BDGP5.25.tar.gz] ただ ファイルサイズが比較的大きくダウンロードに時間がかかると思われる 演習用のMacに同じファイルが置いてある (~/data/ex/ 以下にある ) Drosophila_melanogaster_Ensembl_BDGP5.25.tar.gz Setup Setup environment ex1 ディレクトリをつくり 以下の解析はその下で作業しよう $ mkdir ex1 $ cd ex1 Sequence reads less などのコマンドで C1_10k_Read1.fq の内容を確認する 注 ) 本番の解析では リード数の確認 フォーマットの確認 クオリティの確認などを行う 必要であればアダプター配列の除去 低クオリティ部位のトリムも行う Reference sequence and annotation files Drosophila_melanogaster_Ensembl_BDGP5.25.tar.gz を解凍する 1

2 $tar xzvf Drosophila_melanogaster_Ensembl_BDGP5.25.tar.gz Run tophat TopHat を実行 C1_10k_Read1.fq $ tophat -p 4 -G genes.gtf -o C1_tophat_out genome C1_10k_Read1.fq gene.gtf は known transcript が記録された gtf ファイル ファイルパスを指定すること ダウ ンロードした Drosophila_melanogaster_Ensembl_BDGP5.25 の中のどこかにある genome には bowtie2 用のゲノムのインデックスファイルの base name を指定する ダウンロー ドした Drosophila_melanogaster_Ensembl_BDGP5.25 の中のどこかにある -p は使う CPU core を指定するオプション 使用するコンピュータのスペックに合わせて オススメ : transcriptome-index オプションは指定した方が良い 初回に作製した bowtie2 index が 2 回目以降使い回せる 複数ライブラリを解析する際は大幅に時間の節約になる 同様に C2_10k_Read1.fq をマッピング $ tophat -p 4 -G genes.gtf -o C2_tophat_out genome C2_10k_Read1.fq Inspect Results 計算が終わったら どのようなファイルが生成されたか確認する $ ls -l C1_tophat_out/ total rw-r--r-- 1 shige staff Mar 6 23:10 accepted_hits.bam -rw-r--r-- 1 shige staff 52 Mar 6 23:10 deletions.bed -rw-r--r-- 1 shige staff 54 Mar 6 23:10 insertions.bed -rw-r--r-- 1 shige staff Mar 6 23:10 junctions.bed drwxr-xr-x 17 shige staff 578 Mar 6 23:04 logs -rw-r--r-- 1 shige staff 66 Mar 6 23:04 prep_reads.inf prep_reads.info の中身を less で確認しよう accepted_hits.bam がアライメント結果だ 中身を samtools で確認しよう $ samtools view C1_tophat_out/accepted_hits.bam less IGV IGV で可視化しよう IGV で bam ファイルを読むためには インデクシングをしなければいけない sort indexing の段階をふむ $ samtools sort accepted_hits.bam accepted_hits.sorted # => accepted_hits.sorted.bam ができる $ samtools index accepted_hits.sorted.bam # => accepted_hits.sorted.bam.bai ができる 1. IGV を立上げる 2

3 2. 左上のプルダウンメニューから Drosophila melanogaster のゲノムを選ぶ ( 今回使っているリファレンスと同一のバージョンの Dmel ゲノムがないが今回の練習では r5.33 を選んで問題はない ) 3. メニュー File > Load from File accepted_hits.sorted.bam を選択 4. 適当な染色体の適当な場所を指定し 適当にズームアップする X:830,000 近辺 git2014sopen/ex1.txt Last modified: 2014/03/04 20:03 by shige Except where otherwise noted, content on this wiki is licensed under the following license:cc Attribution-Share Alike 3.0 Unported [ 3

4 ex2: Transcript-based Mapping with Bowtie2 マウス Mus musculus の RNA-seq を行った ライブラリは 1 種類のみで single end ( 片側 Read1 のみ ) 75bp シークエンスを行った これらのリードをマウス mrna リファレンスにマッピングさせたい 戦略 :bowtie2 で mrna リファレンスにマッピング Data データファイルは ~/data/ss 以下に保存してある Input reads IlluminaReads1.fq Reference minimouse_mrna.fa Setup Setup environment ex2 ディレクトリをつくり 以下の解析はその下で作業しよう Sequence reads less などのコマンドで シーケンスファイル (IlluminaReads1.fq) の内容を確認する 注 ) 本番の解析では リード数の確認 フォーマットの確認 クオリティの確認などを行う 必要であればアダプター配列の除去 低クオリティ部位のトリムも行う Reference sequence and annotation files minimouse_mrna.fa の内容を less などで確認する Create index of reference $ bowtie2-build reference.fasta output_basename たとえば reference.fasta : referenceのfastaファイル 今回の場合はRefSeq.MM9.cds.nr.fasta( のパス ) output_basename : 生成されるインデックスファイル群のbase name bowtie2-build Data/RefSeq.MM9.cds.nr.fasta myref を実行すると 4

