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ひできくぬぎ
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1 第 55 回 NMR 討論論会チュートリアルコースフーリエ変換を工夫して NMR スペクトルをよみがえらせる平成 28 年年 11 月 15 日 ( 火 ) 13:40~ 14:40 広島国際会議場ヒマワリ横浜市立立大学生命医科学研究科池上貴久

2 同じ測定データでもどのようにフーリエ変換するかによってスペクトルに大きな違いが生じることがありますもちろんプロセス法も考えておいたうえで測定パラメータを設定するのがよいのですがもし間違えて測定してしまったとしてもフーリエ変換をなんとか工夫することによってそのミスを少しでもカバーできればそれに越したことはありません今回はプロセス用パラメータをブラックボックスとして使ってしまっている NMR 初心者を対象にプロセス法における工夫や個々の基本的なパラメータの意味についてできるだけ詳しく紹介したいと思います

3 コヒーレンス :x 検出位相 : x 吸収波形同位相 in- phase J y I Sα+Sβ = 1 IxSα IxSβ y I IxSα -IxSβ x I Sα- Sβ = 2Sz 反位相 anti- phase

4 コヒーレンス :y 検出位相 : x 分散波形 Sα+Sβ = 1 y I IySα IySβ Sα- Sβ = 2Sz y I x I -IySα IySβ

5 I HMBC (+ decoupling?) S 2J t 1 1 t 2 普通は削除反位相の状態でデカップリング二重線が消える ( 分散波形でも起きる ) J 0 y I x I

( ) = S t S ω フーリエ変換 ( )exp( iωt)dt 1768-1830 フランスの数学

6 ( ) = S t S ω フーリエ変換 ( )exp( iωt)dt フランスの数学物理理学者 1789 フランス革命に遭遇ナポレオンに随行行してエジプトに遠征ロゼッタストーンを発見見

7 FID をフーリエ変換すると NMR スペクトルになる FID ( 時間軸データ ) フーリエ変換後スペクトル ( 周波数軸データ ) 1 H スピンの回転速度度を表す

8 スピン 500MHz NMR 毎秒 5 億回転電子 - N 原子核 + 1 H H S

9 7 FID 7 x ωt Sin 曲線 1 t y Cos 曲線 t 6 回転は ( 振動する ) cos, sin 曲線で表すことができる

10 直交検波 7 直接測定で検出される信号 FID 7 x ωt Sin 曲線 y 2 Cos 曲線 ω 0 - ω ω 0 - ω ω 0 - ω

11 1 秒間に 30 周回転したとすると 1 秒フーリエ変換 30 Hz

12 1 秒間に 10 回転していたら. 1 秒 10 Hz の位置にピークが出た

13 もう一つ 1 秒間に 30 回しかも逆向きに回転していたら何が混ざっているのか一見見分からない 10 Hz と - 30Hz の位置にピークが出た周波数だけでなく大きさまできっちりと分けれた!

14 S ( ω) S( t) exp( iωt) dt = = S( t){cos( ωt) i sin( ωt)} dt では試しに cos (40 * t) を掛けてみよう 10 Hz の FID 端から端まで足し合わせると 0 になるから 40 Hz は間違いのようだ

15 今度度はもう少し実際の振動に近そうな cos (10 * t) を掛けてみよう端から端まで足し合わせると 0 にはならないからどうも 10 Hz が正しい周波数のようだ

16 では cos (11 * t) を掛けたらどうなるのだろう? 半値幅 =1/(π T 2* ) 微妙完全には 0 にならない FID がもう少し長ければ 0 になるのに

17 Window 窓関数の適用 FID の右端に値が残っているとフーリエ変換後に wiggle ( 波 ) が出てしまう

18 FID の右端が 0 になるように整形すると exp( 3.0t) フーリエ変換後に wiggle( 波 ) は消える

19 FID の長さを半分にして同じ window をかけると exp( 3.0t) 再び wiggle( 波 ) が出てしまう

20 exp 窓関数で本当に大丈夫? FID サンプリングの最後の値が 0 に近くなるようにこの変数を調整しなければならない exp( 3.0t) sin 2 ( 0.99π) = 程度度であればきっと安全

