第 28 回血液部門卒後研修会長崎 症例 7 熊本赤十字病院エスアールエル検査室 津田勉 平成 29 年 2 月 18 日 ( 土 )
年齢 性別 78 歳 男性 主訴 特になし 現病歴 HCC( 肝細胞癌 ) 加療後 フォロー中の Pt 近医にて予定されていた CT と採血で受診時 白血球 血小板 LDH 増加を認める 又 画像上脾腫を認めた為 当院血液腫瘍内科にて精査目的で紹介となる 既往歴 HCC( 肝細胞癌 ) 臨床症状 自覚症状なし
LD/ALT=24.2>15 血液腫瘍の可能性大 生化学 その他検査 TP 7.8g/dl Na 137mEq/l ALB 4.0g/dl K 4.6mEq/l T-Bil 0.5mg/dl Cl 102mEq/l AST 25IU/L Ca 8.8mg/dl ALT 14IU/L CRP 定量 0.83mg/dl LD 339IU/L IgG 2487mg/dl ALP 147IU/L IgA 158mg/dl CHE 198IU/L IgM 188mg/dl CK 64U/L Glu 107mg/dl BUN 31.8mg/dl フェリチン 145.9ng/ml CRE AMY Fe UIBC 1.82mg/dl 137IU/L 35μg/dl 188μg/dl BUN/CRE=17.5>10 消化管出血 脱水?
血液検査 WBC 12.42 10 3 /μl Stab 12.0% RBC 4.11 10 6 /μl Seg 43.5% Hb 10.8g/dl Eo 1.0% Ht 32.2% Baso 1.5% MCV 78.3fl Lympho 6.0% MCH 26.3pg Mono 24.5% MCHC 33.5% Meta 8.5% PLT 770 10 3 /μl Myelo 2.5% Ret 2.25% Blast 様 0.5% RPI 1.07 RBC 所見 大小 破砕 偽ヘ ルケ ル核異常
末梢血液像 MG 染色 (200 倍 )
末梢血液像 MG 染色 (1000 倍 ) 1 2 3 1 芽球様細胞 0.5% 2 単球 24.5% 好塩基球 1.5% 3 好中球形態異常 4 血小板増加
データから推測される疾患と追加検査 検査所見 血液検査 WBC PLTの増加 貧血 生化学 LDH BUN CRE AMY IgG CRP 高値 CHE Fe 低値 凝固未検査 血液像所見 白血球系幼若細胞出現 ( 芽球 0.5%) Mono Baso 高値 偽ヘ ルケ ル核異常 赤血球系大小不同 破砕赤血球 血小板系所見なし 予測される診断 骨髄増殖性腫瘍 骨髄異形成症候群 癌の再発 転移 必要な検査 骨髄検査 骨髄像 (MG 染色 特殊染色 ) 病理検査 細胞表面マーカー 染色体検査等
骨髄検査 s i s G r a n u l o p o i e s i s E r y t h r o p o i e Proerythroblast 0.0 Promono 1.0 M.baso 0.0 Mono 14.4 M.poly 0.4 Lympho 2.0 M.ortho 0.0 Plasma 0.2 N.baso 1.4 Histiocyte 0.2 N.poly 9.8 Phagocytes 0.0 N.ortho 1.0 M/E 