第11回臨床遺伝情報検索講習会

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あまめひがき
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1 2016 年ジェネティックエキスパート認定試験の体験談 2017 年 6 月 11 日第 11 回臨床遺伝情報検索講習会国立研究開発法人国立がん研究センター研究所基盤的臨床開発研究コアセンター臨床ゲノム解析部門中央病院遺伝子診療部門牛尼美年子 1. バックグラウンド ( 遺伝性腫瘍の遺伝学的検査に従事 ) 2. ジェネティックエキスパート認定試験に向けて #1

2 国立がん研究センター中央病院遺伝相談外来 ( 水木曜日 ) 発端者血縁者遺伝カウンセリング遺伝学的検査サーベイランス等栃県がんセンター研究所浜松医科学 SRL ファルコバイオシステムズ ( 部の遺伝学的検査業務等 ) #2

3 外来受診者数と遺伝学的検査数 (2017 年 3 月 31 日現在 ) [ 受診者 ] [ 受検者 ] 発端者縁者発端者縁者年末までの受診者累計は 1167 家系 1,699 名約 64%(1091 名 ) に遺伝学的検査を実施 (2000 年 6 以降の集計 ) 年目 (1998FY) 2 年目 (1999FY) 3 年目 (2000FY) 4 年目 (2001FY) 5 年目 (2002FY) 6 年目 (2003FY) 7 年目 (2004FY) 8 年目 (2005FY) 9 年目 (2006FY) 10 年目 (2007FY) 11 年目 (2008FY) 12 年目 (2009FY) 13 年目 (2010FY) 14 年目 (2011FY) 15 年目 (2012FY) 16 年目 (2013FY) 17 年目 (2014FY) 18 年目 (2015FY) 19 年目 (2016FY) 主な疾患受診者受検者 (%) リンチ症候群 (Lynch) (77) 網膜芽細胞腫 (RB) (61) 遺伝性乳がん卵巣がん (HBOC) (63) 家族性腸腺腫症 (FAP) (68) 上記以外の遺伝性腫瘍 ( 疑い含 ) (58) 年 HBOCファルコ受託研究 2009 年 9 位内視鏡からのMSI 検査開始 2011 年 9 RB 先進医療検査開始 ( 認可 2009 年 ) 2013 年 5 頃 Angelina Jolieさんの報道 2013 年 12 卵巣がん治験開始 2014 年 9 乳がん治験開始 2015 年 5 NCC oncopanel FC v1.0 開始 #3

4 網膜芽細胞腫に対する遺伝学的検査実施 Blood sampling DNA RNA extraction 1 日 DNA 2 日 FISH PCR/Direct sequencing 2 日 RNA RT-PCR direct sequencing Positive Negative Positive Negativ e Positive Negative Direct sequencing Negative cases (incl. SNP) Positive Check other test results MLPA 2 日 Negative Mutation identified (Mosaic) Check DNA test results (including MLPApositive ) Mutation identified Mutation identified Mutation identified Check other test results No pathogenic mutation identified 13q , >180kb, 27 exons (31~1,889bp) and 26 introns (80~71,712bp). 5ʼ P ʼ 4.7kb mrna coding a protein with 928 amino acid residues. Ex1 ~ Ex8 Ex6 ~ Ex16 Ex10 ~ Ex18 Ex17 ~ Ex23 Ex21 ~ 3ʼ : Regions analyzed #4

5 FAP に対する遺伝学的検査実施 APC gene ; 5q21 q22, >180kb,CDS 8532bp Based on accession number ; CDS NG_ PTT 3 日 (Protein Truncation Test) PTT 陽性 ( 異常バンドの検出 ). PT2 Sangar 法 RT PCR/direct sequencing PT3 T A A A T T A T C A T C T T PT4 PT5 PT6 dhplc(wave) PT7 PTT(+) 対象領域の RT PCR 2 日 direct sequencing Genomic DNA 2 日 direct sequencing MLPA MLPA 2 日 #5