21 sin 2 (cos 2 ) 窓関数はなかなか便便利利 sin 2 ( 0.5π) = 1 sin 2 ( 0.99π) =

22 sin 2 (cos 2 ) 窓関数は線幅もそれほど広げない exp( 3a q ) = 0.02 sin 2 ( 0.99π) =

23 ポイント数の少ない間接測定軸には sin (cos) 窓関数を使えば分解能をそれほど落落とさずに済む ( ) ( ) sin 2 ( 0.5π) sin 2 ( 0.99π) sin 0.4π sin 0.99π しかし着地が急激な分少し wiggle が

24 Lorentz- to- gauss 窓関数を使えば裾野が長く尾を引かない exp( 5.4a q ) = $ exp +R 2 a q σ 2 & 2 a q % 2 ' ) = ( 分解能が向上した交換条件として少し感度度を失う

25 感度度が許せば lorentz- to- gauss 窓関数は cos 2 窓関数よりもよいかも 1 H/ 15 N 次元ともに cos 2 1 H/ 15 N 次元ともに lorentz- to- gauss

26 なぜ 1 次元ずつフーリエ変換するのか? exp(-i ω I t 2 ) * exp(-i ω S t 1 ) {cos(ω I t 2 ) +i sin(ω I t 2 )} * {cos(ω S t 1 ) +i sin(ω S t 1 )} 実数部分 : cos(ω I t 2 )cos(ω S t 1 ) - sin(ω I t 2 )sin(ω S t 1 ) 虚数部分 : cos(ω I t 2 ) sin(ω S t 1 ) + sin(ω I t 2 ) cos(ω S t 1 )

27 なぜ 1 次元ずつフーリエ変換するのか? exp(-i ω I t 2 ) * exp(-i ω S t 1 ) {cos(ω I t 2 ) +i sin(ω I t 2 )} * {cos(ω S t 1 ) +i sin(ω S t 1 )} {R(ω I ) +I(ω I )} * {cos(ω S t 1 ) +i sin(ω S t 1 )} 位相補正 R(ω I ) * {cos(ω S t 1 ) +i sin(ω S t 1 )} R(ω I ) * {R(ω S ) +I(ω S )} 位相補正 R(ω I ) * R(ω S )

28 f ( t 1) R f ( t 2 ) R

29 R f ( t 2 ) f ( t1 ) f ( t 2 ) f ( t1 ) I R I I f(t1) R f ( t 2 ) f ( t1 ) R f(t2) I f ( t 2 ) f ( t1 )

30 F( ω 2 ) R f ( t 1 ) R F( ω 2 ) I f ( t 1 ) R F( ω 2 ) R f ( t 1 ) I F( ω 2 ) I f ( t 1 ) I

31 F( ω 2 ) R F( ω 1 ) I +3 Hz -4 Hz F( ω 2 ) R F( ω 1 ) R

32 位相の調整分散波形 : 負の時間に FID がないため吸収波形と分散波形に分かれる

33 I 1 y 2 3 xʼ z 1 パルス照射の座標照射の座標の x 検出の座標の xʼ x 2 y 2 3 xʼ yʼ xʼ 検出の座標 yʼ

34 照射の座標の x 検出の座標の xʼ θ y yʼ I (x) = 1 I (y) = 0 I (x ) = cos (θ) I (y ) = sin (θ) xʼ x

35 I (x) = cos (ωt) I (y) = sin (ωt) I (x ) = cos (ωt+θ) = I (x) cos (θ) - I (y) sin (θ) I (y ) = sin (ωt+θ) = I (x) sin (θ) + I (y) cos (θ) xʼ θ ωt x y yʼ 検出座標 (xʼ, yʻ ) で検出された信号 θ だけ反時計回りに回転照射座標 (x, y) に移す