5 myref.1.bt2 myref.4.bt2 myref.2.bt2 myref.rev.1.bt2 myref.3.bt2 myref.rev.2.bt2 の 6 つのファイルができる Run Bowtie2 bowtie2 でマッピングしよう Usage: bowtie2 [options]* -x <bt2-idx> {-1 <m1> -2 <m2> -U <r>} [-S <sam>] bowtie2には様々なオプションがあるが今回は最低限のオプションだけを設定して実行する どのようなオプションが利用可能かは bowtie2 -h で確認できる また開発者ホームページに詳細な解説がある 本番の解析では 適切なオプションを適切なパラメータで実行しなければいけない 実際は いくつかパラメータを振って試行錯誤することになる $ bowtie2 -p 4 -x RefSeq.MM9.cds.nr -U mouse_200k.left.fq -S out.sam out.sam がマッピング結果 SAM format -p は使うCPUコア数 使用するコンピュータにあわせて設定する コマンドを実行するとしばらくして reads; of these: (100.00%) were unpaired; of these: (57.37%) aligned 0 times (34.12%) aligned exactly 1 time (8.51%) aligned >1 times 42.63% overall alignment rate のようなレポートが表示されて終了する マッピング率など有用な情報なので テキストファイルにコピー & ペーストして保存しておくと良い Inspect Results 計算が終わったら どのようなファイルが生成されたか確認する (ls -l など ) out.sam の内容を確認しよう (less, head, tail など ). 最初の約 2 万行はヘッダで アライメントはそのあとに続く SAM to BAM mapping 結果を可視化したりカウントしたり 様々な下流解析を行うために SAM ファイルを sort 済の BAM に変換する そしてインデクシングする SAM BAM の変換は NGS 研究ではよく行う作業なので必ず身に付けること $ samtools view -bs out.sam > out.bam $ samtools sort out.bam out.sorted # => out.sorted.bam が生成される $ samtools index out.sorted.bam 5

6 # => out.sorted.bam.bai が生成される Count by transcript samtools を使って transcript ごとにカウントする簡易な方法を紹介する amtools のサブコマンド idxstats は reference sequence のエントリー毎にマップされたリード数を集計する 今回は各シークエンスエントリーが各トランスクリプトに相当するので これを利用すると transcript ごとのカウント情報が得られる $ samtools idxstats out.sorted.bam ( やや難 ) 最もカウント数が多いのはどの遺伝子だろうか sort コマンドで手っ取り早く確認することが出来る git2014sopen/ex2.txt Last modified: 2014/03/04 20:10 by shige Except where otherwise noted, content on this wiki is licensed under the following license:cc Attribution-Share Alike 3.0 Unported [ 6

7 ex3: Data Import and Visualization arab2.txt は 6 libraries (2 groups x 3 biological replicates) のシロイヌナズナ RNA-seq のデータである すでにマッピング済みで遺伝子毎のリードカウントがタブ区切りテキストとして提供されている この exercise では テーブルの中身を確認する基本テクニックを練習する Data (~/data/ss/ 以下にある ) arab2.txt : count table Inspect table with MS Excel 1) 表計算ソフト MS Excel を使って arab2.txt の中身を確認しよう 2)MS Excel で m1 と m2 の scatter plot( 散布図 ) を書いてみよう このふたつは同一コンディションの biological replicate なので 発現パターンは両者で良く似ているはずである 次に m1 と h1 を比較しよう このふたつはコントロールと実験群の比較なので有る程度の発現パターンの違い ( すくなくとも m1 vs m2 よりも大きい違い ) が期待される ヒント :xy 軸ともに対数をとること コメント : ノーマライズなどを施していない生データでもこれだけ豊富な情報が得られることを認識して欲しい ex-1b: Inspect table with R こんどは R でテーブルの確認と scatter plot を書いてみよう Data import > dat <- read.delim("arab2.txt", row.names=1, head=t) # read tab-delimited text > head(dat) m1 m2 m3 h1 h2 h3 AT1G AT1G AT1G AT1G AT1G AT1G Inspect table > dim(dat) [1] Q1:dim コマンドは何をするものですか? Q2: また その結果得られた と 6 は何を意味しますか? 7