比 5.52 E Total 12.6 有核細胞数 280,500/μl Myeloblast 2.0 巨核球数 343/μl Promyelo 1.6 Myelo 10.2 所見 Meta 13.0 赤芽球系 顆粒球系 Stab 20.6 所見なし 偽ヘ ルケ ル核異常 Seg 19.8 低顆粒好中球 Immature Eo 0.4 巨核球系 環状核好中球 Eo 0.6 微小巨核球 小型巨核球 Immature Baso 0.2 過分葉巨核球 分離多核巨核球 Baso 1.2 M Total 69.6
骨髄像 MG 染色 (100 倍 )
骨髄像 MG 染色 (1000 倍 )
骨髄像 MG 染色 (1000 倍 )
骨髄像 MG 染色 (1000 倍 )
骨髄像 MG 染色 (1000 倍 )
骨髄像 MG 染色 (1000 倍 ) 小型 多核 過分葉 有尾状等異型を伴い 又 血小板を多数産生している巨核球の増生が目立つ
骨髄像 MG 染色 (1000 倍 ) 単球増加 偽ヘ ルケ ル核異常低顆粒 環状好中球 低顆粒幼若顆粒球 過分葉巨核球 1 過形成, 巨核球増加 脂肪滴減少 2 M/E 比 5.52 顆粒球系過形成 3 単球系細胞増加 4 形態異常 顆粒球系 偽ヘ ルケ ル核異常 低顆粒好中球 低顆粒幼若顆粒球 環状核好中球 巨核球系 微小巨核球 小型巨核球 過分葉巨核球 分離多核巨核球 5 巨核球血小板産生像多数
骨髄像から推測される疾患と追加検査 1 顆粒球過形成 形態異常 芽球増加なし 単球増加 巨核球増加 Baso 軽度増加 CMML acml (CML) 2 骨髄球系に異形成を伴う無効造血を認めると同時に 異形成を有する有効造血を巨核球系に認める MDS/MPN,U 異常クロマチン凝集 1 特殊染色 (PO エステラーゼ ( フ チレート アセテート 二重 ) ALP) 形態診断の補助 2 血清 尿中リゾチーム 単球系白血病の証明 3 染色体検査 G-band 法 CML 否定とその他の異常の有無検索 4BCR-ABL1(FISH) CML 否定 ( 又は肯定 ) 5JAK2 CALR 遺伝子変異解析 遺伝子異常の有無検索
特殊染色を駆使して細胞を鑑別する!! 1.MPO 染色 1AMLとALLの鑑別に必須 2 染色態度の違いにより細胞系統を鑑別 2.EST 染色 1 単球系と顆粒球系細胞の鑑別 (EST-W) 2α-NAEでM6( ~++) M7(+) 3.PAS 染色 1 芽球の陽性染色態度の違いによる白血病細胞の鑑別 2 腫瘍性赤芽球が陽性に染まる事によるAML (M6) と巨赤芽球性貧血との鑑別 3MDSでの異形成の有無 4 腺癌等の腫瘍細胞の骨髄転移の確認 4.ACP 染色 1HCLで例外もあるが反応が強く 酒石酸抵抗性 2リンパ球のsubpopulation(T,B 細胞 ) における染色性の違い 5.Fe 染色 MDS(RARS) における環状鉄芽球の比率 6.ALP 染色 CML PNH t(8;21) MDS 等で低値を示す
少しでも疑問に思ったら必ず特殊染色!!! MG 染色 形態だけでは判断出来ない細胞 細胞化学的検査 ( 特殊染色 ) MG 染色 形態 + 細胞化学的検査 ( 特殊染色 ) 機能 細胞を形態と機能の両面から観察!!!
