Troubleshooting Nextera Sample Preparation

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1 Nextera/Nextera XT サンプル調製キットの使用法とトラブルシューティング 酒井名朋子 Sr. Technical Applications Scientist イルミナ株式会社 2011 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, illuminadx, BeadArray, BeadXpress, cbot, CSPro, DASL, Eco, Genetic Energy, GAIIx, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, Infinium, iselect, MiSeq, Nextera, Sentrix, Solexa, TruSeq, VeraCode, the pumpkin orange color, and the Genetic Energy streaming bases design are trademarks or registered trademarks of Illumina, Inc. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners.

2 Outline Nextera/Nextera XT でのサンプル調製のながれ Library のトラブルシューティング 2

3 3 Nextera/Nextera XT でのサンプル調製のながれ

4 Nextera キット : Streamlined Library Preparation 1-5 µg ~ 2 days 50 ng/1ng ~ 2 hours Nextera 4

5 TruSeq DNA?Nextera?Nextera XT? どのキットを使用するか DNAの量で決定する DNAを1ug 準備でき Covarisをおもちの場合 => TruSeq DNA キット DNA が少量の場合 Covaris 等の断片化装置をおもちでない場合 50ngある場合 =>Nextera キット 1ng 程度ある場合 =>Nextera XTキット DNA の由来で決定する Human などの Genome サンプルをおもちの場合 =>TruSeq DNA または Nextera キット PCR Amplicon, 微生物などの Genome サンプルをおもちの場合 =>Nextera XT キット 5

6 ご準備いただくサンプル調製キットと Seq Primer サンプル調製に必要なキット Nextera Nextera XT Sample prep kit Nextera DNA Sample Preparation Kit 96 samples/ FC samples/ FC Nextera XT DNA Sample Preparation Kit 96 samples/ FC samples/ FC Index Primer kit Nextera Index Kit 96 Indices/ FC Indices/ FC Nextera XT DNA Sample Preparation Index Kit 96 Indices/ FC Indices/ FC MiSeqでのRunにはソフトウェアのUpgrade 追加 Seq Primerは不要 GA, HiSeqでDual Index Runを行うには >SCS2.10 または >HCS1.5 TruSeq Dual Index Sequencing Primers Single Read Run FC Paired End Run PE

7 Index for Nextera and Nextera XT Nextera FC /1012 Nextera XT FC /1002 Index kit の Swap は不可 7

8 Nextera と Nextera XT ワークフローの違い Sample Input Tagmentation Clean Up PCR AMPure Normalization Nextera では Zymo filter を使用 Nextera XT ではバッファーで中和 Nextera XT のみ 8

9 ご準備いただくサンプル Nextera 50ng の input DNA Best Practice Input DNAを正しく定量する Pico GreenやQbitなど Input DNAの260/280= であること Pipet のCalibrationを行う 300bp 以上の断片であること 両端 50bpのCoverageが落ちる Nextera XT 1ng の input DNA DNA 原液を測定後 0.2ng/uL になるように希釈 Sample Input Tagmentation Clean Up PCR AMPure Normalization 9

10 Tagmentation Nextera と Nextera XT 共通 55C にて 5 分間 Incubate transposomes gdna Best Practice 反応中のThermocyclerの温度が正しいこと 蓋も加温する Tagmentation 終了後 10CでHold している間もTamentationは進んでいる ただちに次のStep に移行 Sample Input Tagmentation Clean Up PCR AMPure Normalization 10

11 Clean Up Nextera Zymo 精製キットにて Clean Up 50uL の Tagmentation Reaction Mix を 25uL に溶出 Nextera XT Buffer にて中和 20uL の Tagmentation Reaction mix に 5uL の NT buffer を足す Best Practice なるべく新しく調製した EtOH 入り Zymo Wash Buffer を使用すること (EtOH が古いと Transposome が残り PCR を阻害する ) Bioanalzyer で Tagmentation 反応による断片サイズを確認する (150-1Kbp) ろかは必ず x1300g で行う (Yield が減る場合があります ) Sample Input Tagmentation Clean Up PCR AMPure Normalization 11

