ADVIA120 未来のかけ橋

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1 動物血測定および解析上の問題点を踏まえて シーメンスメディカルソリュションズ ダイアグノスティックス株式会社 秋葉俊一

2 秋葉俊一経歴 1948 年 10 月 29 日北海道余市生まれ 有名人との関係 宇宙飛行士の毛利さんと同じ学年で 同じ小学校余市黒川小学校 学歴 昭和 44 年 北里衛生科学専門学院 昭和 52 年 東京理科大学化学科 職歴 昭和 44 年 東京女子医大第二病院 血液検査 昭和 51 年 東京医学技術専門学校 血液検査教務主任 昭和 63 年 コールター株式会社 学術部長 平成 11 年 シーメンスヘルスケアダイアグノスティックス株式会社 研究歴 昭和 50 年 千葉大学血液内科 血液検査 昭和 53 年 帝京大学血液内科 蛇毒の研究

3 代表的血球計数測定理論 電気抵抗法 1956 年コールター社 光学的測定法 1969 年テクニコン社 I( 定電流 ) = V ( 電圧 ) R( 抵抗 ) S =F(λ,α,τ,φ,β) S : 散乱光量 λ: 使用波長 α: 屈折率 τ: 容積 φ: 観測角度 β: 形状因子 I( 定電流 ) = V ( 電圧 ) R( 抵抗 ) 低角度散乱光 高角度散乱光 レーザー光 670nm

4 電気抵抗法 コールター理論

5 コールターカウンター 1956 年開発 モデル A 型 モデル B 型

6 電気抵抗式 ( コールター社 ) 測定部例のイメージ 電気抵抗法 I( 定電流 ) = V ( 電圧 ) R( 抵抗 ) I( 定電流 ) = V ( 電圧 ) R( 抵抗 )

7 血球の容積パルスとその扱い

8 血球の取り扱い 同時通過があった場合は 1 個と算定 同時通過パルスはヒストグラムから除外 パルス高は血球サイズに比例 血球は計測部に入ると計測部に入ると形状変化が生ずる

9 光学検知法 テクニコン測定法

10 Mie 理論 ミー散乱理論とは均質球形の粒子に太陽放射が入射し その粒子 1 個あたりの面積と粒子の幾何学的な断面積の比を求める理論です この理論は粒子の大きさと複素屈折率に依存し 以下の式で表すことができます ミー散乱は波長が粒子サイズより小さい場合に限定されます 光の波長に対して相対的な粒子の大きさが大きくなると前方散乱が後方散乱に比べて急激に増大します

11 テクニコン SMA4A テクニコン社で最初に開発されたオートアナライザー 1969 年に生化学分析装置の測定形式 ( コンティニュアスフローシステム ) と同一形式で測定 光学的検知法を利用し RBC WBC Hgb Hct を測定 SMA4A

12 Siemens Hematology の歴史 SMA 4A/7A

13 Siemens Hematology の歴史 2120i Technicon H*1E System ADVIA 120 CSF assay Technicon H*2 System

14 FCM の適用領域 血球細胞 ( 白血球 赤血球 血小板など ) 動物細胞 ( 培養細胞 単離組織など ) 植物細胞 微生物 ( 細菌 原虫など ) 海洋生物 ( プランクトンなど ) 精子 酵母など ラッテクスビーズ BD 社 FACSCanto II

15 細胞の流れの規則性 シースは刀のサヤを意味 フローセルの中心部に細胞を流すための強制流路 泡などの不規則性のない流 ( 層流 ) シースあり シースなし シースなし シースあり 容積 容積

16 通過位置とシグナル フローセルの通過位置によってシグナルは異なる 0.5mV 0.8mV 1.0mV

17 レーザー光 (LASER)( レーザーとは Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation の略 光散乱が少なく直進性が高い ガスレーザー ( ヘリウムネオン ) エネルギーは強いが熱を持つ 寿命は短い 半導体レーザー 簡易なレーザーで 製造が安価でできるため大半の装置が採用している