PO 染色陽性と偽陽性判定ポイント DAB 法 ( ベンチジン誘導体 ) FDA 法 ( フルオレン誘導体 ) 末梢血 PO 染色 陽性細胞に隣接し陰性細胞の細胞質の一部が陽性に見える 背景に顆粒が残り 陰性細胞が背景と同様の染色性を示す
PO 染色弱陽性を見極めるポイント後染色を変える 1 ベンチジン誘導体 末梢血 PO 染色 顆粒が見やすく弱陽性の判定がし易い ベンチジン誘導体の時は後染色をギムザで行うと核の形態観察に適する ベンチジン誘導体の時に後染色をヘマトキシリンで行うと顆粒の観察に適する
PO 染色弱陽性を見極めるポイント後染色を変える 2 フルオレン誘導体 末梢血 PO 染色 顆粒が見やすく弱陽性の判定がし易い フルオレン誘導体は顆粒が青緑色で核も青紫色を呈し同系色の為 見にくい時がある フルオレン誘導体の時に後染色をサフラニンで行うとコントラストがはっきりして陽性顆粒が観察し易い ( 核が赤系 顆粒が青系に染まる )
骨髄像 PO 染色 (DAB 法 )200 倍
骨髄像 PO 染色 (DAB 法 )1000 倍
骨髄像 EST 染色 1000 倍 フ チレート法 アセテート法 組織球 NaF 阻害
骨髄像 EST W 染色 (400 倍 )
末梢血液像 ALP 染色 (200 倍 )
特殊染色所見 PO 染色 EST 染色 ALP 染色 (PB) 顆粒球系 : 陽性 αnb αna 染色 陽性率 (60.5~99.55) 単球系 : 陰性 ~ 弱陽性 単球系 : 陽性 (NaF 阻害 (+)) 陽性指数 (170~335) ASDCA 染色顆粒球系 : 陽性 この症例は PO 染色 : 陰性 20% 弱陽性 23% 中等度 24% 強陽性 33% αnb 染色 : 陽性 31%(NaF 阻害 (+)) 好中球含む ( 一部好中球も NaF 阻害有り ) αna 染色 : 陽性 22%(NaF 阻害 (+)) EST-W:ASDCA57% 陽性 αnb25% 陽性 ALP 染色 (PB): 陽性率 43.0%(60.5~99.5%) 陽性指数 91(170~335) PB 芽球 ( 前単球を含む )0.5%(<5%) BM 芽球 ( 前単球を含む )3.0%(<10%) より 形態診断 FAB 分類 MDS CMML
追加検査 ( 病理 表面マーカー 染色体検査等 ) 生化学的検査 血清リゾチーム166.5μg/mL(5.0~10.2μg/mL) CMML 病理検査 骨髄実質は80% でhypercellular marrow M:E 比 >5 Megakaryocyteは最大 10 個 /HPFと著明に増加し 大小不同と核異形を認める CD3 CD20でリンパ腫を示唆する所見はなく CD34 陽性芽球の優位な増加は認められない MPNが疑われます MPN 表面マーカー(LLACD45ゲーティング) CD13(55.6%),CD14(23.4%),CD33(72.4%),CD34(31.8%),CD56(29.8%),HLA-DR(82.3%) 骨髄 単球系のマーカー発現 (CMML) 染色体検査 (G-band) 46,XY,del(13)(q12q14)[20] MDS ET 等で見られる異常 染色体検査(BCR ABL(FISH)) 100 細胞中 融合シグナル0% CML 否定 JAK2V617F(GTC TTC) 遺伝子変異解析 判定 (-) JAK2V617F 変異なし (CALR 未検索 ) 確定診断 WHO 分類 MDS/MPN CMML-1 FAB 分類 MDS CMML
慢性骨髄単球性白血病 (CMML) の定義 ( 骨髄異形成症候群的から骨髄増殖性腫瘍的性質のものまで病像は多彩 ) JAK2V617F 変異は稀 骨髄増殖性腫瘍 (MPN) と骨髄異形成症候群 (MDS) の特徴を併せ持った 単クローン性の骨髄腫瘍である 1 持続する単球の増加 ( 末梢血において >1 10 9 /L) 2 フィラデルフィア染色体と BCR-ABL1 融合遺伝子がない 3PDGFRA PDGFRB 遺伝子の再構成がない (Eo 増加例では特に除外が必要 ) 4 末梢血 骨髄で芽球が 20% 未満 ( 前単球は芽球として扱う ) 51 系統以上の血球に異形成がある 異形成がない場合 1 骨髄細胞に後天性のクローン性染色体異常や遺伝子異常がある 23ヵ月以上の単球増加が続いており 単球増加の原因 ( 悪性腫瘍 感染 炎症など ) がないこと