12 PCR Amplification -IndexPrimerkit は Nextera と NexteraXT で異なる Nextera PPC および Index Primer の 2 セットの Primer を使用する PCR 反応は 5Cycle Nextera XT Index Primer のみ使用する Reaction は Nextera と同じ PCR 反応は 12Cycle Sample Input Tagmentation Clean Up PCR AMPure Normalization 12

13 参考 )Index 配列の選択 Index を選択される場合には事前に IEM でサンプルシートを作成し Index の組み合わせの確認をお勧めします 1 サイクルに G/T から 1 チャンネル A/C から 1 チャンネルの最低 2 種類の塩基が存在する必要がある 13

14 AMPure ビーズを使用した Clean Up Nextera, NexteraXT に共通 精製およびサイズセレクションの役割 PCR 後に生成する 68bp 程度の Primer Dimer を除去する Nextera XT Input DNA のサイズを示している Sample Input Tagmentation Clean Up PCR AMPure Normalization 14

15 Normalization Nextear XTのみ NexteraにNormalization Stepは存在しないビーズを使用したDNAの量のNormalization( サンプル間での量の均一化 ) MiseqでのRunに適切な量にNormalizeされる Normalize 後のサンプルはssDNA Nextera XT サンプルを GA, HiSeq で流す場合 : Normaraization のステップを Skip し qpcr で定量ののち Cluster Generation に進む Sample Input Tagmentation Clean Up PCR AMPure Normalization 15

16 Nextera と Nextera XT の違い Nextera DNA Nextera XT サンプルの種類 Whole Genome Small Genome/ Amplicon Input DNA 量 50ng 1ng Tagmentation 50uL rxn volume 20uL rxn volume Zymo filterでの精製 Yes No (neutralization) PCR Yes (5 cycles) Yes (12 cycles) AMPureでのClean Up Yes (0.6x) Yes (0.6x, 1.8x) Normalization No Yes 16

17 17 Library のトラブルシューティング 1.Under tagmentation 2.Over tagmentaion 3.Library がなくなる 4.60bp 程度の Library のみ存在する

18 1.Tagmentation がうまくいかない (Under Tagmentation) Sample input = 50ng Trace of final library Sample input > 50ng Trace of final library できた Library のサイズが Example より大きい Input DNA の量が多い場合 Tagmentation 反応が進まず断片が大きくなる 解決法 Input DNAの定量が正しいか再確認 Input DNAを半分以下に減らしてみる Tagmentation 反応時間の延長はお勧めしません このままClusteringに進む Insertサイズは大きくなりますがClusteringは可能です (~1000bp 程度 ) 18

19 2.Tagmentation がうまくいかない (Over Tagmentation) Sample input = 50ng Trace of final library Sample input < 50ng Trace of final library できた Library のサイズが Example より小さい Input DNA の量が少ない場合 Tagmentation が進みすぎる 解決法 Input DNAの定量が正しいか再確認 このままClusteringに進む 19

20 3.Library がなくなる Nextear で Library 調製後 Bioanalyzer で Library のトレースが存在しない 精製ステップで失っている可能性がある PCR Primer を正しく使用していない (Index Primer kit を使用していない ) 解決法 どのステップでサンプルが失われたかを確認する Tagmentation 後のZymo Clean Upのステップ ( bp) AMPureビーズでの精製後それぞれのステップでBioanlayzerにサンプルを流して存在を確認 Zymo Clean Upの場合 Zymoプレートは乾燥した場所に保管する X1300gでSping Downする RSB 添加後のEluteを捨ててしまっていないか確認する AMPureビーズの場合 推奨のビーズスタンドを使用する 80%EtOHを用事調製する Index Primer kitの使用を確認 20

21 4.60bp 程度の Library のみ存在する 60bp 程度の Library のみ存在する Zymo Clean Upのステップでサンプルが失われ PCRでPrimer Dimerのみ生成される PCR 反応がうまく進んでいない 解決法 3. で示した方法でZymo Clean Upのステップを確認 Transposome がZymo Clean Upのステップでのぞききれず PCR 反応が阻害される 用事調製したWash Bufferを使用 正しいPCR Primerを使用したかどうか確認する ThermoCyclerの動作を確認 21

22 22 ご質問はございませんでしょうか? でも承っております

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