6 HBOC, LS, FAP, RB 以外の遺伝性腫瘍疑いの外来受診者数と遺伝学的検査数 (2017 年 3 月 31 日現在 ) 25 NGS 導 [ 受診者 ] [ 受検者 ] 発端者縁者発端者縁者年目 (1998FY) 2 年目 (1999FY) 3 年目 (2000FY) 4 年目 (2001FY) 5 年目 (2002FY) 6 年目 (2003FY) 7 年目 (2004FY) 8 年目 (2005FY) 9 年目 (2006FY) 10 年目 (2007FY) 11 年目 (2008FY) 12 年目 (2009FY) 13 年目 (2010FY) 14 年目 (2011FY) 15 年目 (2012FY) 16 年目 (2013FY) 17 年目 (2014FY) 18 年目 (2015FY) 19 年目 (2016FY) [2015 年 4 以降その他の遺伝性腫瘍疑いで検査を受けたの内訳 ] *LFS or HBOC/CS or HBOC の重複 3 若年性腸がん 10 名リフラウメニ症候群 (LFS)5 名カウデン症候群 (CS) 4 名家族性膵がん 3 名若年性膵がん若年性多発腸腺腫遺伝性びまん性胃がん (HDGC) 胃腺がんおよび近位胃ポリポーシス (GAPPS) 脂肪腫唾液腺がん (Salivary grand cancer) 肝多発管筋脂肪腫 VHL LS or HBOC #6

7 遺伝性腫瘍探索のための NGS:NCC oncopanel FC A:Other genes being tested at NCCH APC(E1, promoter) MET B:ACMG (Cancer) POLE AXIN1 MUTYH RB1 (promoter) AXIN2 NF1 TP53 CDH1 PMS2 VHL MEN1 POLD1 BRCA1 NF2 SDHD BRCA2 PTEN STK11 MLH1 RET TGFBR2 MSH2 SDHAF2 TSC1 MSH6 SDHB TSC2 NBN SDHC WT1 D74 C:15 B:18 A: 遺伝 (v1.0) 147 遺伝 (v2.0) C: NCCN guidelines(colorectal, Gastric, Breast-Ovarian and Pancreatic cancers) ATM EPCAM PRKAR1A BARD1 FANCC RAD50 CDK4 FANCG RAD51B CHEK1 MRE11A RAD51C CHEK2 PALB2 RAD51D D: OMIM CGC (germline), Illumina TruSight Cancer, etc. 46,000, average depth=400 HiSeq 2500 Rapid Mode, 96 samples/run 80,000, average depth=300 MiSeq, 6 samples/run 53,000, average depth=1000 NextSeq, 24 samples/run Reagents for capture, library construction and NGS run only. Cost for other general consumables, human resource, equipment maintenance and bioinformatics not included. #7

8 Agilent, SureDesign によるプローブのカスタム version1.0 解析範囲条件 Coding エクソン+UTRs+5ʼUTR+3ʼUTR ( イントロン25 塩基を含む ) 121 遺伝 (123 ターゲット ) 2262regions/24767probes プローブサイズ 891kbp #8

ターゲットエンリッチメントシステム (Capture Sequence) 150ng gdna をコバリスで断片化 Agilent,SureSelect アダプタ付き DNA 断片 (500ng) ハイブリダイゼーションバッファービオチン化 crna の Baits (120base) Illumina

9 ターゲットエンリッチメントシステム (Capture Sequence) 150ng gdna をコバリスで断片化 Agilent,SureSelect アダプタ付き DNA 断片 (500ng) ハイブリダイゼーションバッファービオチン化 crna の Baits (120base) Illumina MiSeq:150base PE 溶液中で 24 時間ハイブリダイゼーションストレプトアビジン磁性ビーズ HiSeq 2500:Rapid Run 100base PE NextSeq :150base PE キャプチャーされた DNA だけを回収濃縮増幅サイズ確認と定量後シークエンシングへ #9