慢性骨髄単球性白血病 (CMML) 疫学 病因 男女比 1.5~3:1 で男性に多く 診断は 65~75 歳に多いとされる 病因は明らかではない 一部の症例では環境の発癌物質や放射線が原因の可能性ありと示唆されている 病変部位 末梢血と骨髄は常に異常細胞があり その他に脾臓 肝臓 皮膚とリンパ節が髄外病変として頻度が高い 臨床像 ほとんどの患者で診断時に白血球は増加し 骨髄増殖性腫瘍に類似しているが 一部には様々な程度の好中球減少を伴って白血球数が 正常又はやや減少している例があり MDS に似た病態をとる 末梢血 骨髄の芽球割合によって CMML は 2 つに分けられる CMML-1: 芽球 ( 前単球を含む ) が末梢血で 5% 未満かつ骨髄で 10% 未満 CMML-2: 芽球 ( 前単球を含む ) が末梢血で 5~19% または骨髄で 10~19% 或いは芽球 + 前単球の数にかかわらず芽球にアウエル小体がみられる場合
CMML 異常単球 末梢血液像 MG 染色 (1000 倍 ) 異常単球の形態 一般に成熟し 形態的に著変ないものの 顆粒分布 核分葉や核クロマチンパターンの異常をとり得る 異常単球 芽球と前単球を併せて20% を超えるとCMMLではなく AMLの診断となるので正確なカウントが重要である
異常単球と前単球の鑑別 骨髄像 MG 染色 (1000 倍 ) 異常単球 異常単球 前単球 前単球 異常単球の形態 やや幼若な単球を指すが芽球や前単球と比べるとより成熟しており クロマチンの濃染 核の巻き込みとそれに伴うひだ形成 灰色がかった細胞質を持つ 前単球の形態 単芽球と比べると核に切れ込み等 核形不整がみられ 核網やや繊細緻密 核小体は名残がみられ 細胞質の好塩基性は薄れ 微細なアス ール顆粒を有する
CMML 好中球の異形成 骨髄像 MG 染色 (1000 倍 ) 低顆粒好中球 偽ヘ ルケ ル核異常 環状核好中球 好中球の異形成 白血球減少例や正常例と比べて今回の症例のような増加例では異形成は目立たない 一部の症例では顆粒の減少した好中球と異形成のある単球を区別しづらい
エステラーゼ染色 ( フ チレート法 ) 陽性好中球 骨髄像 EST 染色 1000 倍 組織球 フ チレート法 NaF 阻害 好中球の異形成 フ チレート法で異形を伴う成熟好中球が一部 弱陽性を示した 又 一部は NaF 阻害 (+) α-nb 陽性好中球の出現は異常クローン由来の可能性が示唆される
顆粒球 ( 顆粒減少 ) と異常単球の鑑別 骨髄像 MG 染色 (1000 倍 ) 好中球桿状核球 後骨髄球 異常単球 異常単球 後骨髄球 骨髄球 異常単球 異常単球 異常単球
CMML 巨核球 ( 血小板 ) の増加 JAK2V617F 変異は稀だが見られる事有り 骨髄像 MG 染色 (1000 倍 ) しばしば中等度の血小板減少がある 異形成のある巨大血小板が観察されることがある 今回の症例は血小板の著明な増加を伴っており 形態診断に迷った部分
免疫学的形質 CD13,CD33,CD14,CD68,CD64 を発現している ( 末梢血 骨髄の増加単球は 2 つ以上の異常な形質 ( 異常な免疫学的形質 ) を発現している ) CD2 の異所性発現,CD56 の過剰発現 CD14 発現低下 ( 単球の相対的な未成熟性 ( 幼若単球 ) を反映 ) HLA-DR,CD13,CD15,CD64,CD36 の発現低下 成熟過程の顆粒球系細胞にも形質異常がある CD34 陽性細胞の増加や異常な免疫形質を持つ芽球集団の出現は急性転化を早期に起こす可能性がある 免疫組織化学で最も信頼できるマーカーは CD68R,CD163