8 Inspect data by column それぞれのライブラリの リードカウント合計は重要な基礎情報である 計算してみよう Q3: それぞれのライブラリのリードカウント合計を求めなさい 例としてm1カラムの合計を計算する > sum(dat$m1) [1] 他のカラムも合計を計算しよう また これらは基礎情報として重要なので記録しておこう Q4 ( やや難 ): 約 2 万 5 千遺伝子にはカウント 0 のものから非常にたくさんのカウントをもつものがある カウントの i) 最大値 最小値 平均値 中央値はいくつか調べよう ii) ヒストグラムを書きなさい m1 as an example: > dim(dat) [1] > sum(dat$m1) [1] > sum(dat$m3) [1] > max(dat$m1) [1] > min(dat$m1) [1] 0 > mean(dat$m1) [1] > median(dat$m1) [1] 9 コメント : ただ計算するだけでなく これらの基礎統計量を見て カウントデータの分布にどのような特徴があるか考えることが大切です > hist(dat$m1) しかし あんまり特徴がつかめないので > hist(log10(dat$m1 + 1), breaks="scott") Scatter plot Q5: m1 vs m2 を scatter plot で比較しよう 8

9 > plot(dat$m1 + 1, dat$m2 + 1, log="xy") それぞれ +1 しているのは log0 は計算できないため +1 して下駄を履かせている Q6: ほかのライブラリどうしも scatter plot を描いて比較しよう コメント :plot などのグラフィックス関数には 様々な引数を与えることによって非常に多くの描画パラメータを変更でき グラフの見栄えを変更することが出来る 余裕があれば plot の色 形 などを変更する練習をしてみると良いだろう git2014sopen/ex3.txt Last modified: 2014/03/04 20:13 by shige Except where otherwise noted, content on this wiki is licensed under the following license:cc Attribution-Share Alike 3.0 Unported [ 9

10 ex4: MA plot MA plot 2 RNAseq M = log(intensityb / intensitya) # log of the ratio = A = log(sqrt(intensitya * intensityb)) # intensity average of log intensity = arab2.txt MA plot (ex3 dat ) Q1) m1 vs m2 MA-plot M <- log2(dat$m2 / dat$m1) A <- log2(sqrt(dat$m1 * dat$m2)) plot(a, M) log0 M <- log2(dat$m2 + 1) - log2(dat$m1 + 1) A <- 1/2 * (log2(dat$m2 + 1) + log2(dat$m1 + 1)) plot(a, M, col="gray", pch=16, cex=0.4, ylim=c(-8,8)) edger MAplot RNAseq MA git2014sopen/ex4.txt Last modified: 2014/03/04 20:15 by shige Except where otherwise noted, content on this wiki is licensed under the following license:cc Attribution-Share Alike 3.0 Unported [ 10

11 ex5: edger arab2 のデータを使い 2 群間比較を edger で行う edger は複雑なパッケージである 開発者が詳細のユーザーガイドやマニュアルを用意しているので これらを活用して欲しい ( リンクは下記参照 ) Import library library(edger) Import data > dat <- read.delim("arab2.txt", row.names=1) #... dat 中身の確認作業... 2 グループ 各 3 繰り返し実験 という実験デザインを定義する > grp <- c("m", "M", "M", "H", "H", "H") > grp [1] "M" "M" "M" "H" "H" "H" edger の DGEList 関数でカウントデータを読み込む > D <- DGEList(dat, group=grp) > head(d)... Normalization TMM 法で ノーマライズする calcnormfactors を使う > D <-calcnormfactors(d, nethod="tmm") 計算結果の確認 > D$samples group lib.size norm.factors m1 M m2 M m3 M h1 H h2 H h3 H DE testing estimate dispersion > D <- estimatecommondisp(d) > D$common.dispersion 11

12 [1] > D <- estimatetagwisedisp(d) > summary(d$tagwise.dispersion) Min. 1st Qu. Median Mean 3rd Qu. Max DE test > de.tagwise <- exacttest(d, pair=c("m", "H")) Multiple comparison correction and View results > toptags(de.tagwise) Comparison of groups: H-M logfc logcpm PValue FDR AT5G e e-17 AT3G e e-15 AT2G e e-15 AT4G e e-15 AT2G e e-14 AT2G e e-14 AT3G e e-13 AT4G e e-13 AT1G e e-13 AT2G e e-13 Dump the table into a text file > write.table(de.tagwise$table, "de.tagwise.txt", sep="\t", quote=f) or > tmp <- toptags(de.tagwise, n=nrow(de.tagwise$table)) > write.table(tmp$table, "de.tagwise2.txt", sep="\t", quote=f) MA plot edger 提供の plotsmear 関数を使うと便利 plotsmear(d) 有意に発現差のある遺伝子を赤で表示することもできる > de.names <- row.names(dat[decidetestsdge(de.tagwise, p.value=0.05)!=0, ]) > plotsmear(d, de.tags=de.names) 12