18 LASER 応用 産業応用 IT ナノテク 半導体プロセッサー CD, DVD, 複写機 情報 通信の高速 大容量化光通信 光コンピューティング 生体 ( 医療 ) 歯科治療 手術 ( レーザーメス ) 視力矯正 (LASIK) あざ しみ治療 脱毛 臨床検査測定装置

19 レーザー光の特性 ( 指向性と単色性 ) 指向性 レーザー光は 細いビームになっていて 反射や屈折をさせない限り ほとんど一直線に特定の方向のみへ進む ( 平行光線 ) レンズ等を用いて小さく絞れる 単色性 各種のレーザー光は それぞれある特定の波長のみを含み その波長は時間的に一定である 一般的光源 レーザー光源

20 レーザー散乱光の種類 Forward Scatter シグナル量が多い 回折光 Diffraction Side Scatter シグナル量が少ない 屈折光 Refraction 反射光 Reflection Mie 理論 : 光が粒子 ( 細胞 ) に当たる際に発生する散乱光量は以下の要素の関数である S =F(λ,α,τ,φ,β) S : 散乱光量 λ: 使用波長 α: 屈折率 τ: 容積 φ: 観測角度 β: 形状因子

21 レーザー散乱光の種類と特徴 前方散乱光 :FS レーザー光の軸に対して前方向に散乱する光 (Forward Scatter;FS) 細胞表面積にほぼ比例 側方散乱光 :SS レーザー光の軸に対して約 90 の角度で散乱する光 (Side Scatter;SS) 顆粒や核等で生じるレーザー光の散乱光 前方散乱光と比べて はるかに微弱な光 蛍光 :FL 蛍光色素がレーザー光により励起され エネルギーの一部を吸収し 残りの光エネルギーを蛍光 (Fluorescence;FL) と呼ぶ 使用する蛍光色素により蛍光波長が異なる 例 : モノクローナル抗体に結合した FITC と呼ばれる蛍光色素は 近の緑色の蛍光を発光するが この蛍光の強度は 細胞における特定の抗原の量を示す

22 血球容積の変化を生じない球状化処理球状化処理 硫酸ドデシルナトリウム (SDS) EDTA2 水酸化 2 ナトリウム EDTA2 水酸化 4 ナトリウム塩化ナトリウムグルタルアルデヒド緩衝液 破砕赤血球球状赤血球楕円赤血球鎌状赤血球 標的赤血球涙滴赤血球有棘赤血球非薄赤血球

23 同容積球状化の正当性の正当性の根拠 1983 Kim,Y.R. らの発表から

24 同容積の球状化の根拠 ( 放射性ヨウ素標識アルブミン実験 ) 放射性ヨウ素標識アルブミン I 125 使用 1983 Kim,Y.R. らの発表から

25 RBC シグナル取得検出のイメージ 高角度散乱光 AMP シグナル処理 レーザー光源 670nm 低角度散乱光 低角度散乱光(細胞容積)高角度散乱光 ( 細胞複雑度 )

26 低角度RBC サイトグラム表示 ヘプタン 炭素数 7 21g/dL (2-3 度)ノナン 炭素数 9 29g/dL ドデカン 高角度 (5-15 度 ) 炭素数 12 37g/dL

27 赤血球数とトリミング処理 同時通過補正をするための処理 Y X RBC 数

28 色素性色素RBC 直交展開図 ( 健常者 ) RDW (fl) 大球性低小球性 性赤血球容積 ( 平均 :MCV) 高28 41 (g/dl) HDW 赤血球ヘモク ロヒ ン濃度 ( 平均 :CHCM)

29 各メーカーの RBC/PLT 測定系概要 Coulter Sysmex Siemens Abbott 希釈倍率 検出法電気抵抗電気抵抗光学検知電気抵抗 R/P 分別法 フィッティング法 バレーサーチ法 固定法 バレーサーチ法 流路制御 再カウント防止機能 シース法 シース法 再カウント防止機能 データ参照 :Modern Hematology Analyzers

30 赤血球系の生物的視点

31 人血と動物血の違い 細胞容積 血球サイズの違いはどんな意味を持つのか? 容積が小さくなると 体積当りの表面積が大きくなり酸素運搬能力が増す 脱核によって狭い毛細血管も通れるようになる 細胞膜特性 好中球は, 肺の微小循環において, 健常時でも大血管と比較して非常に高い濃度で存在しているが この理由の一つが変形能と考えられている