36 照射座標と検出座標が 45 ずれていると吸収波形 / 2 - 分散波形 / 2 吸収波形 / 2 + 分散波形 / 2

37 一次補正はなぜ必要? I 1 y 2 3 δ x x 2 z 1 照射の座標の x = 検出の座標の xʼ とする y 2 3 x x y y

38 I 1 y 2 3 xʼ δ xʼ yʼ これが FID の開始時点化学シフトに沿って位相がずれる

39 Ph0 Ph1 y=ax+b スペクトル幅を切切らずに Ph1 を合わせる Ph0? NmrPipe と Topspin とでは Ph0, Ph1 両方ともに ± 逆転

40 I y/x t 1 t 1 の開始が Δt 1 分だけ遅れると y +180 xʼ 0 yʼ t 1 の開始時点次の位相補正 : 次の位相補正 : 360

41 I y/x t 1 t 1 の開始が 0.5Δt 1 分だけ遅れると y +90 xʼ 0 yʼ t 1 の開始時点次の位相補正 : 次の位相補正 : 180

42 t 1 がきっちりと 0 から始まると短冊の左半分がマイナス時間に食い込んでしまうのを防ぐため t 1 =0 の強度度を半分にする (FCOR=0.5) 0.5 Δt 1 から始める場合には FCOR=1.0

43 この空白の領領域は無駄 3, 4 次元での時間の損失は大きい

44 同じ測定時間ならばもっと高い分解能でとれたはず 0.5*SW もし 3,4 次元で ω 1 and ω 2 それぞれを半分のスペクトル幅に縮めることができれば測定時間は ¼ となる ( あるいは感度度を倍にできる )

45 t 1 (0) を Δt 1 /2 に設定すれば折り返ったピークは負になるので識識別できるタンパク NMR を測る場合には 15 N SW はできるだけ縮めようしかし直接測定軸 (FID) のスペクトル幅を減らしてはいけない

46 t 1 の開始を 0.5Δt 1 分だけ遅らせると折り返りピークは負になる SW 位相補正 : α +90 位相補正 : α - 90

47 タンパク質の立立体構造解析では重要な 3D 13 C- edted NOESY でも折り返しを活用することで高分解能にとれる

48 FID の開始が 1 ポイント遅れると 1. そのまま FT し Ph0=180, Ph1=- 360 で補正する 2. インターフェログラムを 1 点だけ右にシフトさせ最初の点を backward- LP する 3. 最初の点を 0 として FT し 0 次ベースライン補正する nmrpipe - fn LP nmrpipe - fn ZF - pad 1 nmrpipe - fn RS - rs 1 - sw nmrpipe - fn SP - off end pow 2 - c 1.0 nmrpipe - fn ZF - size 256 nmrpipe - fn FT nmrpipe - fn PS - p p di nmrpipe - fn POLY - auto - ord 0

49 本当はここが t 1 2 個目の点

50 分解能とスペクトル幅の関係 acquisition time = point number spectral width = 1 resolution 1 / スペクトル幅観測時間

51 0- fill は線幅を変えずにギザギザを無くす安全 1 / スペクトル幅 = 0.01 秒一方 LP は FID の未来を予測して伸ばし線幅を細くする観測時間 = 0.01 秒 x32 = 0.32 秒 0- fill 無し 256 まで 0- fill

52 オーバーサンプリングデジタルフィルター CD プレーヤーの宣伝文章より新開発の 16 ビット 4 倍オーバーサンプリング LSI を投入しており 176.4kHz で動作することで 4 倍オーバーサンプリング方式本来の優れた位相特性と通過帯域 30kHz に及ぶ高い過渡応答特性を得ています 20 ビット 8 倍オーバーサンプリングデジタルフィルター採用低レベルでの徹底した音質の向上を図るためエンファシス演算精度度を改善したデジタルフィルターを採用さらに正確な再生を可能にするとともにデジタル段階で出力力レベルを 12 段階まできめ細かくコントロール出力力レベルでの音質劣劣化が無く鮮やかな響きを実現します N 倍オーバーサンプリング通常よりも N 倍速く ( 短い間隔で ) 検出する

53 観測時間 = 0.01 秒 x 32 = 0.32 秒 100 Hz 4 倍オーバーサンプリング観測時間 = 秒 x 128 = 0.32 秒 400 Hz

54 N 倍オーバーサンプリング通常よりも N 倍速く ( 短い Δt 間隔で ) 検出するスペクトル幅が N 倍に広がるノイズを分散できる折り返しが起こらないように高周波数側と低周波数側を削らないといけないがスペクトル幅が広いので無理理の無いフィルターをかけられる

55 デジタルフィルター FID データを一つずつずらしながら重みをかけて足し算し平均値を求める data (i) data (i- 1) data (i- 2) data (i- 3) data (i- 4) a b c d e 重み平均値波形が滑滑らかになる効果 = 高周波数を削る効果 low- pass filter

56 共分散 Covariance NMR フーリエ変換共分散 k = 1..N 1 t 1 = k Δt 1 i=j の時を分散とよぶその平方根が標準偏差となる Brüschweiler, R. et al. (2004) J.Chem.Phys 120, 5253.

