巻　頭　言

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かずきさわまつ
5 years ago
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1 12 Lab Clin Pract radioimmunoassay RIA enzyme linked immuno sorbent assay ELISA Immuno PCR Immuno PCR tumor necrosis factor α TNF α 1 Immuno PCR Sano 1) BSA streptavidin protein A 1 Immuno PCR 1995 Maia M, et al. HBsAg Sanna PP, et al. Mouse TNF α Sperlet J, et al. stcr Suzuki A, et al. sicam Joerger RD, et al. htsh hcg Mweene AS, et al. BHV Numata Y, et al. ANP 1 1) 1997 Niemeyer CM, et al. HBsAg Ogunjimi AA, et al. E. coli O157:H7 1 2) 2000 Ren J, et al. MG7Ag Saito K, et al. TNF α Furuya D, et al. IL Sugawara K, et al. Angiotensinogen Zhang H T, et al. p185 her2/neu receptor Wu HC, et al. BTx A Furuya D, et al. Osteoprotegerin

2 reportor DNA puc 19 PCR reportor DNA ELISA 10 Zhou 2) streptavidin protein A streptavidin biotin reportor DNA Proto oncogene ETS 1 ELISA 10 biotin 2 Maia 3) hepatitis B surface antigen HBsAg RIA 1,000 chemical crosslinker reportor DNA 2 4) PCR southern blot 3)5) ELOSA 3) PCR ELISA 6) 7) Immuno PCR 2 Immuno PCR TNF α 8) 1 1 TNF α DNA salmon sperma DNA 2 TNF α 3 IgG DNA reporter DNA Reporter DNA pbluescript M13 20 M13 reverse Reporter DNA denature annealing extention cycle Et Br 1% 10V/cm 55 II 2 TNF α Immuno PCR streptavidin reporter DNA 1 streptavidin Immuno PCR streptavidin 1 Immuno PCR 111

Lab Clin Pract. (2002) 図2 Immuno-PCR 法( )と ELISA 法( )による TNF α 検出感度の比較の至適濃度について検討したすなわち無標識 streptavidin の代わりに HRP labeled streptavidin(1 0.1 0.01µg/ml)を反応させ OPD により発色させたその結果 1µg/ml ではブランクの O.

1%ゼラチン -PBS を抗原として使用し段階希釈した reporter DNA(0.05 5,000pg/ml)を反応させた反応終了後増幅産物をアガロースゲルで電気泳動したところ加えた reporter DNA 濃度が低くなるにつれてバンドも薄くなり 0.

3 Lab Clin Pract. (2002) 図2 Immuno-PCR 法( )と ELISA 法( )による TNF α 検出感度の比較の至適濃度について検討したすなわち無標識 streptavidin の代わりに HRP labeled streptavidin( µg/ml)を反応させ OPD により発色させたその結果 1µg/ml ではブランクの O.D.が 0.8 と非特異反応がみられさらに高濃度域でプラトーとなったまた 0.01µg/ml では感度に問題があったため 0.1µg/ml が至適濃度と考えられた (2)至適 reporter DNA 濃度の設定 Reporter DNA 濃度が非特異反応に及ぼす影響を検討するため TNF α を含まない 0.1%ゼラチン -PBS を抗原として使用し段階希釈した reporter DNA(0.05 5,000pg/ml)を反応させた反応終了後増幅産物をアガロースゲルで電気泳動したところ加えた reporter DNA 濃度が低くなるにつれてバンドも薄くなり 0.5pg/ml では図 3 健常者と Duchenne muscular dystrophy (DMD) 患者における血清 TNF α 濃度 (Shaded area は ELISA 法での検出可能範囲を示している) 認められなかったすなわち 0.5pg/ml が至適 reporter DNA 濃度であると考えられた 3 臨床応用の実際 3)ELISA 法との感度の比較 Immuno-PCR 法と ELISA 法との検出感度の比 1)Duchenne muscular dystrophy(dmd) 患較を行ったところ比較対照法に用いた ELISA 者における検討法の測定下限が 50pg/ml であったのに対し DMD は X 染色体劣性遺伝をとる疾患で筋細 Immuno-PCR 法では 0.001pg/ml までバンドが検胞膜に局在するジストロフィン蛋白が欠損するた出され約 5 万倍の感度上昇が確認された(図2) め筋細胞膜が脆弱となり壊死に陥るさらに健常者の血清 TNF α 濃度も Immuno- 従来多くの患者は 10 歳前後で歩行不能となり PCR 法を用いることによりはじめて測定可能と呼吸筋や心筋が侵されるため 20%は心不全で死なりその基準範囲は 0.027±0.054pg/ml であっ亡していたしかし最近では人工呼吸器の使用た(図3) が普及し患者の生命予後はやや改善している 112