32 なぜ赤血球は脱核する必要があるのか ( 仮説 ) 核は蛋白を作る工場であり 酸素を運ぶことを目的とする赤血球には必要でない? 変形能を大きくし 細い血管通過を容易にする? 小型化するためには邪魔者? 人では貧血状態になると奇形や小型赤血球が増し 酸素運搬効率を増加させている 魚類では 一般にあまり連動しない 深海魚類の赤血球は大きく 海面を活発に遊泳する魚類の赤血球は小さい 成熟が継続されるためには核が必要 だから鳥類 魚類 爬虫類などは末梢血で成熟過程が継続されているのではないか?

33 動物種と赤血球容積 データ参照 : 比較血液学アトラス

34 動物血の血球計数 分類 モルモットラットキャットドック ヤギウマブタサル

35 Rat の週齢と赤血球系の変化 データ参照 :An Atlas of Laboratory Animal Hematology

36 赤血球の異常関連疾病 所見低色素症奇形赤血球症大小不同症標的 菲薄赤血球有口赤血球球状赤血球有棘赤血球分裂赤血球ハウエルジョリー小体好塩基性斑点ハインツ小体 貧血 鉄欠乏 病態 代謝障害 赤血球生成の亢進 代謝障害 赤血球生成の亢進 肝疾病 低色素性貧血 肝疾病 溶血性貧血 溶血性貧血 尿毒症 甲状腺亢進 高浸透圧症 播種性血管内凝固症候群 細小血管障害性貧血 脾臓機能低下症 異常核分裂 鉄欠乏症 鉛中毒 酸化剤の暴露 不安定 Hb 酸素欠損 脾臓機能低下症 データ参照 : 比較血液学アトラス

37 血球計数の精度管理

38 精密 正確 精確 精度 A 装置 B 装置

39 光学的校正 ( オプチポイント ) 容積ヘモグロビン濃度 どの位置にプロットさせるかを調整する

40 コントロールとキャリブレーター 装置の絶対値をセットする ( 正確度管理 ) ADVIA SETpoint (CAL) 装置の変動を確認する ( 精密度管理 ) ADVIA TESTpoint (Cont. Cont.)

41 管理血球類 管理血球が人造物である場合 挙動の違いがある ( 膨張 収縮が少ない 粘度が低い ) 血液由来 人や動物血をグルタルアルデヒド化処理 自然物由来 花粉 カビ 胞子 酵母 ポリスチレン ラテックス全血

42 キャリブレーターの値づけ 値付け 新鮮血 基準分析法 複数台の測定値を集計して値付け キャリブレーター

43 管理血球と Hematocrit 分布 分布 2000 年度医師会サーベイ結果から

44 健常者血液加工血と全血 (RBCRBCチャンネル ) 加工血液ADVIA120 CD4000 SE9000 STKS

45 2005 年度 X 県技師会サーベイマテリアル AA 白血球 B 血小板 C 赤血球

46 医師会サーベイ試料 (WBC( WBCチャンネル ) 新鮮血 TESTPOINT 1998 年 1999 年 2000 年 2002 年 2003 年 マテリアルの変更?

47 CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute 臨床検査標準協会 例 : CLSI-H20A Hematology (Approve Tentative Proposal) 臨床検査の国際標準の草案作成 決定をする機関 専門家 政府 企業が情報を提供し 互いに協力して臨床検査の発展に貢献する

48 ICSH ICSH(International Council for Standardization) 米国血液学標準協議会 血球計数装置に関する基準は ICSH が校正のための方法を推奨し メーカーもこれを遵守している

49 世界における標準化会議の関係図 ( 血液検査分野 ) ICSH(ISLH) (ISLH),CLSI による血液検査分野の標準化参照法の整備により国際統一を図る WHO 血液検査標準規格 ICSH 血液検査標準規格 WHO ISLH 血液検査標準規格臨床検査標準規格 ISO/TC212 規格 ICSH ISLH 血液検査標準規格 CLSI CLSI NCCLS NCCLS TC212 TC212 血液検査標準規格臨床検査標準規格 ISO/TC212 規格 データ参照 : 川合陽子先生資料から