57 低分解能スペクトル共分散による高分解能化スペクトル k ω 1 l l ω 2 k ω 2 ω 1 軸に対してではなく t 1 軸に対しても可能スペクトル ( 行行列列 ) の平方根が必要 l k

58 1H indirect (ppm) 二次元スペクトルにおいては ω1 軸の分解能は covariance によりかなり上がる 1H direct (ppm) 3087 ω2 200* t1 FT) 1H direct (ppm) 3087 ω2 200* t1 covariance)

59 溶媒の大きなピークの裾野でベースラインが上下してしまう

60 FT の後に 5.5~ 12.0 ppm で多項式補正 ( 次数 : 3) をかけてみた

61 FT の後に 5.5~ 16.0 ppm で多項式補正 ( 次数 : 3, 5) をかけてみた 12~ 16 ppm のように flat な領領域が長すぎると多項式における高次の寄与が小さくなってしまうのだろうか? 一方の端だけ極端に曲がるようなベースラインの補正が苦手

62 フィルターによる FID 段階での補正 (high- pass filter) 12~ 16 ppm のように flat な領領域が長すぎると多項式における高次の寄与が小さくなってしまうのだろうか? FID 信号強度度フィルター畳み込み積分 (convolution) = 4.4 相加平均低周波数成分 ( 溶媒 ) 高周波数成分 ( 溶質 )

63 FID にガウシアンフィルター (qfil, 1ppm) をかけてみた FID を補正して溶媒ピークを消した場合にはベースラインが少し歪む

64 さらに 5.5~ 12.0 ppm で多項式補正 ( 次数 : 5) をかけてみたベースライン補正をかけた領領域の中では横線が消えた間接測定軸に LP をかけたい場合には FID にベースライン補正をしない方がよいのでは? インターフェログラムを不不規則に加工してしまうから

65 直接測定 (FID) 軸のベースライン補正 FID 軸のフーリエ変換の後最初にスペクトルの両端を少しずつ切切っておく ( その後の FT 用の時間を節約するため ) 両端はデジタルフィルターの影響で変な曲がり方を示すことが多いそして全ての間接測定軸をフーリエ変換した後に直接測定軸のベースラインを溶媒から片方ずつ補正し最後に見見たい箇所の周波数幅になるように切切りとるこちらを選ぶ方がよいかも ( 特に NUS では )

66 デジタルフィルターによる影響を conversion の段階で補正したしかしその補正が完璧ではないためスペクトルの両端が少し歪むデジタルフィルターによる影響を conversion の段階で補正しなかった補正はフーリエ変換の時に行行われるので FID の時点では最初の数十点が変しかしこの方がベースラインがフラットになる

67 デジタルフィルターによってスペクトルの両端が少し歪んでいるこれにベースライン補正を施してしまうとしばしば失敗する FT の最中に補正する方がきれい

68 間接測定軸の位相補正きっちりと 90, (0, 0) 補正をしたとしても少しだけ位相がずれることがあるこれはパルスでパワーを変えた場合などに起こるつまり 90 パルスと 180 パルスの間で位相が数度度ずれているのであるしかたがないので ph0 で補正するのであるがミラーイメージの Linear- prediction をかける場合インターフェログラムの段階で位相を補正しておきその後に linear- prediction をかけないといけない位相がずれたままだとミラーイメージが崩れるためあるいは Q5(90 ) や Q3(180 ) を打った時の磁化ベクトルの挙動が理理想的ではないため x/y x? x T + t 1 /2 T - t 1 /2