13 Inspect DE result example: fold-change > 10 を抽出 カウント detab <- tmp$table ## get fold-change > 10 detab[detab$logfc > log2(10),] nrow(detab[detab$logfc > log2(10),]) example: FC > 5 AND FDR < 0.01 > detab[(detab$logfc > log2(2) & detab$fdr < 0.05), ] edger に組み込まれている decidetestdge 関数も便利 > summary(decidetestsdge(de.tagwise, p.value=0.05)) [,1] dump したタブ区切りテキストを MS Excel で読み込んで フィルタ機能やソート機能を駆使してデータを探索するのも良いだろう Links [ edger edger User's Guide [ /inst/doc/edgerusersguide.pdf] git2014sopen/ex5.txt Last modified: 2014/03/05 20:55 by shige Except where otherwise noted, content on this wiki is licensed under the following license:cc Attribution-Share Alike 3.0 Unported [ 13

14 Clustering 問 1 データセット _mutant_group00-04_Pst-aR2_6h_q0.05_ExpRatio_22g.txt を使って ユークリッド距離を使った場合とコサイン係数を使った距離でクラスタリングした時の違いを調べなさい なお コサイン係数での距離 クラスタリングは下記のカスタム関数を用いてよい また heatmap および heatmap.2(gregmisc ライブラリー ) では引数に Rowv=as.dendrogram( 行のクラスタリング結果 ), Colv=as.dendrogram( 列のクラスタリング結果 ) と指定することで任意のクラスタリング結果でヒートマップを描くことができる # コサイン係数 ( ベクトルの角度 ) でクラスタリング # コサイン係数は関数が無いので自作する cosine.coef <- function(x,y) { a <- sum(na.omit(x * y)) / sqrt( sum(na.omit(x)^2) * sum(na.omit(y)^2) ) return(a) } # making a distance table between columns using uncentered Pearson correlation cosine.table <- function(x) { numberofpoints <- ncol(x) columnnames <- colnames(x) distancetable <- matrix(data = NA, nrow = numberofpoints, ncol = numberofpoints, dimnames = list( columnnames, columnnames ) ) for ( i in 1:(numberOfPoints-1) ) { for ( j in (i+1):numberofpoints ) { v1 <- x[, i] v2 <- x[, j] d <- 1 - cosine.coef(v1, v2) distancetable[i, j] <- d distancetable[j, i] <- d } } } for ( i in 1:numberOfPoints ) { distancetable[i, i] <- 1 } # fill the diagonal return(distancetable) # コサイン係数の距離行列 # cosinedistancetable <- as.dist(cosine.table(as.matrix((dat)))) # 行のクラスタリング rowclusters <- hclust(as.dist(cosine.table(as.matrix((t(dat)))))) # 列のクラスタリング colclusters <- hclust(as.dist(cosine.table(as.matrix((dat))))) # 問 1 解法例 dat <- read.delim(file= /Users/nibb2/Desktop/080106_mutant_group00-04_Pst-aR2_6h_q0.05_ExpRatio_22g.txt, header=true, row.name=1) library(gregmisc) # ユークリッド距離 ( ベクトル間の距離 ) でクラスタリング png(filename=paste("080106_mutant_group00-04_pst-ar2_6h_q0.05_expratio_22g", "_Euclidian.png", sep="")) heatmap.2(as.matrix(dat), trace="none") dev.off() png(filename=paste("080106_mutant_group00-04_pst-ar2_6h_q0.05_expratio_22g", "_cosine.png", sep="")) heatmap.2(as.matrix(dat), Rowv=as.dendrogram(rowClusters), Colv=as.dendrogram(colClusters), trace="none") dev.off() 問 2 データセット _mutant_group00-04_Pst-aR2_6h_q0.05_ExpRatio_22g.txt を使って ユークリッド距離を使って得られたクラスタリング結果がどれだけ頑健な結果であるか leave-one out 法を使って調べなさい 今回は for 関数などを使って計 21 個の leave-one-out 検証した結果のヒートマップを書き その結果を比べなさい # 問 2 解法例 14

15 for (i in 1:ncol(dat)){ LOOdata <- dat[,-i] png(filename=paste("080106_mutant_group00-04_pst-ar2_6h_q0.05_expratio_22g", "_Euclid_", colnames(dat)[i], "-LOO.png", sep=""), width=480*2, height=480*2) heatmap.2(as.matrix(loodata),, trace="none") dev.off() } 注 : ファイルのパスは環境にあわせて変更すること git2014sopen/ex6.txt Last modified: 2014/03/04 20:18 by shige Except where otherwise noted, content on this wiki is licensed under the following license:cc Attribution-Share Alike 3.0 Unported [ 15