4 2 Inflammatory bowel disease IBD TNF α UC No. of samples TNF α pg/ml total inactive active CD total inactive active DMD 65 TNF α 27.8pg/ml 1, ) 20 TNF α 20 5 TNF α TNF α CK Mb DMD TNF α 2 Inflammatory bowel disease IBD Ulcerative Colitis : UC Crohn's disease : CD IBD UC 28 CD 8 TNF α TNF α 30.3pg/ml 208.4pg/ml UC 1,100 CD 7, ) 36 ELISA % TNF α 4 Immuno PCR 1 Immuno PCR TNF α 0.001pg/ml 0.1pg/ml ELISA 2 Immuno PCR PCR Immuno PCR Immuno PCR Immuno PCR TNF α angiotensinogen 15) Interleukin 18 IL 18 14) Osteoprotegerin 16) angiotensinogen

5 Lab Clin Pract Sano T, Smith CL and Cantor CR: Immuno PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody DNA conjugates. Science, 258, Zhou H, Fisher RJ and Papas TS: Universal immuno PCR for ultra sensitive target protein detection. Nucleic Acids Res., 21, Maia M, Takahashi H, Adler K, et al.: Development of a two site immuno PCR assay for hepatitis B surface antigen. J. Virol. Methods, 52, Joerger RD, Truby TM, Hendrickson ER, et al.: Analyte detection with DNA labeled antibodies and polymerase chain reaction. Clin. Chem., 41, Suzuki A, Itoh F, Hinoda Y, et al.: Double determinant immuno polymerase chain reaction: a sensitive method for detecting circulating antigens in human sera. Jpn J. Cancer Res., 86, Niemeyer CM, Adler M and Blohm D: Fluorometric polymerase chain reaction PCR enzyme linked immuno assay for quantification of immuno PCR products in microplates. Anal. Biochem., 246, Numata Y and Matsumoto Y: Rapid detection of alpha human atrial natriuretic peptide in plasma by a sensitive immuno PCR sandwich assay. Clin. Chim. Acta, 259, Sanna PP, Weiss F, Samson ME, et al.: Rapid induction of tumor necrosis factor alpha in the cerebrospinal fluid after intracerebroventricular injection of lipopolysaccharide revealed by a sensitive capture immuno PCR assay. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, Sperl J, Paliwal V, Ramabhadran R, et al: Soluble T cell receptors: detection and quantitative assay in fluid phase via ELISA or immuno PCR. J. Immunol. Methods, 186, Mweene AS, Ito T, Okazaki K, et al.: Development of immuno PCR for diagnosis of bovine herpesvirus 1 infection. J. Clin. Microbiol., 34, Saito K, Kobayashi D, Sasaki M, et al.: Detection of human serum tumor necrosis factor alpha in healthy donors using a highly sensitive immuno PCR assay. Clin. Chem., 45, Saito K, Kabayashi D, Komatsu M, et al.: A sensitive assay of tumor necrosis factor α in sera from duchenne muscular dystrophy patients. Clin. Chem., 46, Komatsu M, Kobayashi D, Saito K, et al.: Tumor necrosis factor α in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno PCR. Clin. Chem., 47, Furuya D, Yagihashi A, Yajima T, et al.: An immuno polymerase chain reaction assay for human interleukin 18. J. Immunol. Methods, 238, Sugawara K, Kobayashi D, Saito K, et al.: A highly sensitive immuno polymerase chain reaction assay for human angiotensinogen using the identical first and second polyclonal antibodies. Clin. Chim. Acta, 299, Furuya D, Kaneko R, Yagihashi A, et al.: Immuno PCR assay for homodimetric osteoprotegerin. Clin. Chem., 47,

Key words : influenza, nested-pcr, serotype

Key words : influenza, nested-pcr, serotype Table 1 Sequence of PCR primers used to detect HA gene of influenza virus 524 清水 Fig. 1 Detection of PCR product 英明他 (lstpcr) Table 2 Results method Fig. 2

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