69 間接測定軸の位相補正 Bloch- Siegert 効果がのっても ph0 の位相を調整することで補正はできるところがそれでも ph1 の助けが必要になる場合は delay の設定が間違えている可能性がある x/y x t 1 t 1 の初期値として (90 パルス幅 ) (2/π) 2 本分がかかってくるしまった! と思っても慌てずに 0 次の位相補正 : - (ph1)/2 1 次の位相補正 : 360 * (t 1 の初期値 )/Δt 1 折り返ったピークの位相がずれることとほんの少しのベースラインの歪みだけの犠牲ですむなお shaped- pulse の場合にはシミュレータを使う

70 スペクトルが逆さまの時の処理理 x/y t 1 x 上下 ( 左右 ) が逆になる x t 1 x/y x/y T t 1 2 T + t 1 2 x

71 次元の周波数を逆転する操作を行行うと nmrpipe - fn REV - sw 画像が上下で入れ替わったが 15 N の周波数の上限と下限も変化してしまった

72 次元の周波数を正確に逆転する操作を行行うと nmrpipe - fn FT - neg 正確に周波数を逆転させた結果は単なる画像の上下 ( 左右 ) 入れ替えではない

73 偶数のデジタルが原因測定時に設定したはずの周波数周波数そのものがずれてしまった

74 本当に正確に逆転させるには折り返し測定時に設定した周波数上限と下限値も測定時の設定と同じ

75 周波数を逆転させるにはフーリエ変換での符号を逆転させる exp iωt ( ) = cos ωt ( ) + i sin ωt ( ) exp iωt ( ) = cos ωt ( ) + i sin ωt ( ) = cos ωt ( ) i sin ωt ( ) R cos( ωt) sin( ωt) R cos( ωt) sin( ωt) I I

76 普通の測定 t 1 (150*) NUS 測定 (t 1 1/4) Iterative Shrinkage Thresholding (IST 近接勾配法 ) NMRPipe, Dr. Frank Delaglio

77 与えられた 2 つの方程式だけから 3 つの変数 (x, y, z) を求められるか? 周波数軸スペクトル (x, y, z の 3 点が相当 ) 4, 5, 3 などが逆フーリエ変換の法則に相当 4x + 5y 8z = -3 3x - 3y 2z = 8 NUS 時間軸データ (1 点を skip して - 3, +8 の 2 点のみをサンプリング観測 ) 普通ならばいろいろな x, y, z の組み合わせが出てきてしまうがもし x, y, z のうち少なくとも 1 つが 0 だと決めると解けるかもしれない ( どれが 0 かは事前に分からないが ) あるいは x, y, z の絶対値の合計ができるだけ小さくなるような ( ノルム 1 を小さくする ) 組み合わせを選ぶのでも可能かもしれないこれは時間軸と周波数軸の間の関係をできるだけ矛盾させないで ( 最小自乗法ノルム 2 を小さくする ) 周波数軸スペクトルをできるだけ簡単にする ( 最大エントロピー法 ) ことに相当する水の中に落落としたインク滴が広がるように ( 自然のエントロピーは放っておくと増える向きに進む ) スペクトルをできるだけ滑滑らかにするという制限を加えることによってこの方程式をなんとか解く

78 まとめ PC が苦労すればするほど計算するやりがいが出るものである PC の速度度があまりに速くなり過ぎてしまったので FT をしても得られる感動が少なくなってしまったもっとスペクトルをきれいにしようと思う闘志が湧いてこない今後はプロセスに一週間ほどかかるような 4 次元 NUS の方がよいかもしれない NUS は非線形的であるのでしばしば期待を裏裏切切ってくれるよって闘志を再燃できるかもそれに対して線形計算である FT は経験を積めば結果が予想できてしまうので ( 従順すぎ ) そろそろ卒業

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NMR_wakate_ ppt NMR 基礎講義 & 2 第 0 回若手 NMR 研究会 2009 年 9 月 4 日 ( 金 )-6 日 ( 日 ) IPC 生産性国際交流センター ( 湘南国際村 ) 大阪大学蛋白質研究所構造プロテオミクス研究系池上貴久化学シフトの直積演算子 (product-operator) I " I cos (#t) + I sin (#t) x x y ω : 角速度 (rad/s) z 一周の長さ