S996N nonsynonymous HGMD HGVD,ToMMo,NCC 下記のいずれかを満たす Variant のみが出されるアミノ酸置換がSplicing Frameshift Stopgain Stoplossである ClinVar

10 Clinical Sequencing Data Analysis Integrator (csdai) みずほ情報総研株式会社とNCCの共同開発のシークエンスのQC 解析バリアント毎のアノテーションレポート (CSVファイルとPDFファイルで出 ) 機能をもつアプリケーション CSV file Variant position AA substitution on reference Gene Clin Var COSMIC dbnsfp APC:NM_000038:exon16:c.2987G>A:p.S996N nonsynonymous HGMD HGVD,ToMMo,NCC 下記のいずれかを満たす Variant のみが出されるアミノ酸置換がSplicing Frameshift Stopgain Stoplossである ClinVar においてPathogenic / Likely pathogenic / Drug responseの登録がある COSMICに登録がある HGMDにおいてDM / DM? としての登録がある dbnsfp の予測においてつでもDeleterious 判定がある #10

11 臨床遺伝情報検索講習会の受講病的原因と考えられる可能性のある Variant/ 変異が検出されても容易に判断が出来ない co.jp/gene/index.html テーマ : CNV 評価時のポイントがん関連遺伝情報検索 COSMIC 遺伝バリアントの表記法遺伝性腫瘍次世代シークエンサーによる単遺伝性疾患の遺伝解析の実際と注意点について等 #11

12 ジェネティックエキスパート試験の受検 #12

jp/ OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man):

13 頻繁に参考とした WEB サイト ( 臨床について ) GeneReviews 本語版 : OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man): 本類遺伝学会染体異常をつけたら : ex.html #13

14 頻繁に参考とした WEB サイト (Variant について ) HGMD (The Human Gene Mutation Database) k/ac/index.php OMIM ClinVar External links #14

15 その他に参考とした WEB サイト TOGO TV 命科学系データベースの使い部科学省統合データベースプロジェクトバイオサイエンスデータベースセンターテーマ : Ensembl の使い配列を取得する UCSC genome browser の使い NCBI BLAST の使い等 #15

16 その他の講習会家族性腫瘍学会家族性腫瘍セミナー遺伝演習基礎 ( 家系図作成等 ) がん遺伝学総論遺伝カウンセリング概論臨床各論倫理ロールプレー遺伝統計 ( 遺伝学的リスク評価等 ) 近畿学主催 #16

17 医療に役つ遺伝関連 Web 情報検索とりとり教えますガイド中智祥著メディカルサイエンスインターナショナルトンプソン & トンプソン遺伝医学 ( 現在第 2 版 ) 福嶋義光監修メディカルサイエンスインターナショナルその他に参考とした書籍 #17

18 がんの遺伝学的検査に従事まとめ次世代シークエンサーの導により検出されてくる Variant 情報の判断およびデータを解釈するための情報収集の仕バイオインフォマテックスの学習の必要を感じる臨床情報検索講習会を受講体系的に学習ができ仕事に直結ジェネティックエキスパート受験到達標は試験のための勉強というより知るべきであろう要件過去の講習会の資料を基に実際に DB を使ってみる解析法については実際にを動かしたり排出されるデータをないとイメージがつかめなった 1 の研究者医師だけの知識ではまかないきれない情報量 DB は多数存在するがソースの重複も多く探索の Gold standard を要望ゲノム情報 (Variant) だけで判断出来ず診療情報の重要性情報の更新蓄積管理の重要性つつの遺伝 Variant の基礎研究機能解析の知も切 #18

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IonTorrentPGM_appnote_0319.indd Ion PGM Heterogeneity * 1 * 1 * 2 * 2 * 2 * 2 * 2 * 1 *1 * 2 DNA DNA DNA ArcturusXT LCM Laser Capture Microdissection LCM A Workflow for Cancer Profiling Applied Biosystems ViiA7 PCR qpcr QC Assay Ion