16 Genome-based RNA-Seq pipeline (Arabidopsis thaliana) RNA-seq 2D sample (2days dark condition ) 2D2L sample ( 2days light condition sampling duplicate paired-end 101bp pre-processing Arabidopsis thaliana TopHat splice-aware Data Input reads ( ~/data/ky/tophat/ ) condition Dark, rep#1: 2D_1_R1.fastq, 2D_1_R2.fastq condition Dark, rep#2: 2D_2_R1.fastq, 2D_2_R2.fastq condition Dark, rep#3: 2D_3_R1.fastq, 2D_3_R2.fastq condition Light, rep#1: 2D2L_1_R1.fastq, 2D2L_1_R2.fastq condition Light, rep#2: 2D2L_2_R1.fastq, 2D2L_2_R2.fastq condition Light, rep#3: 2D2L_3_R1.fastq, 2D2L_3_R2.fastq Reference Arabidopsis thaliana genome and annotation (Ensembl) igenomes ( /igenomes.html [ ftp://ussd-ftp.illumina.com/arabidopsis_thaliana/ensembl/tair10 /Arabidopsis_thaliana_Ensembl_TAIR10.tar.gz [ftp://ussd-ftp.illumina.com/arabidopsis_thaliana /Ensembl/TAIR10/Arabidopsis_thaliana_Ensembl_TAIR10.tar.gz] Chr4 15.6% genome (genome.fa) (genes.gtf) bowtie2 index (genome.fa.*.bt2) A C G T N a c g t n other Sum_ACGT Sum_acgt Count_All cg_ratio Chr Chr Chr Chr Chr Mt Pt total Software tophat (installed) cufflinks (installed) bowtie2 (installed) samtools (installed) Setup 16

17 Setup environment top_cuff $ mkdir top_cuff $ cd top_cuff Sequence reads less 2D_1_R1.fastq Pre-processing Run tophat TopHat 2D_1_R1.fastq 2D_1_R2.fastq $ tophat -p 4 -G genes.gtf -o 2D_1 genome.fa 2D_1_R1.fastq 2D_1_R2.fastq -p CPU core transcriptome-index bowtie2 index 2 paired-end single read Inspect Results $ ls -l C1_tophat_out/ $ $ ls -la 2D_1 total rw-r--r-- 1 kyamaguc staff :14 accepted_hits.bam -rw-r--r-- 1 kyamaguc staff :14 align_summary.txt -rw-r--r-- 1 kyamaguc staff :14 deletions.bed -rw-r--r-- 1 kyamaguc staff :14 insertions.bed -rw-r--r-- 1 kyamaguc staff :14 junctions.bed drwxr-xr-x 30 kyamaguc staff :14 logs -rw-r--r-- 1 kyamaguc staff :12 prep_reads.info -rw-r--r-- 1 kyamaguc staff :14 unmapped.bam prep_reads.info align_summary.txt less accepted_hits.bam samtools $ samtools view 2D_1/accepted_hits.bam less IGV IGV IGV bam sort indexing 17

18 $ samtools sort accepted_hits.bam accepted_hits.sorted # => accepted_hits.sorted.bam $ samtools index accepted_hits.sorted.bam # => accepted_hits.sorted.bam.bai 1. IGV 2. A.thaliana(TAIR10) 3. File > Load from File accepted_hits.sorted.bam 4. X:1.14kb Statistics ( ) samtools Run cufflinks $ cufflinks -o 2D_1 -G genes.gtf accepted_hits.bam * tophat less -rw-r--r-- 1 kyamaguc staff :14 accepted_hits.bam -rw-r--r-- 1 kyamaguc staff :14 align_summary.txt -rw-r--r-- 1 kyamaguc staff :14 deletions.bed -rw-r--r-- 1 kyamaguc staff :24 genes.fpkm_tracking -rw-r--r-- 1 kyamaguc staff :14 insertions.bed -rw-r--r-- 1 kyamaguc staff :24 isoforms.fpkm_tracking -rw-r--r-- 1 kyamaguc staff :14 junctions.bed drwxr-xr-x 30 kyamaguc staff :14 logs -rw-r--r-- 1 kyamaguc staff :12 prep_reads.info -rw-r--r-- 1 kyamaguc staff :24 skipped.gtf -rw-r--r-- 1 kyamaguc staff :24 transcripts.gtf -rw-r--r-- 1 kyamaguc staff :14 unmapped.bam genges.fpkm_tracking, isoforms.fpkm_tracking 2D_2, 2D_3, 2D2L_1, 2D2L_2, 2D2L_3 6sample Run cuffmerge 18