遺伝学 20~40% にクローン性の染色体異常が見られ +8,-7/del(7q),12p 異常の頻度が高いが特異的なものはない 40% で RAS の点突然変異が陽性である 単独 isochromosome17 q 異常を伴う血液腫瘍 の一部は CMML の定義に一致するが 多くは MDS/MPN,U とする方がより適切であろう CMML において 11q23 異常は稀で これは CMML より AML を示唆する 染色体転座 t(5;12)(q31-33;p12)/etv6-pdgfrb 融合遺伝子が陽性で 好酸球増加を伴う MDS/MPN 例は 以前は CMML とされていたが 現在は別のカテコ リーに分類されている CMML に類似しても p190bcr-abl1 を発現する例は CML とされるべきである
WHO 分類 2016 改定版 MDS/MPN CMML MDS/MPN CMML 遺伝子変異に関しては高率に検出されている CMMLにおいて最も共通して認められる遺伝子異常 SRSF2 TET2さらに ( あるいは )ASXLで80% 以上の症例で認められる その他 低頻度に認められるものにSETBP1 NRAS/KRAS RUNX1 CBL EZH2がある それらの遺伝子異常は 通常 正常核型を示すCMMLの診断の一助となるが 単独の異常では疾患を証明するものとは言えない なぜならそれらの遺伝子異常は健常な高齢者にも認められ clonal hematopoiesis of indeterminate potential(chip) とも呼ばれている ASKL1 変異はCMMLにおいてアグレッシブな病勢を示唆するため予後スコアリングシステムに取り入れられている 注目すべきは NPM1 変異がCMMLの3 ~5% の症例に見られ よりアグレッシブな臨床経過の前触れと言えそうだ RARS-T が暫定病型から正式な仲間となった MDS/MPN-RS-T
WHO 分類 2016 改定版 MDS/MPN CMML 分子学的異常と臨床経過の関係における新たな発見により CMML は白血球数 13,000/μl 以上の proliferation type と 13,000/μl 未満の dysplastic のサブタイプにわけることの意義が明確となった とりわけ RAS/MAPK 経路が両者で異なっていることが分かっている 又 それに加えて芽球比率が予後と重要な関連があることは 3 版で示唆され 4 版で明確になっている 最近のエビデンスでは芽球比率に基づいて 3 つのグループに分けることがより予後を決定する上で意味があることが示されている 従って以下の 3 つのサブタイプに分類する CMML0:PB 芽球 2% 未満 BM 芽球 5% 未満 CMML1:PB 芽球 2~4% BM 芽球 5~9% CMML2:PB 芽球 5~19% BM 芽球 10~19% 又は Auer rod が認められる 前単球 ( 芽球と同様に扱われる ) と成熟単球を鑑別することの重要性 すなわち形態学的評価が必須であることと同時に フローサイトメトリーによる適切な免疫表現型に関する情報や細胞遺伝学的検査 分子遺伝学的検査が必須である
まとめ 芽球と前単球を併せて 20% を超えると CMML ではなく AML の診断となるので 前単球と異常単球の鑑別が重要 異常単球と低顆粒好中球 ~ 幼若顆粒球等の鑑別が困難な場合 特殊染色と併せて判定していく (α-nb 陽性好中球に注意する ) CMML において JAK2V617F の変異は稀だが認められる事は有り 今回の症例では認められなかったが CALR 等他の遺伝子検査についても実施する必要がある WHO 分類 2016 改定版において CMML の遺伝子変異に関しては高率に検出されている しかし まず 形態学的評価が必須であり 同時に 従来同様フローサイトメトリーによる適切な免疫表現型に関する情報や細胞遺伝学的検査 分子遺伝学的検査で補完していく