50 血球計数装置の基準分析法 (ISL SLH) RBC: インピーダンス計測 ( 用手希釈 ) WBC: インピーダンス計測 ( 用手希釈 ) Hgb: シアンメトヘモグロビン用手法 Hct: ミクロヘマトクリット法 PLT: ブレッカークロンカイト法 Diff : 目視法 Retic: ブレッカー法

51 ブレッカークロンカイト法による血小板カウント 1. 血小板とゴミの分別が難しい 2. レンズの焦点深度を考慮した血小板測定の操作が煩雑

52 血小板測定法 目視法 間接法 ( ホニオ法 ) 直接法 ( ブレッカークロンカイト法 リースエッカー法 ) 自動血球計数装置による方法 電気抵抗法 光学的検知法 (1D 2D) フローサイトメーター 免疫学的検知法 (CD61)

53 免疫血小板測定法 (CD61( CD61) P PR P T =P+PR R T =R+PR R PLT=( P T /R T ) RBC RBC の絶対数は血球計数装置の値を利用

54 詳細なテクニカル部分

55 血液サンプリング方式 サンプリングバルブ法 全血をセラミックの穴に通し 希釈液で押し出す方法 粘度の強さに影響されにくく 相当高希釈倍率まで一段希釈が可能 シリンジ法 磨耗に伴なって発生する吸引異常に留意

56 白血球の分布は細胞比重に影響を受ける チューブ内に血球を送り込むと 先端部には比重の小さい顆粒球が多くなる傾向がある 吸引最後部 吸引先頭部

57 測定法の違いによる値の差 濃縮血球による MCHC の比較 装置法測定 (g/dl) C 社 -MCHC y = x マニュアルMCHC vs STKS R 2 = マニュアルMCHC vs ADVIA 37 y = x R 2 = 用手法 (g/dl) ADVIA-MCHC Hgb 量によって血球の収縮度が異なる?

58 Hct 測定の遠心力の留意点

59 血小板数の不一致例 Case 1 Case 2 高脂血漿 ITP 電気抵抗法 電気抵抗法 電気抵抗法 免疫測定法 光学的検知法 59 92

60 分析装置の検出領域の違い (PLT 測定例 ) ADVIA fL ADVIA fL 1200 小型赤血球の影響 ADVIA2120 ADVIA60 羊赤血球 (MCV=33fL) と人赤血球 (MCV=95fL) とを混和したサンプル 血小板数 10 3 /μl μL 50μL 100μL 150μL

61 界面活性効果と血球サイズ 血球計数装置に使われる界面活性剤は陰イオン界面活性剤 SDS 第 4 級アンモニウム塩

62 界面活性効果と細胞膜固定反応 試薬の流入 Perox チャンネル Baso チャンネル 採血管内白血球 界面活性剤 + 表面固定 チャンバー内白血球

63 WBC サブポピュレーションの特性の違い 血球容積 界面活性効果 ペルオキシダーゼ活性 顆粒特性 脂質量 核形状

64 血液と界面活性剤 昨今の血球計数装置は短時間で反応を行なうため 溶血不良や溶血過剰によって生ずる異常データの有無を判断願います

65 血球計数装置使う上での留意点 各パラメータの算出および解析法 データの信頼性の理解 管理血球と全血の相違点と試薬挙動の違い 血球サイズと機能および測定法の違い 白血球測定理論

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Title 不規則抗体検査の解説 福島県立総合衛生学院 教務部臨床検査学科 安田広康 SLIDE 1 不規則抗体同定のプロセス (1) 不規則抗体スクリーニング (Sc) 可能性の高い抗体の推定 * 否定できない抗体の推定反応態度 *1 消去法 * - 日臨技 輸血 移植検査技術教本 - *1 陽性の Sc 赤血球 1) 反応パターン ) 反応温度 ) 凝集の強さ * 陰性の Sc 赤血球 1) 量的効果 *

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