19 merge gtf assemble.txt ~/top_cuff/2d_1/transcripts.gtf ~/top_cuff/2d_2/transcripts.gtf ~/top_cuff/2d_3/transcripts.gtf ~/top_cuff/2d2l_1/transcripts.gtf ~/top_cuff/2d2l_2/transcripts.gtf ~/top_cuff/2d2l_3/transcripts.gtf cuffmerge $ cuffmerge -p 4 -s genome.fa -g genes.gtf assemblies.txt *genome.fa, genes.gtf merged_asm merged.gtf less Run cuffdiff GTF Run cufflinks, Run cuffmerge cuffdiff -p 4 merged.gtf -o 2D_vs_2D2L \ ~/top_cuff/2d_1/accepted_hits.bam,~/top_cuff/2d_2/accepted_hits.bam,~/top_cuff/2d_3/accepted_hits.bam \ ~/top_cuff/2d2l_1/accepted_hits.bam,~/top_cuff/2d2l_2/accepted_hits.bam,~/top_cuff/2d2l_3/accepted_hits.bam 2D_vs_2D2L Explore the results gene level gene_exp.diff genes.fpkm_tracking tab Excel Excel Q: How many genes are differentially expressed? Q: Scatter plot MA plot Links [ TopHat [ CuffLinks 19

20 Notes Trapnell, C. et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc 7, (2012). git2014sopen/prac_genome_based.txt Last modified: 2014/03/05 14:49 by kyamaguc Except where otherwise noted, content on this wiki is licensed under the following license:cc Attribution-Share Alike 3.0 Unported [ 20

21 de novo RNA-seq pipeline genome sequence に依存しない transcript base の RNA-seq 解析のパイプラインを学ぶ シロイヌナズナを明条件 (L) と暗条件 (D) で育て それぞれ 3 個体から RNA を抽出して 標準的な方法で RNAseq ライブラリを作製し イルミナシーケンサーでシーケンスした ( 片側 76base シーケンス ) 明暗の条件の差で発現の異なる遺伝子を同定したい モデル植物シロイヌナズナはゲノムシーケンスは既知であるが ここではあえてゲノム情報は使わず de novo RNA-seq のアプローチで解析する Data Input reads ( ファイルは ~/data/data/ky/tophat/ にある ) condition Light, rep#1: 2D2L_1_R1.fastq condition Light, rep#2; 2D2L_2_R1.fastq condition Light, rep#3; 2D2L_3_R1.fastq condition Dark, rep#1; 2D_1_R1.fastq condition Dark, rep#2; 2D_2_R1.fastq condition Dark, rep#3; 2D_3_R1.fastq 本来は read quality check and cleaning を行なうべきであるが 上記シーケンスデータは処理済み Overview 戦略 1. de novo assembly to build transcriptome reference tool: Trinity 2. mapping reads to transcriptome reference tool: bowtie2 3. abundance estimation tool: express 4. differential expression analysis tool: edger 5. annotation of reference sequences tool: blastx Setup practice_denovo ディレクトリを作製し 以降の解析はそのディレクトリの下で作業しよう $ mkdir practice_denovo $ cd practice_denovo Sequence reads 解析に使うシーケンスデータをカレントディレクトリにコピーする オリジナルは ~/data/ky 21

22 /tophat/ にある $ cp ~/data/ky/tophat/*_r1.fastq./ Tops: 6 つのファイルをひとつひとつコピーしても良いが ワイルドカードを使うと便利 Read QC and pre-precessing 本来は read quality check and cleaning を行なうべきであるが 上記シーケンスデータは処理済み ( 参考 ) QC のためのソフトウェア : FastQC, Low quality base trimming, adaptor trimming を行なうためのソフトウェア : cutadapt, de novo assembly Trinity で de novo assembly を行なう ただ この実習では行なわない (Trinity は Mac をサポートしていないこと ハイスペックのマシンを要すること 時間がかかること やや高度なインフォマティクススキルを要すること が理由 ) ( 参考 ) Trinity を実行する例 input read の準備 $cat 2D2L_1_R1.fastq \ 2D2L_2_R1.fastq \ 2D2L_3_R1.fastq \ 2D_1_R1.fastq \ 2D_2_R1.fastq \ 2D_3_R1.fastq \ > seq_all.fq 実行ファイル run_trinity.sh の作製 run_trinity.sh!/bin/sh #=== configu === SEQ=seq_all.fq OUT=trinity_out MIN_KMER_COV=1 NCPU=24 JM=256G #=== TRINITY_BASE=~/bio/Applications/trinityrnaseq_r ulimit -s unlimited 22

23 $TRINITY_BASE/Trinity.pl \ --JM $JM \ --seqtype fq \ --min_kmer_cov $MIN_KMER_COV \ --single $SEQ --CPU $NCPU \ --output $OUT \ コマンドラインから実行 $ sh run_trinity.sh 今回は transcripts.fa を de novo assembly の結果得られたコンティグシーケンスセットとして解析を進める transcripts.fa は以下からダウンロードしてください [ /git2014s/transcripts.fa.gz] Mapping bowtie2 を使ってリードを transcripts.fa にマッピングする まずは reference を indexing. $ bowtie2-index transcripts.fa transcripts マッピング ( 例 ) $ bowtie2 -x transcripts -U 2D_3_R1.fastq -p 8 -a -S 2D_3_R1.sam point: -a オプション express で mutihit を考慮した abundance estimation を行なうために必須 もしくは -k オプションを使う ここでは 2D_3_R1.fastq を mapping して その結果を D3.sam に保存している 6 つのファイルすべてで同様の処理を行なう 結果ファイルは自分なりにルールを決めて規則正しく命名するとよい 今回は 2D_3_R1.fastq => 2D_3_R1.sam 2D2L_1_R1.fastq => 2D2L_1_R1.sam... のルールで sam ファイルを生成しよう 2D2L_1_R1.sam 2D2L_2_R1.sam 2D2L_3_R1.sam 2D_1_R1.sam 2D_2_R1.sam 2D_3_R1.sam の 6 つのファイルができるはず Abundance estimation express を使って abundance estimation をおこなう ( 例 ) 23

24 $express transcripts.fa -o 2D2L_2_R1 2D2L_2_R1.sam 上の場合 2D2L_2_R1.sam の解析結果が 2D2L_2_R1 ディレクトリ以下に保存される その中の results.xprs にカウントデータが格納されている results.xprs の中身をみてみよう results.xprs の est_counts カラムを以下のedgeR 解析に使う 各 results.xprsのest_countsのカラムだけ抽出してひとつのテーブルにまとめたい そのためには簡単なプログラミングが必要である 今回は 以下のRuby scriptで処理してください download merge_express_result.rb [ /merge_express_result.rb] (show code) ( 使い方 ) $ruby merge_express_result.rb directory1 directory2 directory3... ( 例 ) $ruby merge_express_result.rb 2D2L_1_R1 2D2L_2_R1 2D2L_3_R1 2D_1_R1 2D_2_R1 2D_3_R1 > expr_est_count_ 上の例では マージしたテーブルを シェルのリダイレクトの機能を使って expr_est_count_merged.txt に保存している 中身は以下のとおり #=== express Summary Table === # # source: # 2D_1_R1/express_out/results.xprs # 2D_2_R1/express_out/results.xprs # 2D_3_R1/express_out/results.xprs # 2D2L_1_R1/express_out/results.xprs # 2D2L_2_R1/express_out/results.xprs # 2D2L_3_R1/express_out/results.xprs # target column: 6 # script: merge_express_result.rb # date: Tue Mar 04 14:06: # # id 2D_1_R1 2D_2_R1 2D_3_R1 2D2L_1_R1 2D2L_2_R1 2D2L_3_R Differential expression analysis 複雑な統計計算で発現変動解析をあれこれ行なう前に 得られたカウントデータの概要を把握しておくことが大事 エクセルにインポートしてデータをながめてみよう R にインポートしてデータをながめてみよう data import > dat <- read.delim("expr_est_count_merged.txt", comment="#", head=f, row.name=1) > libs <- c("d1", "D2", "D3", "L1", "L2", "L3") > colnames(x) <- libs > dim(d) [1] > colsums(d) D1 D2 D3 L1 L2 L3 24

25 scatter plot > plot(x$d1+1, x$d2+1, log="xy") > pairs(x+1, log="xy") MA plot 同一 condition 内のサンプルのばらつきに比べて Dark vs Light 間のデータのばらつきほうが大きいことが確認できるだろう edger による differential expression analysis > library(edger) >group <- c("d", "D", "D", "L", "L", "L") > D <- DGEList(dat, group=group) # import table into edger > D <- calcnormfactors(d, method="tmm") # TMM normalization > D$samples group lib.size norm.factors D1 D D2 D D3 D L1 L L2 L L3 L >D <- estimatecommondisp(d) # estimate common dispersion > D$common.dispersion [1] >D <- estimatetagwisedisp(d) # estimate tagwise dispersion > summary(d$tagwise.dispersion) Min. 1st Qu. Median Mean 3rd Qu. Max >de <- exacttest(d, pair=c("d", "L")) >toptags(de) # significance test to find differentially expressed genes # view the most significant genes edger 解析結果のファイルへの書き出し # dump normalized count data > D.cpm.tmm <- cpm(d, normalized.lib.size=t) > write.table(d.cpm.tmm, file="cpm.tmm.txt", sep="\t", quote=f) # dump DE analysis result > tmp <- toptags(de, n=nrow(de$table)) > write.table(tmp$table, "de.txt", sep="\t", quote=f) このコードで normalized countデータ cpm.tmm.txt DE significance de.txt に保存される ( 補足 :edgerに含まれる便利なコマンド) plotsmear: edgerに含まれるma 描画ツール 25

26 de.names <- row.names(d[decidetestsdge(de, p.value=0.01)!=0, ]) plotsmear(d, de.tags=de.names) plotmds: MDS plot を行なうと ライブラリ間の発現パターンの類似性をおおざっぱにとらえることができる plotmds(d) DE 解析結果の吟味 de.txt を MS Excel や R を使って 吟味しよう Q1: differentially expressed genes は何個あるか? q-valueを0.01, 0.05の閾値に設定したときで数値はどうかわるか? Q2: Q1 のうちDarkで有意に上がっている遺伝子 Lightで有意に上がっている遺伝子にわけるとそれぞれ何個ずつか? Q3: 上位の遺伝子はどのような遺伝子か 現時点ではIDと配列しかわからないので BLASTサーチをしてみよう ( 参考 ) Q2に答えるためには edger command decidetestsdgeも便利 > summary(decidetestsdge(de.tagwise, p.value=0.05)) [,1] Quick annotation using BLAST transcripts.fa は ID とシーケンス情報しかないので それぞれがどのような遺伝子をコードしているかは不明であり アノテーションを行なう必要がある BLAST による相同性検索はおおまかなアノテーションを行なうのに便利な手法である ここでは シロイヌナズナのタンパク質データベースを検索することにより 各コンティグがシロイヌナズナのどのタンパク質に対応するかを調べる 今回は シロイヌナズナのシーケンスが query となるので シロイヌナズナのタンパク質データベースに対して検索をかけるとほぼ 100% ヒットする 非モデル生物の de novo RNAseq では de novo アセンブリで得られたコンティグを query に モデル生物のタンパク質データベースや nr データベースに対して検索をかけることになる シロイヌナズナのタンパク質アミノ酸配列セットを取得する ftp://ftp.arabidopsis.org/home/tair/sequences/blast_datasets/tair10_blastsets /TAIR10_pep_ _updated [ftp://ftp.arabidopsis.org/home/tair/sequences/blast_datasets /TAIR10_blastsets/TAIR10_pep_ _updated] $ makeblastdb -in TAIR10_pep_ _updated -dbtype prot -parse_seqids # build blastdb ( 検索例 ) blastx -query transcripts.fa -db TAIR10_pep_ _updated -num_threads 8 -max_target_seqs 1 \ -evalue 1.0e-8 -outfmt 6 > transcripts.blastx.tair10.txt 上の例では トップヒットだけをテーブル形式で出力している これで transcripts.fa の ID と coding gene の対応がとれた 26

27 Compile results model 生物の場合 大半の遺伝子に詳細なアノテーションがついているので それらの情報と紐づけするとさらに利便性は上がる シロイヌナズナの場合 各遺伝子の functional annotation は以下のファイルにまとめられており TAIR のウェブサイトからダウンロードすることができる ftp://ftp.arabidopsis.org/home/tair/genes/tair10_genome_release /TAIR10_functional_descriptions [ftp://ftp.arabidopsis.org/home/tair/genes /TAIR10_genome_release/TAIR10_functional_descriptions] これらの DE analysis, annotation data, をひとつのテーブルにまとめると 見やすく またさらなる下流解析を行なうのにも便利である その処理には簡単なプログラミングが必要である 今回は compile_results.rb を使って下さい 使い方 download compile_results.rb [ (view source) $ruby compile_results.rb > result_merged.txt 結果を MS Excel で吟味しよう Dark vs Light でどのような遺伝子が変動するか biological interpretation が可能になったはず git2014sopen/prac_denovo.txt Last modified: 2014/03/05 21:06 by shige Except where otherwise noted, content on this wiki is licensed under the following license:cc Attribution-Share Alike 3.0 Unported [ 27